（分析化学专业论文）微型电化学传感器的研究及其在细胞分析中的应用.pdf

学位论文独创性声明 本人所呈交的学位论文是我在导师的指导下进行的研究工作及取得的研究 成果据我所知，除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含其他个人已经 发表或撰写过的研究成果对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均己在 文中作了明确说明并表示谢意。 作者签名 学位论文使用授权声明 e 1 期：棚弓 本人完全了解华东师范大学有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保 留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电子版和纸质版。有权 将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进入学校图书馆被查阅。有 权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索。有权将学位论文的标题和摘要 汇编出版。保密的学位论文在解密后适用本规定。 学位论文作者签名卑氏 日期：如3 q - - - ， 锄摊：多季l e t 期：k l f 微型电化学传感器的研究及其在细胞分析中的应用一论文摘要 微型电化学传感器的研究及其在细胞分析中的应用 摘要 细胞是组成生物机体的基本结构和功能的单位。初期的细胞学是以研究细胞 的形态和结构为主要内容。最近几十年，随着现代科学技术，特别是由于分子生 物学的发展，使细胞学的研究内容焕然一新，对于细胞的研究已逐渐发展成为一 门研究细胞显微结构和超微结构化学组成的科学；生命活动的一些基本过程如物 质代谢、运动、发育、繁殖以及遗传等重要机制，正在细胞水平上进行日益深入 地研究。同时，现代细胞化学技术又吸引了多学科的先进技术，更深入地阐明了 细胞的增殖与分化、遗传与变异，为疾病的病理和病因提供科学依据。目前，细 胞学已逐渐发展成为从显微水平、亚显微水平和分子水平三个层次上深入探讨细 胞生命活动的学科。 细胞的分析研究已经成为分析化学前沿学科领域中的热门话题，研究细胞化 学不仅有利于确定细胞功能和代谢及细胞内的化学成分，而且还有利于确定细胞 特征，进行疾病的病理和有关药理的机制研究。目前，细胞生物学、分子生物学 等生命科学前沿学科向分析化学提出的课题集中在多肽、蛋白质、核酸等生物大 分子分析以及生物药物分析和超痕量、超微量生物活性物质，如单个细胞内生物 物质的分析。在生物无机分析领域中，痕量元素分析已集中到元素在生物组织层、 单个细胞甚至细胞膜中的微分布及其结合形式等方面。使用超微量样品的微痕量 分析，检测限达到龟级水平。 生物现象最基本的过程是电荷运动，人体运动、大脑信息传递及细胞膜的结 构与功能机制都涉及到电化学过程，可以说，电化学是生命科学的基础学科。热 点研究领域之一生物电分析化学便是建立在电分析化学、生物物理学、生物 化学、电生物物理学、电生理以及电化学等数门学科基础上的独立学科。在电化 华东师范大学申请博士学位论文 第1 页 微型电化学传感器的研究及其在细胞分析中的应用一论文摘要 学的基本原理和实验方法基础之上，生物电分析化学已经迅速发展成为研究和探 讨生命现象本质的最合适、最有力的工具之一。 本论文创新性地以多种灵敏度高、选择性好的微型电化学修饰传感器，对细 胞损伤和修复过程中胞内外的多种生命活性物质的水平变化进行了研究。以心肌 细胞、内皮细胞、平滑肌细胞等心血管细胞为研究对象，以酶、纳米材料等为修 饰剂，研制了多种用于监测细胞内外n o 、次黄嘌呤、细胞色素c 及超氧阴离子 自由基的微型传感器，对细胞损伤及给药修复后的信息物质的水平变化进行了深 入研究，建立了细胞实时在线监测的新方法。因此，本论文不仅拓展了电分析化 学的研究领域，对促进细胞生物学和l 临床科学的发展具有比较重要的理论意义和 科学价值，同时在开发治疗心脏病等心血管疾病药物方面也具有广泛的应用前 景。 第一章：序言 本章对研究细胞的传统生物技术方法、分析化学在细胞研究中的应用以及 生物体中信息物质及检测技术研究进展等方面进行了比较详尽的综述，着重综述 了毛细管电泳( c e ) 分析法、微柱分离法、微电极电化学法在细胞分析中的应用， 同时对细胞中重要的信息分子，包括：一氧化氮、超氧阴离子、嘌呤碱以及细胞 色素c 的性质、生物合成及生理作用、生理功能进行了阐述。讨论了开展本论 文研究的目的和意义并归纳了本论文研究的创新之处。 第二章：一氧化氮微型传感器的研制及其应用于细胞分析的研究 n o 是神经、心血管系统细胞间信息传递的重要调节因子，作为第二信使和 神经传递物质而起着不同的功能，同时还是宿主免疫反应中的一种细胞毒性因 子：作为内皮舒张因子( e d r f ) ，n o 可以释放到相邻的平滑肌，使血管舒张； n o 也可以扩散到血流中抑制血小板的凝聚。由于n o 在神经生理、免疫、病理 华东师范大学申请博士学位论文 第2 页 微型电化学传感器的研究及其在细胞分析中的应用一论文摘要 及药理等方面的研究都具有极为重要的作用，实现n o 的直接实时测定，成为进 一步探索n o 功能的必要手段。但由于生物体内n o 易逸、不稳定，且浓度极低， 实时测定尤为困难。微电极电化学法具有电极探头微小、响应快速、灵敏、选择 性好等特点，非常适用于n o 的实时动态检测。本论文制备了一种新型的 n a f i o n a u 溶胶修饰微铂传感器，对n o 有较高的灵敏度和良好的选择性，检测 限为5 o 1 0 一m o l l 。本论文还探讨了该修饰微传感器对n o 的催化氧化机理， 并以该微传感器为工作电极组成三电极系统，研究了在l 一精氨酸( l a r g ) 和乙 酰胆碱( a c h ) 及黄酮类药物刺激下平滑肌细胞内的n o 释放，以及在l a r g 、 a c h 刺激下心肌细胞内的n o 释放。拓展了n o 的检测方法，具有广阔的应用前 景，并对生理、病理、临床医学研究都具有重要的价值。 第三章：超氧阴离子自由基微传感器的研制及在内皮细胞研究中的应用 近年来，超氧阴离子在心肌缺血和再灌注损伤研究中受到广泛关注。在缺血 一再灌注损伤部位，自由基形成增多，其强烈的氧化作用引起血管内皮细胞和组 织细胞的损伤，导致器官功能障碍。由于0 2 具有强氧化性、半衰期短、且生物 体内的浓度较低( 约为l o - 5 l 鸪一，i ，) 冬精岚实现实时动态分析必须发展高灵敏度、 高选择性、可靠性好及响应快速的检测技术。微屯极电化学方法有诸如可直接测 定、高灵敏度、适用活体分析等优点。目前报道较多的是将超氧化物歧化酶( s o d ) 固定在电极上制作成酶电极，它具有高选择性和较好的灵敏度，但酶电极最大的 缺点是活性易流失，使用寿命短。我们制作了一种新型超氧阴离子自由基微传感 器，无需s o d 即可在传感器表面直接电还原测定超氧阴离子自由基，并将其应 用于检测内皮细胞缺血状态下超氧阴离子自由基的释放水平，为从细胞水平对病 理过程的研究提供了有利手段。 第四章：心肌细胞损伤与修复过程中嘌呤碱水平变化的研究 冠心病广泛发生于世界各地，在我国人口死亡原因中占第二位。其基本病理 华东师范大学申请博士学位论文 第3 页 微型电化学传感器的研究及其在细胞分析中的应用一论文摘要 生理过程是心肌缺血。心肌缺血导致a t p 生成减少，同时，能量的消耗仍然在 进行，a t p 被依次降解成最终产物次黄嘌呤，并聚集在体内。因此，许多研究中 以次黄嘌呤浓度作为衡量人体某些病理过程的重要参数。在生物研究中，次黄嘌 呤的测定通常采用化学发光法，但由于不能做到实时在体测定，在应用上受到很 大限制。本章从两个方面开展了心肌细胞损伤与修复过程中嘌呤碱水平变化的电 化学研究： ( 1 ) ：金溶胶、黄嘌呤氧化酶及n a t i o n 修饰微型传感器的研制及其应用于心 肌细胞中黄嘌呤的检测：基于酶固定化修饰的电化学生物微传感器可以实现对生 物物质的高效、高选择性的在体实时检测，因而成为近年来最活跃的研究领域之 一。本论文成功地将金溶胶、黄嘌呤氧化酶及n a t i o n 依次修饰在微铂电极表面， 研制成了一种新型的次黄嘌呤( h x ) 微生物传感器。该微传感器响应快速、灵敏， 对h x 具有良好的催化氧化性能。本论文还以该修饰微传感器为工作电极，研究 了在l - 精氨酸( l - a r g ) 和乙酰胆碱( a c h ) 的刺激下一t l , 肌细胞中次黄嘌呤的释 放过程，对心脏病的生理、病理、临床医学的研究都具有重要的价值。 ( 2 ) ：本节我们采用毛细管电泳电化学检测方法研究了心肌细胞正常和损伤 过程中嘌呤碱以及在细胞给药修复后的嘌呤碱的变化情况。以直径为3 0 0b t m 的 碳圆盘电极为工作电极，铂电极为辅助电极，a g a g c i ( 3 0m o l l 。1 k c i ) 为参比电 极，检测电位为1 0 5 v ，在2 0m m 0 1 l 1 磷酸盐缓冲体系中( p i q1 0 5 ) ，细胞间质 中的次黄嘌呤、黄嘌呤和尿酸在8m i n 内分离完全。峰电流与被测物浓度在两个 数量级范围内呈良好的线性关系f 相关系数r 0 9 9 9 4 ) 。文中同时研究了工作电位、 缓冲液酸度和浓度、分离电压及进样时间等对电泳的影响。初步探讨了嘌呤碱在 细胞损伤过程中的变化情况，同时对黄酮类中药对细胞损伤后的修复作用也进行 了研究，获得了满意的结果。 以上实验表明我们研制的微型电化学传感器由于修饰了纳米金溶胶和酶，因 此具有较高的灵敏度和良好的选择性，可以对心肌细胞损伤过程中次黄嘌呤的释 放进行直接检测。 华东师范大学申请博士学位论文 第4 页 微型电化学传感器的研究及其在细胞分析中的应用一论文摘要 第五章7 , - - 胺a u i 复合物修饰微型传感器及其在细胞色素c 测定中的研究 细胞色素c 是以铁卟啉为辅基的蛋白质，在呼吸链中依靠铁的化合价变化 而进行电子的传递，它几乎存在于所有的原核生物和真核生物之中。细胞色素c 在抗氧化防御、细胞凋亡过程中起着非常重要的作用。在研究细胞凋亡过程的病 理学、药理学以及线粒体变化的过程中，寻求适当的手段来监测线粒体释放出来 的细胞色素c 对于研究细胞凋亡的机理具有重要意义。本论文报道了一种采用纳 米材料制备修饰电极的新方法，制作了乙二胺a u 溶胶i ( e d a u f ) 复合物修 饰的碳纤维微柱电极，并研究了该电极的电化学行为。实验结果表明，该微电极 对细胞色素c 具有良好的催化还原特性，在6 5 1 0 7 m o l l 1 2 x 1 0 4 m o l l 浓度范 围内，还原峰电流与细胞色素c 浓度呈现良好的线性，检测限为3 2 x 1 0 m o l l ； 同时，该微电极具有选择性高，体积小和稳定性好等特点，适用于生命科学的研 究，为细胞凋亡的病理、药理研究提供了新的手段和方法。 华东师范大学申请博士学位论文 第5 页 微型电化学传感器的研究及其在细胞分析中的应用一论文摘要 s t u d y o ne l e c t r o c h e m i c a lm i c r o s e n s o ra n di t s a p p l i c a t i o n t o w a r dc e l l s a n a l y s i s a b s t r a c t s l i v i n gb e i n g sw e r ec o n s t r u c t e dw i t hs o m es i n g l ec e l l s ，a n ds u b s t a n c e si n s i d ea r e m o s ti m p o r t a n tt oc e l l s s u r v i v i n g ，r e p r o d u c e ，d a m a g e ，a n dd e a t h t h e r e f o r e ，s t u d i e s u p o nf u n c t i o n so fo 玛a n i s m sf r o ms i n g l ec e l l sl e v e la n dm o l e c u l e sl e v e l ，a r es p o t l i g h t a n ds i g n i f i c a n ti np r e s e n td a y s c u l t u r e dc e l l sk e p tu ps o m ec h a r a c t e r i s t i c so f t i s s u e t h em o d e lo fc e l l si n h y p o g l y c e m i aa n dh y p o x i ac a nm i m i ct h em o r b i ds t a t eo f i n t r a c o r p o r a lt i s s u eo ro r g a n si nt h ea b s e n c eo f o t h e rs p e c i e s ，s u c ha sn e u t r o p h i l sa n d n e r v e c o r p u s c l e s i no r d e rt of i g h tf o rm y o c a r d i a li s c h e m i cn e c r o s i sa n dp r o t e c t m y o c a r d i u m ，l o t so fm o d e ls t u d i e sw e r ep e r f o r m e df o rm e c h a n i s mr e s e a r c h i nt h i s p a p e r , t h r e ep a r t so f w o r kh a v e b e e n p e r f o r m e d i nt h et h e s i sf o l l o w i n ga no v e r a l lr e v i e w ： c h a p t e r 0 n e ：c r i t i e a lr e v i e w s ac r i t i c a lr e v i e ww i t hr e g a r dt ot h ec e l l sa s s a y i n gw a s p r e s e n t e d ，i n c l u d i n gt h e s t u d y o f c e l lw i t ht r a d i t i o n a lm e t h o d s ，a p p l i c a t i o no f a n a l y t i c a lc h e m i s t r yt o w a r d sc e l l a n a l y s i s ，t h ed e v e l o p m e n to fd e t e c t i o nt e c h n o l o g yf o rm e s s e n g e r so fb i o l o g i c a l s y s t e r m ，e s p e c i a l l y , t h ec e ，m i c r o c o l u m ns e p a r a t i o n ，m i c r o e l e c t r o d e s i na d d i t i o n ， t h ec h a r a c t e r i s t i c ，b i o s y n t h e s i sa n d b i o l o g i c a lf u n c t i o n so f s o m ei m p o a a n t m e s s e n g e r m o l e c u l a r ，s u c ha s ，m t n co x i d e ，s u p e r o x i d e ，p u n n ea n dc y tcw a sa l s or e v i e w e d c h a p t e rt w o ：p r e p a r a t i o no f n i t r i co x i d em i e r o s e n s o ra n di t sa p p l i c a t i o n t o w a r d sc e l l sa n a l y s i s t h ea i mo ft h i sw o r kw a st of a b r i c a t em i c r o e l e c t r o d e sa sac u r r e n ta p p r o a c hf o rt h e i ns i t um o n i t o r i n go fn i t r i co x i d er e l e a s ef r o ml i v i n gc e l l ss t i m u l a t e d b ys o m ee x o g e n i c a g o n i s t s f o rt h ep u r p o s e ，an o v e ls e n s i t i v e ，s e l e c t i v ea n ds t a b l en i t r i co x i d e ( n o ) m i c r o s e n s o ri s c o n s t r u c t e d ，w h i c hi s m o d i f i e db yn a n oa uc o l l o i da n dn a t i o n d e t e r m i n i n gb ya t o m i cf o r c e dm i c r o s c o p e ，t h ed i a m e t e ro f a uc o l l o i dp a r t i c l e si sf i o m 7t o1 4n a n o m e t e r s t h ed e t e c t i o no f n oi sb a s e do nt h en a n oa u p a r t i c l e sc a t a l y s i so f 华东师范大学申请博士学位论文 第6 页 微型电化学传感器的研究及其在细胞分析中的应用一论文摘要 n oo x i d a t i o na ta na n o d i cp o t e n t i a lo f + o 7 4 vr v s s c e ) t h em i c r o s e n s o rs h o w e da l o wd e t e c t i o nl i m i t ，h i 曲s e l e c t i v i t ya n ds e n s i t i v i t yf o rn od e t e r m i n a t i o n t h eo x i d a t i o n c u r r e n t ( m e a s u r e db yd i f f e r e n t i a lp u l s ea m p e r o m e t r i ct e c h n i q u e ) w a sl i n e a rw i t hn o c o n c e n t r a t i o nr a n g i n gf r o m1 0 x 1 0 7t o4 0 x 1 0 一m o l lw i t hac a l c u l a t e dd e t e c t i o nl i n u to f 5 0 x l 旷m o l l ( s n = 3 ) u s i n gt h em i c r o s e n s o r , t h ed i r e c t ，r e a lt i m ep r o d u c t i o no f n o i n t h es m o o t hm u s c l ec e l l sa n d m y o c a r d i a lc e l l s w a s c o n t i n u o u s l y m e a s u r e d c h a p t e r t h r e e ：f a b r i e a t i o no f s u p e r o x i d em i c r o s e n s o r sa n d i t sa p p l i c a t i o n t o w a r de n d o t h e l i a ic e l l s an o v e ls u p e r o x i d em i c r o s e n s o r sb a s e do np l a t i n u m p a l l a d i u m m i c r o p a r t i c l e sa n d e l e c t r o p o l y m e r i z e dp y r r o l e w a sf a b r i c a t e df o rt h em e a s u r e m e n to fe x t r a c e l l u t a r e n d o t h e l i a lc e i l ss u p e r o x i d e t h ep t p d p p ym o d i f i e dm i c r o s e n s o r sw e r ee v a l u a t e da s s u p e r o x i d es e n s o et h ea m p e r o m e t r i cr e s p o n s e st os u p e r o x i d ew e r em o n i t o r e da tt h e p o t e n t i a l o f 0 0 0 v ( v ss c e ) i nh b s s t h e s e n s o rw a s p r o v e d t oh a v ea h i 。g hs e n s i t i v i t y , s e l e c t i v i t ya n ds h o r tr e s p o n s et i m e t h ed e t e c t i o nl i m i ti s1 2n m o l l ( s i n = 3 ) t h el i f e p e r i o d ( a tl e a s t 1 m o n t h ) o fs e n s o r si sl o n g e rt h a nt h a to fe n z y m ee l e c t r o d e s t h e p o t e n t i a l i n t e r f e r e n c ef r o ms o m ee n d o g e n o u se l e c t r o a c t i v es u b s t a n c e si n b i o l o g i c a l s y s t e m ，s u c h a s h 2 0 2 ，u a ，n e u r o t r a n s m i t t e r s a n dt h e i r m e t a b o l i t e s ，a t t h e c o n c e n t r a t i o n sh i 曲e rt h a nt h o s ei nb i o l o g i c a ls y s t e m ，c o u l db ee l i m i n a t e db yf u r t h e r c o a t i n gt h e p t p dm o d i f i e de l e c t r o d ew i t ha p o l yp y r r o l ef i l m t h em e t h o d w a s a p p l i e d t ot h em e a s u r e m e n to f s u p e r o x i d ep r o d u c t i o ni ne n d o t h e l i a lc e l l s c h a p t e rf o u r ：s t u d y o nt h ec h a n g eo fp u r i n d u r i n g t h ep r o c e s so f i n j u r ya n d r e s p a i r a t i o no fm y o c a r d i a l c e l l s ( 1 ) ：an o v e lh y p o x a n t h i n e ( h x ) m i c r o s e n s o rw a sc o n s t r u c t e d i nt h i sw o r k ， n a f i o nx a n t h i n eo x i d a s ea n da uc o l l o i dw e r ei m m o b i l i z e do nt h es u r f a c eo fp t m i c r o e l e c t r o d e ，r e s p e c t i v e l y t h ee n z y m eb i o s e n s o rd i s p l a y e daq u i c ka n ds e n s i t i v e r e s p o n s et oh x i np h y s i o l o g i c a lc o n d i t i o n ，t h eb i o s e n s o rs h o w e dal o wd e t e c t i o n l i m i t ，h i 曲s e l e c t i v i t ya n ds e n s i t i v i t yf o r h xd e t e r m i n a t i o n t h eo x i d a t i o nc u r r e n t ( m e a s u r e db yi - t ) w a sl i n e a rw i t hh xc o n c e n t r a t i o nr a n g i n gf r o m2 0 x1 0 。t o2 0 x1 0 。3 华东师范大学申请博士学位论文 第7 页 堕型皇堡兰堡壁壁塑翌塑丝壅垄墅堕坌塑! 塑查旦二堡兰垫茎 m 0 1l 1w i t hac a l c u l a t e dd e t e c t i o nl i m i to f1 0 10 。m o ll ( s no f3 ) t h e b i o s e n s o r s h o u l db ep r o m i s i n gf o ri nv i v om e a s u r e m e n to f h xw i t h o u ti n t e r f e r e n c ea n df o a l i n g t h ec h a n g eo fh xc o n c e n t r a t i o ni nm y o c y t e sc a r d i a cs t i m u l a t e db yl a r ga n da c h w a sa l s os t u d l e d ( 2 ) ：t h em a j o rp a t h w a yo fp u f i n en u c l e o t i d ea n dd e o x y n u c l o t i d em a t a b o l i s mi n a n i m a l si n v o l v e ss e v e r a li n t e r m e d i a t e sa n de n d sw i t hu r i ca c i d ( u a ) b e i n gt h e p r e c u r s o r so f u a a 5w e l la st h ei n t e r m e d i a t e si np u r i n eb i o s y n t h e s i s ，t h em e a s u r e m e n t o fh y p o x a n t h i n e ( h x ) a n dx a n t h i n e ( x ) i si m p o r t a n ti nb i o c h e m i c a la n dc l i n i c a l d i a g n o s i s ，s i m u l t a n e o u s d e t e r m i n a t i o n so fp u r i n eb a s e so fh y p o x a n t h i n e ( h x ) ， x a n t h i n e ( x ) ，a n du r i ca c i d ( u a ) w i t h c e a dw e r ed e m o n s t r a t e d t h ee x p e r i m e n t a l p a r a m e t e r sw e r es y s t e m a t i c a l l yo p t i m i z e df o re a c ha n a l y t eo fh x ，xa n du a t h e c a l i b r a t i o nc u r v e sw e r ea l ll i n e a ri nt h er a n g eo f1 0 x 1 0 4 - 2 o x l o m 0 1 l 1 w i t h d e t e c t i o nl i m i t s ( s n = 3 ) o f5 0 x 1 0 ，3 0 x 1 0 ，4 0 x 1 0 6 t o o l t l - 1 ，r e s p e c t i v e l y , t h i s m e t h o dw a sa p p l i e dt os i m u l t a n e o u sd e t e r m i n a t i o no fh x xa n du ai ni n j u r ya n d r e c o v e r ym y o c a r d i a lc e l l s t h ef u n c t i o n o f t h ef a v o i dw a sa l s os t u d i e di nt h i sp a p e r c h a p t e rf i v e ：f a b r i c a t i o n o f e d a u 1 m o d i f i e dm i c r o s e n s o ra n da p p l i c a t i o n t o w a r d sc y tc a n a l y s i s an o v e lc h e m i c a l l ym o d i f i e dm i c r o e l e c t r o d ei sd e s c r i b e df o rt h ed e t e c t i o no f c y t o c h r o m cci nt h i sp a p e r , f i r s t l y , e t h i d e n ed i a m i n e ( e d ) w a se l e c t r o p o l y m e r i z e do n t h es u r f a c eo f c a r b o nf i b e rm i c r o e l e c t r o d e ( c f m e ) ，a n dt h e ng o l dc o l l o i dl l a n op a r t i c l e s w a s d e p o s i t e do n t h es u r f a c e ( a u e d c f m e ) + a tl a s t ，w ed i p p e dt h ea u e d c f m ei n t o t h ep o t a s s i u mi o d i d es o l u t i o na n dt h e nt h ei o d i d ei o nw a sa b s o r b e do n t ot h es u r f a c eo f a u e d c f m e t h ee l e c t r o c h e m i c a l b e h a v i o ro ft h e p r e p a r e d m o d i f i e d i a u e d c f m ew a ss t u d i e d t h ec h e m i c a l l ym o d i f i e dc f m e ，w h i c hw a su s e da s w o r k i n ge l e c t r o d e ，h a sg o o de l e c t r o c a t a y t i c a l r e d u c t i o no fc y t o c h r o m ecw i t ha d e t e c t i o nl i m i to f1 o x l o m o l la n dal i n e a rc o n c e n t r a t i o nr a n g eo f 6 ，5 1 0 - 7 1 2 x 1 0 5 m o l l ( v sa g a g c l ) w et h i n ki th a sg r e a tp o t e n t i a lf o ra p p l i c a t i o nf o ri nv i v os t u d y i n g o f c y t o c h r o m e c 华东师范大学申请博士学位论文 第8 页 微型电化学传感器的研究及其在细胞分析中的应用 第一章综述 细胞是组成生物机体的基本结构和功能的单位。初期的细胞学是以研究细胞 的形态和结构为主要内容。最近几十年，随着现代科学技术如电子显微镜、放射 性同位素、分离细胞结构组分的技术、细胞培养以及其他研究手段和技术的迅速 发展，特别是由于分子生物学的发展，使细胞学的研究内容焕然一新，对于细胞 的研究已逐渐发展成为- - f 7 研究细胞显微结构和超微结构化学组成的科学；生命 活动的一些基本过程如物质代谢、运动、发育、繁殖以及遗传等的重要机制。正 在细胞水平上进行日益深入地研究。同时，现代细胞化学技术又吸引了多学科的 先进技术，更深入地阐明了细胞的增殖与分化、遗传与变异，为疾病的病理和病 因提供科学依据。目前，细胞学已逐渐发展成为从显微水平、亚显微水平和分子 水平三个层次上深入探讨细胞生命活动的学科。 单个细胞的分析研究已经成为分析化学前沿学科领域中的热门话题，研究细 胞不仅有利于确定细胞功能和代谢及细胞内的化学成分，而且还有利于确定细胞 特征，进行疾病的病理和有关药理的机制研究。目前，细胞生物学、分子生物学 等生命科学的前沿学科向分析化学提出的课题集中在多肽、蛋白质、核酸等生物 大分子分析以及生物药物分析和超痕量、超微量生物活性物质，如单个细胞内生 物物质的分析。在生物无机分析领域中，痕量元素分析己集中到元素在生物组织 层、单个细胞甚至细胞膜中的微分布及其结合形式等方面。使用超微量样品的微 痕量分析，检测限达到龟级水平。 生物现象最基本的过程是电荷运动。人体运动、大脑信息传递及细胞膜的结 构与功能机制都涉及到电化学过程，可以说，电化学是生命科学的基础学科。热 点研究领域之一一生物电分析化学便是建立在电分析化学、生物物理学、生物化 学、电生物物理学、电生理以及电化学等数门学科基础上的独立学科。在电化学 的基本原理和实验方法的基础之上，生物电分析化学已经迅速发展成为研究和探 讨生命现象和本质最合适、最有力的工具之一，其研究范围涉及了从生物体和有 机组织的整体水平到分子、细胞水平上的研究，或模拟荷电微粒( 电子、离子或 电活性粒子等) 在生物体系和相应模拟体系中分布、传输、转换、转化的化学本 华东师范大学申请博士学位论文第9 页 壁型皇些兰生壁壁竺堕窒墨茎垄塑堕坌塑主竺生里 质和规律】。 本论文创新性地以多种灵敏度高、选择性好的微型电化学修饰传感器，对细 胞损伤和修复过程中胞内外的多种生命活性物质的水平变化进行了研究。以心肌 细胞、内皮细胞、平滑肌细胞等心血管细胞为研究对象，以酶、纳米材料等为修 饰剂，研制了多种用于监测细胞胞内外n o 、次黄嘌呤、细胞色素c 及超氧阴离 子自由基的微型传感器，对细胞损伤及给药修复后信息物质的水平变化进行了深 入研究，建立了细胞实时在线监测的新方法。因此，本论文不仅拓展了电分析化 学的研究领域，对促进细胞生物学和临床科学的发展具有比较重要的理论意义和 科学价值，同时在开发治疗心脏病等心血管疾病药物方面也具有广泛的应用前 景。 第一节细胞化学研究中传统生物技术方法 细胞化学方法能够对细胞内的各种成分进行定性、定量研究。目前，用细胞 化学技术所能显示的化学成分包括： ( 1 ) 蛋白质：显示某些特定蛋白、某些氨基酸或功能基： ( 2 ) 核酸：核糖核酸( r n a ) 脱氧核糖核酸( d n a ) ： ( 3 ) 糖类：如糖原、粘多糖和糖脂等； ( 4 ) 脂类：如中性脂肪、磷脂和固醇等； ( 5 ) 酶：包括水解酶、氧化酶和激酶、转移酶等； ( 6 ) 生物胺、特异抗原以及铁、铜、锌等无机盐和微量元素等。 应用细胞化学技术显示细胞内化学物质及其定性、定量以及代谢状况，须严 格要求在制备标本过程中做到保持细胞良好的形态结构，保持细胞内化学成分和 酶活性的原有状况并且需要对化学物质进行精确的定性、定量，以便于重复观察。 华东师范大学申请博士学位论文第1 0 页 微型电化学传感器的研究发其在细胞分析中的应用 在众多的细胞化学研究方法中，比较普遍使用的有细胞化学染色法、显微分光光 度法以及电镜免疫化学技术等呻】。 1 1 细跑纯学染色技术 细胞化学染色的原理是细胞中的化学成分和其相应的底物呈一系列的化学反 应，形成于显微镜下可见的反应产物，同时要求组织细胞的结构成分不遭到破坏。 成功的细胞化学染色包括由金属金属盐法、偶氮偶联法、色素形成法、底物荧 光法以及免疫荧光法等方法。 金属一金属盐沉淀法是利用金、银、铜、铁、铝、钴等金属化合物在与细胞 化学成分反应过程中生成有色沉淀，借以辨认所检查的物质例如酶的活性，由此 捕捉酶反应的分解产物，使其与金属结合，呈有色反应，从而标出酶的所在部位， 即可确定某种酶的存在。 该种方法是指用人工合成的酶底物，在酶的作用下产生分解产物，后者与 重氮盐结合，引起偶氮偶联反应，从而形成不溶性的偶氮色素。 细胞内的多糖、粘多糖、粘蛋白都用此法来显示，其原理是细胞中多糖放出 的醛基和s c h i f f 试剂中的无色品红转变为紫红色化合物而被显微镜观察到。这种 反应多用于显示细胞中的糖类和细胞核内的d n a ，前者称为p a s 反应，后者称 为f e u l g e n 反应。此类方法还可以用于检查细胞中的粘蛋白和不饱和脂类。 1 1 4 联苯胺法反应显示过氧化酶 华东师范大学申请博士学位论文第1 1 页 微型电化学传感器的研究及其在细胞分析中的应用 联苯胺反应的原理是h 2 0 ：产生新生氧，后者再将无色联苯胺氧化生成联苯 胺蓝，进而变成黑色化合物。此法主要显示细胞中的过氧化酶。 色素形成法是一组显示酶定位的常用方法，其原理是在酶的作用下，使无色 的化学物质在细胞局部形成色素沉着，以此确定待测酶的存在部位。色素形成法 主要包括四唑盐法、联苯胺色素法、黑色素形成法、靛蓝形成法、白色色素法。 其中四唑盐法用于定性各种氧化还原酶、多种脱氧酶、转移酶。 1 。1 。6 底物标记法原理 底物标记法是指用同位素、色素、金属标记酶的底物。在酶的作用下，底物 分解后沉着于酶所在的部位。最常用的底物标记法为放射自显影术。该研究方法 是7 0 年代后兴起的一种同位素标记技术，其原理是用同位素标记底物，在酶的 作用下，带有标记的分解产物沉着于酶所在的组织结构上，通过放射自显影过程 将沉着于酶所在部位的底物进行捕捉。 除此以外，利用银制作蛋白胶体银，用其作为酶的底物，在蛋白酶的作用下 银与分解产物沉淀于酶所在部位。 1 1 7 荧光染色s 免疫荧光法躁理 荧光染色与免疫荧光方法制备的标本都必须在特殊的荧光显微镜下观察。荧 光染色法是用特定的荧光染料对组织细胞中的化学成分直接染色，在荧光显微镜 下对这些成分进行直接观察。例如吖啶橙可以同时对细胞内的d n a 和r n a 染 色，细胞核内的d n a 呈亮绿色黄绿色荧光，胞质的r n a 呈橘红色荧光。吖啶 橙染色后，癌细胞的d n a 呈黄色荧光，r n a 呈火红色荧光。 免疫荧光方法是把免疫学技术与荧光染色技术结合起来的一种方法，它具有 华东师范大学申请博士学位论文第1 2 页 微型电化学传感器的研究发! 堕胞坌丛! 堕堡旦 免疫学的特异性和荧光方法的敏感性。应用荧光抗体法制成酶荧光抗体，该抗体 作用于组织切片，引起抗原抗体反应，在荧光显微镜下可以清晰地确定该反应在 细胞内的精确定位。目前，用荧光免疫法所能证实的复凝胶蛋白酶、羧基肽酶原、 d n a 酶、r n a 酶、3 磷酸甘油醛脱氢酶、磷酸化酶、淀粉酶以及鸟氨酸转氨酶 等。 1 1 8 酶标抗体法乐理 本方法的特点是用酶代替荧光色素，即先用酶标记抗体球蛋白，通过直接法 和间接法两种方法证明组织细胞的抗原，使用酶多为过氧化物酶和辣根过氧化物 酶。由于酶标抗体法的发明，才使某些激素、免疫物质、其它蛋白性物质在细胞 内定位、定性成为可能。 1 2 显微分光光度法 细胞化学建立开始只能对细胞内的化学成分进行定性定位观察，显微分光光 度计问世之后，则将细胞化学观察提高到定量分析的水平。显微分光光度计已经 广泛地用于生物学和医学各个学科的研究工作，还可以用于壤、地质学、金相 学等方面的研究。 显微分光光度计又名细胞分光光度计，它是一种以物质的分子对光波的选择 性吸收为基础的、在显微镜下对生物样品微细结构中的化学物质进行定量测定的 精密仪器。它对生物