（预防兽医学专业论文）鸡新城疫病毒地方株的分离鉴定及其HN基因的克隆与序列分析.pdf

摘要 在河北保定地区两个鸡场中的发病鸡群中，分离到两株具有血凝性的病毒，经血 凝试验和与多种阳性血清进行血凝抑制试验，确定两株分离株均为新城疫病毒，并分 别表示为h b b 和h b w 。对此两株病毒的毒力进行了鉴定，测定鸡胚最小致死量平 均死亡时间( m d t ) 分别为4 0 8 h 和5 3 7 h ：l 闩龄雏鸡脑内接种致病指数( i c p i ) 分 别为1 9 3 和1 8 6 ；6 周龄鸡静脉内接种致病指数( i v p l ) 分别为2 8 9 和2 7 2 ，结果 表明：两株n d v 分离株均为新城疫强毒株。 器取1 0 只1 2i = ：= 龄非免疫鸡进行攻毒试验，所有鸡只均在2 4 小时内开始发病， 其中h b b 株在7 2 小时内对试验鸡致死率达1 0 0 ；h b w 株在1 2 0 小时内致死率为 8 0 ；其余试验鸡则出现不可恢复性神经症状。对高母源抗体( h l 效价6 l 0 9 2 ) 雏 鸡进行攻毒试验，h b b 株使试验鸡在1 9 2 小时内全部死亡，致死率为1 0 0 ；h b w 株馒试验鸡在1 9 2 小时内死亡4 只，致死率为4 0 ，其余耐过，均出现不可恢复性神 经症状。结果表明：两株分离株对鸡均有很强的致病性，即使在高母源抗体存在条件 下也能造成很高的发病率和死亡率，同时也证明了目前的传统n d 疫苗已不能有效 保护现在流行强毒株的攻击，所以有必要针对本地区的毒株特点研制新的有效疫苗来 防i 目酶新城疫的流行。 对两株新城疫病毒分离株进行大量增嫡，经透析膜浓缩后以t r n z o l 试剂法提取 病毒r n a ，参考文献报道的一对特异性引物，利用r t - p c r 技术扩增其部分h n 基 因片段，将琼脂耱电泳检测为阳性的r t - p c r 产物，纯化后连接到p b s - t 载体中，经 转化e c 0 1 ij m l 0 9 菌株进行克隆，选择白色阳性克隆菌落进行测序：应用d n a s t a r 软件对上述两株n d v 及国内外已发表新城疫代表株的h n 基因的核苷酸片段及其相 应的氨基酸序列进行比较并建立系统发育树。结果表明：两株病毒分别扩增出8 9 7 b p 的h n 基因片段，编码2 9 9 个氨基酸，两株病毒分离株h n 基因核苷酸序列同源性为 9 9 7 ，氨基酸序列之间的同源性为9 9 1 3 ，两株病毒h n 基因核苷酸与国内外报道 的相关序列同源性为8 2 8 9 3 ，2 ，推导氨基酸序列同源性为9 0 0 9 6 0 ，由系 统发育树可见，本试验研究分离株与现今流行于国内的v i i 型病毒抹有密切联系。 研究中发现h b b 株与h b w 株都属于新城疫病毒强毒株，两株病毒h n 基因核 苷酸之间有很高的同源性，但是h b b 株的毒力和致病性却远大于h b w 株。 关键词：鸡：新城疫病毒；分离；h n 基因；r t _ p c r i s o l a t ：i o n ，l d e n t j n c a t i o no fn e w c a s t l ed i s e a s ev i n i sa n dc l 蛐i n ga n ds e q u e n c i n go fi t s h n g e n e c a n d i d a t e ：“j e f e n g s p e c i a l t y ：p 刚e n 6 v ev e t 嘶n a r ym e d i c i n e a d v i s o 体：p m f b s o ls u nj i g u o r e s e a r c h e lx j ec h u n 缸 a b s t r a c t 1 1 w oi s o 】a t e so f v i m sw h j c hc o u l da 2 一u “n a t ec h i c k e nr e db l o o dc c l lw e r ei s 0 1 a t e df 硒m t w od i s e a s e i n f e c t e dp o u l t r yf a r n l si n b a o d j n go fh 曲e i 1 1 1 e s ea g 目u t j n a t i o n sw e r e i n h i b j t e da n dn e u t r a l i z e db yn e w c a s t 】ed i s e a s ev i n l ss t a n d a r da i l 6 s e m n e s ei s o l a t e sw e r e c o n f j n n e dt ob en e w c a s t l ed i s e a s ev i n 】sb a s e do nh aa n dh lt e s t 觚dw e r en a m 酣b yh b b a n dh b w p a t h o g e 币c i t vo f t h et w ei s o l a t e sw a sj d e n t i f i c a t e d m e a l ld e a t ht i m e ( m d t ) o f c h i c k e ne m b r y o so ff h e s ei s o l a t e sw e r e4 0 _ 8 ，5 3 7 hs 印a r a t e l yi n t r a c e r e b r a lp a t l l o g e l l i c i t y i n d e x( 1 c p i ) o ft h e s ei s o k l t e si n l - d a y o l ds p fd l i c k e n sw e r e1 9 3 ，1 8 6 ，a n d i n t r a c e r e b r a lp a t h o g e n i c i t yi n d e x( 1 v p i ) o ft h e s ei s o l a t e si n6 一w e e k o l ds p fc h i c k e n s w e r e2 8 9a n d2 7 2s 印a r a t e ly t h er e s u i t sd c m o n s t r a t e dt 1 1 a tt h et w oi s o l a t e so f v i m sw e r e h i g hv i n l l e n tn e w c a s l l ed i s e a s e “r u s 1 0 1 2 一d a yc h i c k e n s ，w h i c hw 盯c 肿ti m m u n e db yn d v w e r ec h a l l c l l g e di nt h e e x p e r i m e n t a l lw e r ei n f 碗t e da r e r2 4h o u r s ，o fw h i c hc h a l l c i l g e db yh b bi s 0 1 a t ec a u s c da h i 曲m o r t 枷t yb yio o ；c h i c h e n sc h a j j e n g e db yh b wh a dah i 曲m o r t a i t yb y8 0 ；t h e o m e fh a dan e r v a ls y m p t o mw h i c hw e r en o tr e c a v e lc h i c k e n sw i t hh 1a b o v e6 1 0 2 2 c h a l l e n g e db yh b bi s o l a t ew e r ea 1 1d i c dd u r i n g1 9 2h o u r s ；4c h i c k c n sw i c hh ia b o v e 6 1 0 9 2c h a l l e n g e db yh b w j s 0 1 a t ew e r ed i e dd u r i n g1 9 2h o u r s n er e s u l t si n d i c a t e d ：t h e t w oi s o l a t e sh a v eah i g hv i n l l e n tt oc h i c k e n ，a n dc h i c k sa b o v e6 i o 譬2w 萌它e v e nn o t d r o t e c t e d t h eo t h e rr c s u l ti st l a tv a c c i n eu s e dn o ww e r en o ta v a i l a b i e r i b o n u c l e i ca c i dw e r ee x 昀c t e db vt r n z o lf 确v j r i o n so fn e w c a s t l ed i s e a s ev i m s a n e rp r o p a g a t e da n dc o n d e n s e d t w of o n a r d 埘m e f sw e r cu s c df o r 砌孓p c rs t 印t o 糊p i i 母h 锄a g g i u t i n i n - n e u r a m i n i d a s h n ) g e n eo fm et w on d vs t r a i n s ；t 1 1 ep c r p m d u c t sc h e c k db ya g m s eg e 】e l e c t r o p h o r c s i sw e r ep l m 6 e dd ya g r o s eg e l 行a d i o n m e t h o d ，a i l dd o n e di n t op b s t e a s yv e c t o lc l o n c dp l a s m i d sw e r e 仃a n s f o m l c dj n t oe c o l i j ml0 9 ，柚dp o s 谢v ep l a s m i d sw e r es e l e c t e dt os 。q u e n c i n g a c c o f d i n gt ot h cs t r a i n so ft h e n d v r c p o n e dh o m ea 1 1 da b m a d ，t h ep h y j o g e n e t i ct r e eo ft h cn d va 1 1 dt h ea i l a l y s i so f 目m c t i cv a r i a t i o nw e r eo b t a i n db vd n a s t a rs o f t w a r e t h er e s u l t sd 锄o n s t r a t e dt 1 1 a t ：8 9 7 b p o fm eh ng e n ew a sa l t l p l 涵e ds u c o e s s 如l l y ，t h eh o m o l o g o u sr a t eo fh ng c n en u c l e o t i d e s s e q u e n c c sw a s9 9 7 ，a 1 1 do ft h ed e d u c e da m i n oa c i ds e q u e n c e sw a s9 9 - 3 t h eh ng e n e s e q u e l l c e sf i m mf w oi s o 】a t e ss h a r c dah i 2 hj d e n t i t yb e 似o e n8 2 8 一9 3 2 w i ml h a to f r e l a t e ds o q u e n c e s 聊o n e dh o m ea 1 1 da b r o a d t h e 扪i n oa c i dr e s i c l u e sp r 鲥i c t e d ，s h 删a n i d e i l t i t yb e t w e c f l9 0 o 9 6 0 w i t ht 1 1 a to fo t h e rs 缸甚i n s t h ep h y 王o g e n e t i ct r c es h o w e d t h a tt h et w oi s o l a t e sa n dt l l ee p i d 锄i cs t r a i n s v i ld 锄e s t i cw e r ec l o s e l yr d a t e d s t u d ys h o w c dm a t ：t 1 l ei s o l a l e so fh b ba i l dh b ww e r ea l lb e l o n gt oh i 曲v j n l l e n t s 仃a i n so fn e w c 鹊t l ed i s c a s ev i m s w i mh i 譬l l i d e l l t i t yo fn u c l e o t i d eb e t w e c i lt h e 研o i s o l a t c s ，m eh b bs 廿a i nh a v eah i 曲盯v i r u l c el h 龃l h eh b ws t m i n k e yw o r d s ：p o u l 时；n e w c a s l l ed i s e a s e n l s ：i s o l a t i o n ；h ng e n e ；r t p c r 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论t 文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得塑皇垦壅些盘茔或其他 教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：夸走峰 签字日期：沙蟛年月旧日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解塑i 垦盔些盘鲎有关保留、使用学位论文的规 定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查 阅和借阅。本人授权塑些盎些盘鲎可以将学位论文的全部或部分内容编入有关 数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者躲孕盎峰 签字日期：沙彤年月f 了日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 导师签名：蔚勃参词 签字日期：“年f 月f 矿日 电话： 邮编： 鸡新城疫病毒地方株的分离鉴定及其l n 基因的克隆与序列分析 1 引言 新城疫( n e w c a s t l ed i s e a s e ，n d ) 也称亚洲鸡瘟或伪鸡瘟，是由新城疫病毒( n e 、w a s t kd i s e a s e v i m s ，n d v ) 引起的鸡和火鸡急性高度接触性传染病，常呈败血症经过。主要特征是呼吸困难， 下痢、神经紊乱、粘膜和浆膜出血。本病1 9 2 6 年首次发现于印尼，同年发现于英国新城，根据 发现地名而命名为新城瘦i l j ，直到现在的近8 0 年t j ，新城疫已在全世界发生过多次大流行”叫。 本病分布于世界各地，1 9 2 8 年我国已有本病的记载，1 9 3 5 年在我国有些地区流行，死亡率很高， 是严重危害养鸡业的重要疾病之一，造成很大经济损火。我国每年因此造成的损失极为严重，据 农业部估计，我国每年因各种禽病造成的经济损失高达数十亿元，其中n d v 占了近1 0 。尽管 常规疫苗的使用已经降低了该病的毁灭性暴发流行，但并没寄真正有效的控制住其流行，所以对 n d v 的研究就成了禽病研究的重点。在国际动物p 生法典中，本病与高致病性禽流感同属a 类 病，因此世界各国对本病的发生和流行均高度重视。 n d v 存在于病鸡所有器官、体液、分泌物和排泄物中，以脑、脾和肺含毒量最高，骨髓禽 毒时间最长。从不同地区和鸡群分离到的n d v ，对鸡的致病性有明显差异。根据不同毒力毒株 感染鸡表现的不同，可将n d v 分为几种致病型”j ：速发型或强毒型毒株，在各种年龄易感鸡 引起急性致死性感染；中发型或中毒型毒株，仅在易感的幼龄鸡造成死亡性感染；缓发型即 低毒型或无毒型毒株，表现为轻微的呼吸道感染或无症状肠道感染。n d v 毒力分型依据下列三 个标准p j ：鸡胚最小致死量平均死亡时问( m d t ) ，1i = ! | i 龄雏鸡脑内接种致病指数( 1 c p i ) 和6 周 龄鸡静脉注射致病指数( i v p i ) 。不同致病型的新城疫病毒的主要区别见表l 表l 不同致病型新城疫病毒的主要区剐 t a b i eld j s t j n g u i s ho f n d vw j l hd j 舵r c n lp a l h o g c n i s 新城疫病毒是副粘病毒科，腮腺炎病毒属的成员，完整的病毒粒子近圆形，表面有纤突， 由囊膜、核酸和核衣壳组成，病毒基因组为1 5 k b 左右的单股负股r n a ，为单一开放阅读框架， 至少编码六种病毒特异性的结构蛋白，包括核衣壳蛋白( n u c l e o c a p s j d p r o t c i n ，n p ) 、磷酸化蛋白 ( p h o s p h a t ep f o t e i l l ，p ) 、依赖r n a 的r n a 聚合酶( l a r g ep m l e i n ，f ) 、血凝素神经氨酸酶蛋白 ( h a e n l a 9 9 1 u t i n i n n e u r 锄i n i d a s e p r o t e i n ，h n ) 、融合蛋白( f u s i o np f o l e 渤，f ) 及基质蛋白( m a m x p r o i e i n ，m ) 【，“j 。在病毒感染的细胞中还发现有两种由p 基因编码的非结构蛋白v 、w ，具体功 能有待于进一步研究”。根据它们在病毒粒子中所处位置的不同，可将它们分为与囊膜有关的 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 外部蛋白( f 、h n 、m ) 及与基因组r n a 有关的内部蛋自 n p 、p 、l ) 。研究表明，构成n d v 致病力的分子基础是f 蛋白和 玳蛋白。f 蛋白在病毒穿入细胞膜及与细胞膜融合过程中起重要 作用”， n 蛋白则具有血凝素神经氮酸酶和促融合三种活性，在n d v 侵染过程中负责识别 细胞受体，介导病毒吸跗于细胞膜上1 1 1 ”j ，并能与f 蛋白协同作用，共同完成侵染过程。h n 和 f 蛋白协同作用的机理可能为，首先h n 蛋白与其受体结合并发生构象改变，进而触发f 蛋白构 象变化，使其释放疏水融合多肽而完成与靶细胞膜的融合( l a m b ，1 9 9 3 ) ”。m 蛋白位于囊膜 内侧面，在病毒r n a 的合成调控和感染性粒子的组装方面起着重要作用，此外，m 蛋自还是病 毒腊质囊膜内表面的支持物，能够维持病毒结构的完整性”q 。l 、n p 和p 蛋自称为内部蛋自三 者与病毒基因鲴r n a 相结合构成摘毒核袁壳j 。 n d v 的h n 蛋白是由约2 0 0 0 个碱基构成的，约占n d v 基冈组的1 3 ，5 。含一个开放阅读 框l ，根据多肽长度的不同可分为三个亚型，分别为 n “1 6 、h n 5 7 7 和h n 5 7 。所有开放阅 读框架中最丈的是 矾0 6 1 6 ( 仅在些低致病力毒抹：q u o e s l d ，u i s t e r 和d 2 6 中发现) ，它能够 通过在h n o 前体c 端切除4 5 个氨基酸残基而变成有活性的h n 蛋白。而其它翻译产物5 7 1 和5 7 7 个氮基酸本身就其有活性，且存在于有毒力孵毒株体内。因此，从总体l 二来讲， 玎q 蛋白的长度 对n d v 的致病力有重要影响。 成熟的 烈蛋白是种四累体寡聚蛋白，亚单位之间通过二硫链相连形成二聚体，两个二聚 体非麸价结合形成四聚体啪2 ”，其组成为：一个短的细胞浆内嗜水性尾部、疏水性膜穿入部、细 胞外躯干部和头部。现已发现h n 至少有三种功能：( 1 ) 介导病毒颗粒吸附丁靶细胞表面禽有唾 液酸的受体，从而启动感染过程，h n 的许多单克隆抗体是通过阻断此功能而中和病毒的感染性 的；( 2 ) 神经氨酸酶活性是病毒复制周期中加强病毒颗粒的移动和促进从感染的细胞中释放的重 要因素：( 3 ) h n 的另一重要功能是促进f 蛋白的细胞融合作用，此种作用具有极强的特异性。 例如，n d v 的 基因只在与n d vf 基因共表达时，才能显示促细胞融合作用；而年1 1 人副流感 病毒的f 共表达时，财没有促细胞融合作用；反之亦然。说明在傻细胞融合作j j 期同同源性h n 和f 之问有一定的特异性信息交流。h n 蛋白的这些功能是由分布于h n 蛋白上的不同区域来完 成的，头部负责受体识别和神经氯酸酶话性，而促细胞融合作用则巾膜穿入部分和躯干的大部分 来完成【2 22 ”。 n d v 作为副牿病毒，h n 蛋自的h a 和n a 活性分布不像正粘病毒那样是由两个蛋自来发挥 的，而是在同一个蛋白上相互协同发挥作用的。最近，h n 蛋白的晶格结构分析表明在分子上没 有发现第二个结合位点，说明这两种活性实际上被同一个位点所催化，并且是通过依赖环境中物 质作为构象开关来澉活的。在 玳蛋白的合成过程中，细胞内耱基化结构将高甘露糖添加到 玳 蛋白潜在的a s n 连接的糖基化位点上从而使 狲可进一步形硪复杂的碳永亿合物链。 在薪城疫的预防方匦。目前，普遍采用活疫苗和灭话苗预防n d 。灭活菌可诱导较强的体液 免疫，但一次注射量大，费工费时，成本较高，而弱毒菌虽可克服上述缺陷，却存在易受母滚抗 体干扰、不完全保护、毒力返强以及毒力与免疫保护成负相关等不足如今又出现了高母源水平 鸡群发病的现象，说明野毒与经典新城疫病毒在抗原性上发生了较大的变异，因此，尽快研制新 型、高效的基因工程疫苗已成为兽医工作者的重大课题。 近几年，全国各地均报道有新城疫的暴发流行“。2 0 0 肚2 0 0 1 年，保定两个鸡场发生疑似 新城疫疫情，其共同特点是：鸡场鸡只体内的新城疫平均抗体滴度都在7 l o 啦以上，但是都不能 2 鸡新城疫病毒地方株的分离鉴定及其洲基1 ) ；1 的克隆与序列分析 得到有效保护，h b b 株造成育成鸡的大批急性死亡，h b w 株造成成年蛋鸡陆续死亡。本试验从 两个发病鸡场采集病料，分离病毒，并对病毒进行毒力鉴定和h n 基因的扩增与序列分析，旨在 研究两株分离株的生物学特性以及其与国内外流行毒株的遗传性联系，从而为本地区鸡新城疫的 防治提供可靠的依据。 3 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 2 1 材料 2 1 1 病料与毒株 2 材料与方法 病料：由河： e 省保定地区两个大型发病鸡场，采集死亡鸡只的脑、肝、脾等组织。 标准毒株：f 4 8 e 9 ，b s o t a 株均由河北省畜牧兽医研究所提供。 2 1 2 实验动物与鸡胚 一日龄白米航小公鸡，购自保定鹿园祖代种鸡场，隔离饲养。s p f 鸡胚购自北京梅里弧维通 实验动物技术有限公司。1 2 曰龄无新城疫母源抗体雏鸡由s p f 鸡胚自行孵化后，隔离饲养至1 2 日龄，经抗体检测确无新城疫抗体。 2 1 3 克隆载体与菌种 p b s - t 克隆载体，购自北京天为时代科技有限公司；n 一互补性选择宿主e c o l ij m l 0 9 菌株 购自宝生物工程( 大连) 有限公司。 2 1 4 引物 参考文献【2 ”选用一对 n 基因序列特异性引物，引物序列如下 p 15 _ t g c a g t g t g a g t g c t a c t - 一3 p 25 c r r g a c a a c l l t a a a a c a 一3 引物跨度为8 9 7 b p ，由t a k a r a 公司合成。 2 1 5 主要试剂 4 乙二胺四乙酸二钠( e d t a ) 琼脂糖 十二烷基磺酸钠( s d s ) 水饱和酚 焦炭酸二乙酯( d e p c ) p e g 2 0 0 0 0 异戊醇 北京化工厂 & 鲫a p r o m e g a 北京鼎园生物技术发展中心 a m r e s c o 苏州正兴化工研究所 北京化工厂 鸡新城疫病毒地方株的分离鉴定及其h n 基因的克隆与序列分析 氯仿 三羟甲基氨基甲烷( t i s ) 四甲基乙二胺( t e m e d ) 硼酸 蔗糖 溴酚兰 d n l p m l t i l r e r n a 酶抑制剖 e x t a q p b s t 载体 h i n d i l l e c o l i a g a r o s eg e ld n ap l | r i 丘c a t i 伽k i t 溴化乙锭一( e b ) d n am a r k e r l i i t r n z o l 试剂 m a r l c e r i i l 透析袋 2 ，l ，6 主要仪器 电控自动孵化机 2 5 型基因扩增仪 d y y ，1 0 c 型微电脑控制电泳仪 t g l l 6 m 台式高速冷冻离心机 s p x 2 5 0 b d 型震荡培养箱 2 4 0 9 。0 0 型凝胶成像系统 s w c j 2 f d 型洁净工作台 电热恒温水浴箱 z d _ 8 5 恒温振荡器 北京化工厂一 s i g m a 北京化工厂 天津市天大化工实验厂 北京化【厂 s i g r n a t a k a r a t a k a r a t a k a r a t a k a r a t a k a r a t a k a r a t a k a r a s i g m a 北京天为时代科技有限公司 北京天为时代科技有限公司 北京天为时代科技有限公司 北京人台通经贸有限公司 北京市海淀区海江孵化设备厂 宁波新兰生物科技股份有限公司 北京市六一仪器厂 长沙英泰仪器有限公司 上海博迅实业有限公司 博励行仪器有限公司 上海博迅实业有限公司 北京市医疗设备总厂 江苏国华仪器公司 5 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 移液器 电泳槽 普通高速离心机 电热恒温培养箱 2 ，1 7 溶液的配制 芬兰t h e h n o - l a b s ”t 哪公司 北京六一仪器设各厂 上海安亭科学仪器厂 长沙市医疗器械厂 o5 me d t a ( p h8 o ) ：称取e d t a 寸呵a ，2 h 2 09 3 9 ，溶于4 0 0 怖l 取蒸水中，用l mn a o h 调节至p h 8 o ，双蒸水定容至5 0 0 恤l 。 1 m t s h c “p i8 o ) ：称取t r i s 碱6 0 ，5 5 9 溶于4 0 0 m l 双蒸水中，用浓h c l 凋：话至p h 8 0 ， 用取蒸水定容至5 0 0 m l 。 s o j u t i o nj 5 0 m m o l l葡萄糖 5 彻o l l 三羟甲基氨基甲烷( t 一3 ) t s h c l ( p h 8 ，o ) 】om m o l l 乙二胺四乙酸( e d t a ) ( p h 8 o ) s 0 1 u t i o n o 4m 0 1 l n a o h ，2 s d s ( 十二烷基硫酸钠) ，瑚前等体积混合 s o l u b o nl i l 5 m o l l 醋酸钾6 0 m l 冰乙酸 】1 5 m l 水 2 8 5 m l t e 缓冲液 l o m m o l lt s h c l 1 m l i l 0 1 le d t a ( p h 8 o ) 胰r n a 酶( r n a 酶a ) ：将r n a 酶溶于l o m m o l l t r i s _ h c l ( p h 7 5 ) 、1 5 l l | m o l l n a c l 中，嘎戍l o m g m l 的浓度，于l o o 加热l s m i n ，缓慢冷却至室温，傈存于- 2 0 。 o 1 d e p c 水：1 0 0 _ i l l ld 棚2 0 加入到l o om l 的输液瓶中，加o 1 m u ) e p c ，混匀。所有操 作在通风厨里，( d e p c 为强致癌物) 在3 7 度温育1 2 小时( 过夜) ，然后在1 5p s i 条件下高 压蒸汽灭菌2 0 m i n ，以使残余的d e p c 失活。 5 x 1 s _ 硐9 酸( t b e ) 缓冲液，配制l l 溶液各成分的用量： t r i s 碱5 4 9 硼酸 2 7 5 9 加o 5 m o 扎e 既气( p h 8 o ) 2 0 m l ，用水补足1 l 。 2 5 m g m l l p l g ：溶解2 5 0 m g 的l p l - g ( 异丙基硫代一p 毋半乳糖苷) 于1 嘶l 水中，分成小份 储存于2 0 。 2 0 l l l g m l x g a l ：将l o o m g x 唱a 1 溶于5 m l 二甲基甲酰胺中，分装小管，锡箔纸包好，2 0 a 6 鸡新城疫病毒地方株的分离鉴定及其洲基因的克隆与序列分析 l b 液体培养基 配制每升培养基，应在9 5 0 r n l 去离子水中加入 胰蛋白胨l o g 酵母提取物5 9 n a c l l o g 振动容器直至溶质完全溶解，用n a o h 调节p h 至7 o ，加入去离子水至总体秘为1 l ，1 2 1 湿热灭菌2 0 1 t l i n 。 l b 【目体培养基：在1 0 0 l r i l l 液体培养基中溶解1 5 9 琼脂粉，1 2 l 湿热灭菌2 0 m i n ，当温发 降至5 0 左右时，加入抗生素，旋转混匀，适量倒入培养皿中，待冷却后，倒置平皿，4 保存。 1 0 s d s ：将1 9s d s 溶于8 m ld d h 2 0 中，定溶至l o m i 。 i m o 觇葡萄糖溶液：取1 8 9 葡萄糖溶解在8 m l 去离子水中，待葡萄糖全部溶解后，加入 去离子水至总体积l o m l t 然后用滤膜过滤除菌。 营养肉汤培养基 蛋向胨 l og 氯化钠 5g 磷酸氢二钾 lg 肉水1 0 0 0 m l 将上述成分混合于水中，加热溶解，调至p h 7 4 7 6 ，分装。1 2 1 1 s 分钟高压灭荫，备用。 厌氧菌肉肝汤培养基 蛋白胨l og 新鲜绞碎牛肉 2 5 0 9 肝( 新鲜猪肝，去脂肪及筋膜) 2 5 0 9 氯化钠 5 9 水1 0 0 0 m l 取新鲜绞碎牛肉和切成小块的肝，按配制成分比例加入水，充分搅拌后，置于4 冰箱浸泡 2 0 2 4 小时；煮沸3 叫。分钟，补足水分，用布过滤，弃去肉渣，取出肝块。滤液加入1 蛋白 胨和o 5 氯化钠，加热溶解。调p h 7 8 8 o ，加热煮沸l o 2 0 分钟，用滤纸过滤；将煮过的肝块 洗净，切成o 5 c l l l 左右小方块，用水充分冲洗后，分装于试管中，加盖液体石蜡约4 m m 厚量； 经1 1 6 3 0 分高压灭菌。 鲜血琼脂培养基：将琼脂1 2 9 剪碎放入5 0 0 m l 新制的营养肉汤培养基中，加热使之融化； 矫丑j ! p h 7 4 7 6 ，在高压蒸汽内1 2 1 2 0 分钟灭菌，防止冷却，当冷却至4 5 5 0 时，加入无 7 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 菌鲜血达5 分装试管，摆成斜面，待凝固后，置3 7 培养l 2 天，无菌保存于冰箱备用。 2 1 2 方法 2 _ 2 1 瓤城疫病毒的分离与毒力鉴定 2 2 1 1 新城疫病毒的分离 无菌采集病死雏鸡的脑、肝和脾，用研钵分别研碎，加入5 倍含终浓度4 0 0 0 i u ，m l 的双抗生 理盐水，将悬液置于离心管中，冻融3 次，3 7 感作l h ，4 0 0 0 t p m 4 离心2 岫i n 。取上清液于。2 0 保存，将部分上清液分别接种营养肉汤培养基、鲜血琼脂培养基、厌氧菌肉肝汤培养基，3 7 培 养4 8 小时，经菌检确定无菌后接种于9 日龄s p f 鸡胚尿囊腔内，o 2 m u 胚，滴蜡油封口后，置 丁- 3 7 孵化机内继续孵育，收获2 4h 后死亡鸡胚尿囊液，观察鸡胚病变，将收集鸡胚尿囊液， 用1 鸡红细胞悬液检测其血凝性。再用9 曰龄s p f 鸡胚连续传两代，收集死亡鸡胚尿囊液保存 予2 0 备用。 2 2 1 2 分离株的鉴定 ( 1 ) 血凝( h a ) 试验：应用b 一微量法口”，对收取的各代尿囊液进行血凝试验，检测有无血凝性 及血凝效价。 ( 2 ) 血凝抑制( h i ) 试验；用n d v 、a 和e d s v 的标准阳性血清按争微量法进行h i 试验。 2 2 1 3 生物学特性的测定 ( 1 ) 鸡胚半数致死量( e l d ) 的测定 分别将两分离株鸡胚尿囊渡用灭菌生理盐水进行i o 倍系列稀释，由最高稀释度开始，各个 稀释度按o 1 m “鸡胚接种6 枚9 日龄s p f 鸡胚，接种后每天照蛋3 4 次，连续照蛋7 天，观察 记录鸡胚死亡数，计算各稀释度鸡胚死亡的百分率，按嵇t r b e r 法f ”f 算e l d ，o 值。 ( 2 ) 鸡胚平均死亡时间( m d t ) 测定 将两分离株和f 4 8 e 9 株鸡胚尿囊滚用灭菌生理盐水进行连续l o 倍系列稀释，取1 0 、1 0 、 1 0 4 、1 矿四个稀释度。每个稀释度按o 1 删鸡胚接种6 枚9 日龄s p f 鸡胚3 7 孵育，弃去2 4 h 内死亡鸡胚，每隔两小时照蛋1 次连续照蛋7 天，观察记录鸡胚死亡时间。使所有鸡胚死亡的 最高稀释度就是最小致死量( m d 下) 。m d t 是m u ) 致死鸡胚的平均时间，强毒株为4 0 6 0 h ， 中毒株为6 0 9 0h ，弱毒株为9 0h 以上。m d t 可按下列公式计算：m d t ；( x 小时死亡鸡胚数 x h + y 小时死亡鸡胚数y l l + z 小时死亡鸡胚数z ) 死亡鸡胚总数。 ( 3 ) 1 日龄鸡脑内接种致病指数( 1 c p i ) 测定 用灭菌生理盐水分别将两分离株和f 4 8 e 9 株鸡胚尿囊液作l ：1 0 倍稀释，每个分离株脑内接 种1 0 只1 日龄s p f 雏鸡，o 0 5 m u 只，同时设立5 只雏鸡对照( 脑内接种灭菌生理盐水0 0 5 m u 只) ，温箱内隔离饲养8 天，每天观察、记录雏鸡的正常、发病和死亡数，正常鸡得o 分，发病 鸡得1 分，死亡鸡得2 分，l e p l 按下歹l j 公式计算：1 c p p ( 8 天内累计死亡数2 十8 天内累计发病 数1 ) 8 天x 试验鸡数。 8 鸡新城疫病毒地方株的分离鉴定及其h n 基因的克隆与序列分析 ( 4 ) 6 周龄鸡静脉内接种致病指数( i v p i ) 测定 崩灭菌生理盐水将新鲜的、具有感染性的无菌尿囊液作1 ：1 0 倍稀释，接种1 0 只6 周龄s p f 鸡，每只静脉注射o 1m l 。接种鸡每日观察，连续1 0 天，每次观察时，正常鸡得。分，患病鸡 得1 分，瘫痪鸡得2 分，死亡鸡得3 分。i v p i 值是观察8 天时间内每只鸡的平均得分。 ( 5 ) 新城疫分离株回归试验 将分离病毒尿囊液经口，鼻，眼接种于l o 只1 2 日龄的健康雏鸡，( 无新城疫母源抗体) ， o ，2 m “只，同时设立对照组，正常饲喂，观察试验鸡发病死亡情况，从发病死亡鸡中分离病毒和 进行细菌分离培养。 ( 6 ) 高母源抗体雏鸡的攻毒试验 将分离株尿囊液经口，鼻，眼接种l o 只有新城疫母源抗体( 测得h i 效价6 1 0 9 2 ) 的1 2 日 龄雏鸡，o 2 m i 只，同时设立对照组，正常饲喂，逐日观察试验鸡发病，死亡情况。 2 2 2 新城疫病毒分离株h n 基因的r t - p c r 扩增 222 1 病毒增殖b 浓缩 ( 】) 新城疫病毒的增值 取分离毒株历 囊液作1 0 5 稀释，接种i o 日龄s p f 鸡胚( o 2 m l 胚) ，接种后的鸡胚在3 7 继续孵育，并定时照蛋，弃去2 4 h 内死亡鸡胚，收集2 4 h 后死e ：鸡胚于4 保存过夜，收获尿囊 液，储存于2 0 备用。 ( 2 ) 透析袋的处理 将透析袋剪成l o 2 0 c m 的小段，用d d h 2 0 将透析袋煮沸10 1 1 1 i n ，随后将其转移至盛满水的 松盖瓶内，1 5 磅高压灭菌1 5m i n ，冷却后存放于4 冰箱备用。 ( 3 ) 病毒的浓缩 取鸡胚尿囊液反复冻融3 次，以4 0 0 m j n 离心3 0 m i n ，取上清，装入预先处理好的透析袋 中，以p e g 2 0 0 0 0 浓缩至原体积的1 ，4 0 ，将浓缩液以2 0 0 “u 管分装，2 0 保存备j ； j 。 2 2 2 2 病毒r n a 的提取 按照t r n z o l 试剂说明书提取。操作步骤： ( 1 ) 取冻存在2 d o c 的n d v 尿囊浓缩液一份，按每2 0 0 止样品加8 0 0 此t r n z o l 试剂。 ( 2 ) 快速颠倒离心管混匀，使其充分裂解，室温放置5 m i n ，使蛋白复合体完全解离。 ( 3 ) 加入2 0 0 血氯仿，剧烈震荡混匀3 0 秒，放5 分钟。 ( 4 ) 台式离心机上，1 2 0 0 蛳n ，4 离心1 0 分钟。 ( 5 ) 将上清液小心转移到r n a s e 舶e1 5 m l 离心管里，加入等体积的异丙醇，4 放置2 0 分钟。 ( 6 ) 台式离心机上，1 2 0 0 0 r p m ，4 离心1 5 分钟。 ( 7 ) 小心移去上清液，防止r n a 沉淀丢失。 ( 8 ) 用7 5 酒精洗涤沉淀两次，每次7 0 0 此，1 2 0 0 0 f l ，m ，4 离心5 分钟。 ( 9 ) 尽可能彻底的吸走上清，防止r n a 沉淀丢失。 ( 1 0 ) 放在室温下5 1 0 分钟使酒精完全挥发。 9 河北农业大学硕士学位( 毕业) 论文 ( 1 1 ) 沉淀用3 0 皿d e p c m 2 0 溶解。 2 2 2 3 病毒的r t 反应 采用2 0 “l 反应体系，在0 2 m le p p e i l d o r f 管中依次加入： 模板r n a5 u l 上游引物 l | i l ( 2 0 p m 0 1 ) d e p c 水l u l 混匀，6 5 反应5 分钟，立即混匀，放4 冰箱，待冷却后依次加入： 5 x 逆转录缓冲禳4 u l d n t p6 u l ( 2 5 m m o l ，l ) i h a s ei n h j b i r u f e 2 i 工l ( 4 0 u m l ) 4 2 反应2 分钟，加入： a m v 】l ( 2 u m l ) 混匀4 2 反应7 0 分钟，9 5 反应5 分钾，立即放4 冰箱5 分钟，做p c r 。 2 2 2 4p c r 反应 采用5 0 p l 反应体系，在o 2 m le 即d o r f 管中依次加入： 模板c d n a3 l l o p c r 缓冲液5 此 d n t p4 h l ( 2 5 m m o l 几) 上游引物 l ，5 曲( 2 0 p m 0 1 ) 下游引物1 5 皿( 2 0 p m o i ) d d h 2 03 4 p l e xt a q d n a 聚合酶 1 5 此( 1 5 u ) p c r 反应条件为： 9 4 5 m i l l 一9 4 抛 3 5 c y c j e s 5 4 5 0 s l 7 2 1 5 m i n 7 2 1 0 m i n 结束后取p c r 产物立即徽1 的琼脂塘凝胶电泳捡测或保存于2 0 备用。 2 2 2 5 琼脂糖凝胶电泳检测 用o 5 x t b e 电泳缓冲液配制1 的琼脂糖凝胶液，加热至琼脂糖完全溶解混匀，待6 0 左 右加入2 u l e b 混匀，然后倒入插好相应梳子的电泳槽内，室温下3 o m j n 使之完全凝固，小心 移去梳子，取f 挡板，放入电泳槽中，取3 p lp c r 产物和l p ll o ) d a d i n gb u f i h 混匀后，用微量 1 0 鸡新城疫病毒地方株的分离鉴定及其h n 基因的克隆与序列分析 加样器将样品加到相对应孔中，1 0 0 v 电压恒压电泳，当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1 2 c f n 处， 停止电泳。取出凝胶置于凝胶成像仪中观察、拍照、检测扩增结果。 2 2 2 6p c r 产物的回收纯化 按t a k a r a 公司提供的a g a r o s e g e l d n a p u f i t i o n k i t 使用说明书来纯化p c r 产物。具体 步骤如下： ( 1 ) 取2 0 u i jp c r 产物进行琼脂糖凝胶电泳，完毕后，在紫外灯下切出含有目的d n a 的琼脂糖 凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面液体，此时应注意尽量切除不食目的d n a 部分的凝胶，尽量减小凝 胶体积，提高d n a 回收率。注意，切胶时不要将d n a 欧时间暴露于紫外灯下，以防止d n a 损 伤。 ( 2 )