（无机化学专业论文）人脑脊液中tau蛋白的分离与检测方法研究.pdf

摘要 摘要 阿尔茨海默病( a l z h e i m e r sd i s e a s e ，a d ) 是当今社会中最常见的老年痴呆症之 一。正常情况下t a u 蛋白在人体脑脊液( c e r e b r o s p i n a lf l u i d ，c s f ) 中含量较低，浓 度大约在2 x 1 0 _ 1 0 9 m l 左右；病变后沉积在细胞内的t a u 蛋白则有可能被释放， 引起c s f 中t a u 蛋白含量的增高。临床试验结果表明：脑脊髓液中t a u 蛋白的 含量水平，与痴呆症程度高度相关。因此，寻找一种简单有效的、能用于临床 的分离与检测c s f 中t a u 蛋白的方法，显得甚是必要。 本文首先对高效s d s p a g e 方法分离蛋白质的条件进行探索，然后采用银 金属探针法对痕量蛋白质检出方法进行研究，并结合使用热休克( h e a ts h o c k ) 方法对脑脊髓液样品进行前处理，以期对脑脊髓液中t a u 蛋白含量水平进行有效 的检测。主要内容如下： 1 ) 用s d s p a g e 分离样品中各蛋白质成分，通过对电泳控制条件探索、优 化，找出了最佳的分离条件；通过图像扫描，使用p h o t o s h o p 等计算机图像处理 软件，对s d s p a g e 凝胶电泳图像进行灰度数值的定量分析，建立了一种简便 易行的电泳图像分析的新方法；通过电泳技术与计算机技术的结合，将常规的 电泳分离手段应用于痕量蛋白质的定量分析之中。 2 ) 将银金属探针应用于痕量蛋白质的检测。通过对银染条件的系统探索和 优化，使得电泳分离后处于凝胶板上的各蛋白成分的检出下限大为降低，灵敏 度大幅提高。结合p h o t o s h o p 等计算机图像处理软件的使用，对电泳胶迁移条带 进行灰度分析处理，获得比较满意的线性关系，r 2 = 0 9 2 0 7 ，线性范围1 0n g l o f l g ，检测下限达到0 1f g m l 数量级。 3 ) 尝试利用t a u 蛋白所具有的较强的抗热性，采用“热休克 ( h e a ts h o c k ) 方法对人脑脊液c s f 样品进行前处理。实验证明：在9 9 。c 振荡加热1 0 分钟的 条件下，能除去c s f 中大部分的其他非t a u 蛋白成分；该方法作为c s f 中痕量 t a u 蛋白检测的样品前处理方法，简单有效。 摘要 4 ) 使用标准h t a u 蛋白，确定了t a u 蛋白的在电泳凝胶上迁移条带的位置， 并与标准蛋白m a r k e r 进行对照，得出实验条件下t a u 蛋白的表观分子量约为 4 8 k d a 。通过银离子探针显色分析，获得了实验条件下标准t a u 蛋白“灰度浓 度 工作曲线。再对实际c s f 样品在同等条件下进行实验，对c s f 中t a u 蛋白 的迁移条带进行归属，并根据其凝胶迁移条带黑度，使用图像处理软件与上面 得到的标准工作曲线进行综合分析，获得到c s f 中t a u 蛋白浓度的结果，约为 1 , 1 0 - 9 9 m l 。 关键词：阿尔茨海默病，s d s p a g e ，t a u 蛋白，检测与分离，银金属探针 n a b s t r a c t a b s t r a c t a l z h e i m e r sd i s e a s eo ) i so n eo ft h em o s ti m p o r t a n to fa l ln e u r o d e g e n e r a t i v e d i s e a s e si nt h ee l d e r l yp o p u l a t i o nw o r l d w i d e t a ui sn o r m a l l ya ni n t r a c e l l u l a rp r o t e i n ， t h ea m o u n tf o u n di nc e r e b r o s p i n a lf l u i d ( c s f ) i sl o w i na l z h e i m e r sd i s e a s e ，t h es l o w n e u r o d e g e n e r a t i v ep r o c e s sl e a d st oi n c r e a s e dn e u r o n a ll o s s ，w h i c hm a yg i v er i s et o i n c r e a s e dt a ul e v e l si nc s e a ss p e c i f i ct h e r a p e u t i co p t i o n sa r ec u r r e n t l ye m e r g i n g , t h e r ei sad e f i n i t en e e dt os e e km e a n so fi m p r o v i n gd i a g n o s t i ca p p r o a c h e s i no u rp r e s e n tw o r k , w ei n t e n dt oi n t r o d u c eas i l v e rs t a i np r o c e d u r ea f t e rt h e e l e c t r o p h o r e s i st oe n h a n c et h es e n s i t i v i t y b ys y s t e m a t i ci n v e s t i g a t i o nw ef o u n do u t t h eo p t i m a lc o n t r o lc o n d i t i o n sf o rt w od e t e c t i n g s y s t e m s s o d i u md o d e c y l s u l p h a t e p o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o e s i s ( s d sp a g e ) w a su s e dt os e p a r a t et h e p r o t e i ns a m p l e t h es i l v e rs t a i nm e t h o dw a sa d o p t e d t h eo p t i m a lc o n d i t i o no fs t a i n r e a c t i o nw a se x p l o r e d b yo p t i m i z i n gt h ec o n d i t i o n s ，t h es e n s i t i v i t yo fe l e c t r o p h o r e s i s w a sg r e a t l yi m p r o v e d i tc a l ld e t e c t0 1 f g m lp r o t e i n u s i n gs o m es o f t w a r e s ，s u c ha sp h o t o h s h o p ，t h ep r o t e i nb a n do nt h eg e lw a s s c a n n e d ，a n dt r a n s f e r r e dt oj p e gf i g u r e t h ee l e c t r o p h o r e s i sp i c t u r eo ft h ep r o t e i n b a n dw a st h e n a n a l y s i z e dt h r o u g hc a l c u l a t i n gt h er e l a t i v eb l a c k n e s s w ef o u n dt h e r e l a t i v eb l a c k n e s sh a sag o o dc o r r e l a t i o nw i t ht h ep r o t e i nc o n c e n t r a t i o n t h r o u g h d e d u c t i n g t h e b a c k g r o u n dc o l o r , as a t i s f a c t o r y l i n e a rr e l a t i o nw a so b t a i n e d c o m b i n i n ge l e c t r o p h o r e s i st e c h n o l o g yw i t ht h et e c h n o l o g yo ft h ec o m p u t e r ，w eh a s c r e a t e dan e wc o n v e n i e n tq u a n t i t a t i v ea n a l y t i c a lm e t h o dt od e t e c tt r a c ep r o t e i n c o m p a r i n gw i t hm a r k e r ，w ec o u l df i n dt h ep o s i t i o no fh t a up r o t e i ni n t h e e l e c t r o p h o r e s i sp i c t u r ew h i c hi n c l u d i n gh - t a up r o t e i na n dm a r k e r a d o p tah e a ts h o c k m e t h o dt od e a lw i t ht h ec s f s a m p l e ，t h ee x p e r i m e n ti sp r o v e d ，m o s to t h e rp r o t e i nc a n b ed e p o s i t e du n d e r9 9 c ，a n dr e m o v e db ys u b s e q u e n tc e n t r i f u g a t i o n o nt h eo t h e r h a n d ，t a up r o t e i nc a nr e s i s t t h eh e a t s h o c k , a n dr e m a i ni nt h es o l u t i o nw i t h o u t d e p o s i t i o ne n h a n c e i tc a nb ee x p e c t e dt h a th e a t - s h o c kc a nb eap r e t r e a t m e n tm e t h o d f o rd e t e c t i n gt a up r o t e i 0i nc s e o nt h eb a s i so ft h el i n e a rr e l a t i o nm e n t i o n e di nt h e i i i a b s t r a c t p r e v i o u sp a p e r , w ec o u l dc a l c u l a t et h et a uc o n c e n t r a t i o ni nc s fw i t ht h eh e l po ft h e r e l a t i v eb l a c k n e s s k e yw o r d s ：a dd i a g n o s i s ，t a up r o t e i n ，d e t e c t i o na n ds e p a r a t i o n ，e l e c t r o p h o r e s i s ， s i l v e rp r o b e i v 学位论文版权使用授权书 本人完全了解同济大学关于收集、保存、使用学位论文的规定， 同意如下各项内容：按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版 本；学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并采用影印、缩印、 扫描、数字化或其它手段保存论文；学校有权提供目录检索以及提供 本学位论文全文或者部分的阅览服务；学校有权按有关规定向国家有 关部门或者机构送交论文的复印件和电子版；在不以赢利为目的的前 提下，学校可以适当复制论文的部分或全部内容用于学术活动。 学位论文作者签名： 汹6 年3 只& 经指导教师同意，本学位论文属于保密，在年解密后适用 本授权书。 门 指导教师签名：z 彳乞学位论文作者签名：纺丹 2 , o o 锌芎其2 | 日。4 年弓只_ 1 7 t 同济大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，进行 研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本学位论文 的研究成果不包含任何他人创作的、已公开发表或者没有公开发表的 作品的内容。对本论文所涉及的研究工作做出贡献的其他个人和集 体，均已在文中以明确方式标明。本学位论文原创性声明的法律责任 由本人承担。 丹吖 拐办轹萨 签 咖 第1 章绪论 1 1a i z h e i m e r 病( a d ) 第1 章绪论 老年性痴呆症可以分为分脑血管性与阿尔茨海默病( a l z h e i m e r sd i s e a s e ，a d _ ) 两类。脑血管型多是脑血管病导致脑梗塞的结果，在我国较为常见。a d 病因不 明，目前认为是一种系统性疾病，以高级认知功能低下为特点，病理上以脑细胞 内神经纤维缠结( n e u r o f i b r i l l a rt a n 酉e s ，唧及细胞外老年斑( s e n i l e p l a q u e ，s p ) 为特征【。全球有a d 患者约2 0 0 0 万人，在我国7 0 岁以上老人中a d 已不 少见。由于诊断技术的提高，将使检出人数不断增多【2 1 。随着社会老龄化，a d 患 病率不断增加，使人类不得不面对自然界三大奥秘之一的人脑的研究【3 1 。阿尔 茨海默病使大脑细胞受损，从而使大脑中传递信息，尤其是负责储存记忆的介 质遭受破坏。它占所有痴呆病例的5 0 - - 一6 0 。目前全世界约有1 1 0 0 万阿尔茨海 默病患者。据推测，到2 0 2 5 年这一数字将翻一番。 目前阿尔茨海默病还无法治愈。在过去5 年，阿尔茨海默病患者使用的药 物数量有所增长，并似乎缓解了某些病人的症状。家庭护理提供者采用的干预 措施可减少阿尔茨海默病患者的痛苦，并推迟进入疗养院的时间。 a d 分为散发性与家族性，但以散发性居多。家族性a d 又分为早发型( e o a d ) 与迟发型( l o a d ) 两种。家族性早发型a d 常于5 0 - 6 0 岁发病，迟发型a d 发病 在6 5 岁以后，迟发型多于早发型。从研究家族性a d 入手，较易找出a d 相关 ( a s s o c i a t e d ) 基因或易感基因。由此，至少已发现4 种a d 相关基因。但这5 种a d 相关基因的存在，尚不足以说明a d 的所有遗传危险因素。细胞外以1 3 淀粉样蛋 ! 兰t ( a m y l o i d1 3p r o t e i n ) 为中心的构成的老年斑( s p ) 与脑细胞内高度磷酸化的微 管相关蛋白( t a u ) 构成的n l 可，是a d 在病理上的两大特征【引。 1 2 老年斑( s p ) 与b 淀粉样蛋白 老年斑s p 的核是由b 淀粉样蛋仨l ( g - a m y l o i d ，a b ) 沉积构成的。a b 是含有 3 9 4 3 个氨基酸残基的多肽，常见形式为a 1 3 4 0 和a i m 2 。在正常老年人脑脊液中 ( c e r e b r o s p i n a lf l u i d ，c s f ) 中存在a b ( a b 4 0 和a b 4 2 ) ，且以后者为主。典型的老 1 第1 章绪论 年斑s p 以a b 4 2 的沉积为主，所以许多学者都设想把脑脊液中的a b 4 2 的水平 作为a d 的一个检测指标。a b 4 2 与a d 之间的相关性研究已有很多报道。大部 分实验结果显示：a d 病人脑脊液中a b 4 2 水平明显降低【5 l 。其原因可能是由于 a b 在a d 病人脑中的沉积增加，而向脑脊液的分泌减少所导致的1 6 l 。值得注意的 是，老年斑( s p ) 也存在于其他神经系统疾病中。通过尸检发现s p 的沉积量与a d 的病情并非呈正相关【7 】，因此老年斑并非是a d 的特征性病理改变，单纯检测脑 脊液中a b 含量并不能作为a d 的诊断指标。 1 3n f t 与t a u 蛋白 t a u 蛋白是微管结合蛋白( m i c r o t u b l e a s s o c i a t ep r o t e i n ，m a p ) 中含量最多 的一种。由微管结合蛋白和微管蛋白组成的微管是细胞骨架的重要组成成分， 与细胞有丝分裂，细胞内物质转运等多种功能有关【8 j 。t a u 蛋白是一种磷酸蛋白， 其磷酸化水平的调节随发育而不同，来自未成熟脑的t a u 蛋白被磷酸化的位点比 来自成熟脑的t a u 蛋白多，前者有6 - - 8 个位点发生磷酸化，而后者平均只有2 3 个位点被磷酸化，提示t a u 蛋白在脑成熟过程中有选择地去磷酸化。t a u 蛋白 有多种异构体，是由单基因通过不同的m r n a 剪接而产生的。在成熟人脑中可 找到6 种异构体，它们含有3 5 2 - 4 4 1 个氨基酸残基，由于存在或缺乏三个插入 片段而彼此不同，其共同的结构特征是：每种t a u 蛋白分子的羧基端一侧都存在 3 - - 4 个由3 1 , 、- 3 2 个氨基酸残基组成的重复序列。用基因重组技术合成的t a u 蛋 白研究表明，t a u 蛋白分子中的这些重复序列在正常生理条件下是微管的结合部 位，同时，有些t a u 蛋白异构体在氨基端附近包含由2 9 或5 8 个氨基酸残基组成 的插入片段p j 。自从被发现以来，t a u 蛋白已被认为是体外微管蛋白聚合的一个 有力的助催化剂。t a u 蛋白与微管结合降低了它们的动力学不稳定性，它提高微 管生长端微管蛋白分子连结的速率，降低微管蛋白分子分离的速率，抑制它们 向缩短结局相转变。t a u 蛋白在体内也有相似的功能，已有数个实验室转染t a u 基因进入正常并不表达t a u 蛋白的细胞。在转染细胞中，t a u 蛋白与微管结合， 增强微管的稳定性，有时诱导微管成束，成束可能是受t a u 蛋白影响，使微管稳 定的结剽矧。正常状态下微管结合蛋白t a u 具有稳定微管结构的作用，而高磷 状态下的t a u 蛋白连接微管的作用大为降低，从微管上脱离下来并在细胞内异常 沉积，形成双股螺旋细丝( p a i r e dh e l i c a lf i l a m e n t ，p h f ) ，而p h f 组成了神经元纤 2 第1 章绪i e 维缠结。造成神经纤维及神经元的变性和坏死州，如图1 1 所示。 a x o n “t a u8 t s b i l l ；：e s t + a n s f o r l m l c r o t u b u l e s p h f t a up h o s p h o l a ! b np h f m t d e p o 叶m e f l z a t l o n8 s s o m b 哼 甜1 1 异常磷酸他的t a u 蚩向造成n f r 示意瞰 正常情况f t a 蛋白在c s f 巾含量较骶，璃变后则可能释放到c s f 中造 成a d 忠者c s f 叶lt a u 蛋白含量的增高。1 9 9 3 年v 柚d e 咖e e 心n 等埘a d 再i 非 a d 病人脑杼液中t a u 蛋白的含量水平进行了的系统研究，分析结果表明：t a 蛋白的台最水平升高与a d 之问有高度的相关性。因此，脑脊渡中t a u 蛋f 水半 的变化对a d 幅床诊断的意义也就成了许多学者十分梵心的话题。目前认为， a d 忠者脑脊液中t a u 蛋白的含量与其他神经系统疾墒以及正常人之u j 有显著 性升高。近年柬。国外许多实验结果表明，a d 病人脑脊液t a u 蛋闩的水平远 高于年者争相匹配的对照组，且与病人的发病年龄、a p o e 4 基因表远频度敷临床 痴呆程度无关。a r a i 等报道了原先脑脊液t a 含最硅蒋升高的轻发记忆 损伤的病人随着发展成为典型的a d 。故a d 忠者脑脊液中t a 强臼榆演9 对a d 的珍断具有较高的特，亡性和灵敏度。 i4 t a u 蛋白分离与检测的意义 神经细胞内神经原纤维缠结( n f t ) 是a d 毛要的脑 ；f 【痫理改变之嘶 n f t 的t 要组成成升足片常过度磷酸化并聚集成段螺旋丝的i a u 蛋白。| j 前已经 第1 章绪论 发现，导致神经原纤维变性的t a u 蛋白异常修饰是唯一与a d 患者临床痴呆程度 正相关的参数，因而被认为是a d 发病过程中最为特征性的变化。目前还没有特 异的a d 治疗方法，故争取早期诊断进行防治非常重要。由于t a u 蛋白的病理变 化出现在a d 的早期，在a d 脑组织中的t a u 蛋白水平明显增高，因此关于t a u 蛋白在a d 早期诊断中的作用研究倍受关注。因为t a u 蛋白是一种细胞内成分， 在细胞外液中的浓度极低，故在血液或血清中找不到t a u 蛋白，近年来应用一种 非常敏感的酶联免疫法( e n z y m el i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y ，e l i s a ) 技术研究发 现，在a d 早期，大多数病人脑脊液中的t a u 蛋白升高，因此量化测定脑脊液中 的t a u 蛋白可能成为a d 早期诊断的一项有用指标。由于各个研究的样本量相对 小，各个实验室采用的t a u 样品和e l i s a 技术方面的不同，已报道的脑脊液t a u 蛋白水平差别大，临界值范围从1p g m l 到6 0 0p g m l ，因此，必须进一步研究以 确定其在a d 早期诊断中的作用以及a d 脑脊液t a u 蛋白升高的特异性和敏感 性，追踪研究以确定a d 脑脊液t a u 蛋白水平是否与认知功能减退的速度以及神 经元变性有关。更令人感兴趣的是，测定那些有轻微认知功能损害而又达不到 a d 诊断标准的老年人的脑脊液t a u 蛋白水平，并追踪观察以确定t a u 蛋白升高 是否预示着以后会发展为a d 。虽然目前还没有办法能减缓a d 的进展，但是一 些药物正在开发中，如果疗效确切，那么尽早诊断a d 以获得最大疗效将很重要， 生物学测定如脑脊液t a u 蛋白测定可能帮助临床医生达到这个目的【1 5 ，1 ”7 1 。 1 5 蛋白检测方法 目前常用的检测蛋白质的方法可以分为生物方法和化学方法两大类。 一、常用的生物方法： 1 免疫吸附法( e n z y m el i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y ，e l i s a ) 这一方法有两个特点，一是抗原抗体免疫反应在固体表面进行，二是用酶 作为标记物进行蛋白质测定。抗原抗体与蛋白结合，再结合酶标抗体或酶标抗抗 体，加入底物后通过酶促反应形成有色物质，根据颜色的深浅或酶联仪检测的结 果定性或定量分析。由于酶的催化频率很高，故可极大地放大反应效果，从而 使测定方法具有高度的敏感性和特异性，几乎所有的可溶性抗原抗体系统均可 4 第1 章绪论 用以检测。e l i s a 方法有直接法、问接法和双抗夹心法，使用较多的是般抗夹心 法，其灵敏度晟高，晟小可测值达n g 甚至p g 水平。e l i s a 具有简便、快速，费用 相对低等特点。但缺乏标准化，使用同一方法，若在操作方法e 出现的某些差异， 如保温时间的长短，洗涤方法不同菩都会引起实验效果的不同重现性差。如 f 图所示： 。= _ l 厂醵 u 日 u 幽12 酶鞋免疫法 * * 厂 u 囱 2 w b 法( 蛋白质印迹w c ! s t e r nb l o t t i n 曲 w b 是目前已知的检测痕量虽白的方法之一它一般分为两个步骤：蚩白质 由凝胶转移至固相基质( 通常由电泳实现，有半于法盒湿法两种方法) ：特异性 抗体检测。它将电泳的较高的分离能力、抗体的特异性和显色酶反应的灵敏性 结合起来，是检测复杂混合物中特异蛋白质的最有力的工具之一，普遍用于分 离、检测特异的目的蛋白质，灵敏度为l j n g 。它可确定一个样品中是否禽有低 于或超过预定限值水平的目的蛋白质，特别用于不u r 溶蛋白质的分析。w b 法相对 e 1 i s a 法具有特异性高、灵敏度强的特点。但是检查操作复杂花赞较高，不能 成批检查患者，因而推广应用有一定难度。 二化学法 化学发光法以其仪器设备简单、操作快速方便、灵墩度高等显著的优点，在 近几年得到了迅速发展，成为一种高灵敏度的微量及痕量分析方法，已广泛应 用于金属离子分析、药物分析、临床分析、免疫分析等。 卤 第1 章绪论 1 蛋白质分光光度法 以分子吸收光谱为基础的分光光度法因其具有设备简单，准确精密和结果 直观等特点而被广泛应用于生物化学和临床化学中蛋白质的测定。 ( 1 ) 双缩脲法( b i u r e ta s s a y ) 此法是一种测定蛋白质的经典方法。双缩脲反应是双缩脲在碱性溶液中与 铜离子( c u 2 + ) 生成紫红色化合物的反应。具有2 个或2 个以上肽键的化合物皆有双 缩脲反应，因此蛋白质在碱性溶液中也能与c u 2 + 生成紫红色化合物，可在5 4 0n m 测量吸光度。此方法虽简便、快速，但灵敏度不高，约为i m g ，故现已很少使 用。 ( 2 ) l o w r y 法1 1 8 】 1 9 5 1 年，劳里( l o w r y ) 等将双缩脲试剂和f o l i n 酚试剂( 磷钼酸盐磷钨酸 盐) 结合使用，在蛋白质发生双缩脲反应之后，再和f o l i n 酚试剂反应，此试剂在 碱性条件下易被蛋白质中酪氨酸的酚基还原，呈蓝色反应，由此生成颜色更深的 化合物，可在6 4 0l q m 测量吸光度。劳里法较双缩脲法灵敏1 0 0 倍，其不足之处是 此反应受多种因素干扰，且由于蛋白质中酪氨酸、色氨酸含量不同，在显色灵敏 度方面存在差异。 ( 3 ) b c a 法1 1 9 】 二喹啉甲酸( b i c i n c h o n i n i ca c i d , 又称双辛可宁酸) 法简称b c a 法，原理为：碱 性条件下，蛋白质分子中的肽键与铜离子c u ( i i ) 反应生成c u ( i ) ，c u ( i ) 再与 b c a 反应形成紫色络合物，在5 6 5 硼测量吸光度。b c a 法的试剂比劳里法的试 剂稳定，干扰少，各种蛋白质之间显色差异小，故这种方法逐渐被采用。 ( 4 ) 银染法【加l 1 9 8 5 年k r y s t a l 等发展了银染法，此法先用甘油醛处理蛋白质样品，再与银 氨溶液混合，1 0 分钟后加入硫代硫酸钠终止反应，测定4 2 0n m 吸光度。该法的 线性范围为1 5 n g - - - 2ug 。 2 染料探针法 染料探针是蛋白质分析中种类最多、应用最广的一类探针。此类染料按分 子结构可分为三苯甲烷类、偶氮类、偶氮变色酸类和卟啉类等。 ( 1 ) 烷类染料 6 第1 章绪论 溴酚蓝和溴甲酚绿是使用得比较早性能优良得探针试剂应用也比较广泛。 1 9 7 6 年，b r a d f b r d 【2 1 l 提出用考马斯亮蓝g - - 2 5 0 分析蛋白质的方法。在酸性条件 下，浅红色考马斯亮蓝( 入m 觚为4 5 5n m ) 与蛋白质反应生成深蓝色复合物( 入m 酥， 为5 9 5n m ) ，线性范围为1 2 0 l ag m l 。此法成为灵敏度最高的染料探针分析方法。 之后又发展起一系列染料探针，如溴甲酚紫、铬天青、埃铬青、四碘荧光素、 百里酚蓝等效果不错。 ( 2 ) 偶氮类染料 甲基橙【捌、氨基黑1 0 b 2 3 】、t - a z o r i 矧、锌试剂f 2 5 1 。此类探针的检测灵敏度 较低，在此不再具体介绍。 ( 3 ) 偶氮变色酸类染料 比较常见的有偶氮月$ i i i t 2 6 1 、酸性铬兰k 阳、偶氮磺f 2 8 1 、氯磺酚s 【2 9 1 、硝基 磺粉c 1 3 0 1 等。此类染料比偶氮类染料灵敏度高。 ( 4 ) 卟啉类染料 已发现q ，b ，y ，6 叫对磺苯基) 卟啉( t p p s 4 ) 可以用作蛋白质吸光探针。反 应在p h = 2 左右进行，测定范围为1 - - - 1 0 | lg m l ，反应速度快，灵敏度较高于考马 斯亮蓝法。另外还有四氯苯醌、酸性品红、3 二( 羧甲基) 氨甲基 1 ，2 - - 羟基葸 醌、茜素红s 【3 2 】等。 ( 5 ) 络合物染料 1 9 8 4 年，f u j i t a 等发现利用邻苯二酚紫m o 体系在6 8 0 h i 处可测定0 一- 3 0 l ag m l 的蛋白质，加入表面活性剂聚乙烯醇用于临床尿样中总蛋白的测定。此 外双硫腙一银【3 3 1 、铬天青s 铁( ) i 矧、水杨基荧光酮钼( ) 3 5 l 和二溴羟基苯基 荧光酮钼( ) i 矧等比较常见。这些探针灵敏度不高，应用不广泛。 3 蛋白质荧光法 荧光法测定蛋白质通常比分光光度法灵敏，蛋白质中含有酪胺酸和色胺酸， 可以吸收2 7 0 - - 3 0 0 n m 的紫外光而导致紫外荧光。当和某些具有荧光特性的染料 结合后能引起荧光强度的猝灭或增强，并且在一定范围内与蛋白质浓度有一定 的线性关系，因此可用于蛋白质的测定。 ( 1 ) 普通荧光法 常用的蛋白质荧光染料有：卜苯胺基8 一萘磺酸( a n s ) 、2 一对甲苯胺基萘一6 一 磺酸( t n s ) 、卜( n 二甲胺) 一萘5 一磺酸( d n s ) 和荧光胺等。近年来，蛋白质荧光探 针的研究又有新的进展。水溶性卟啉，如q ，6 ，y ，6 4 ( 对磺苯基) 卟啉( t p p s 4 ) 7 第1 章绪论 和4 ( 对羧苯基) 卟啉( t c p p ) 是性能优良的蛋白质荧光探针。利用微量蛋白质对 t p p s 4 的荧光熄灭作用，可以测定纳克级的蛋白质。酸性条件下，t c p p 本身荧 光很弱，一定量的白蛋白可使t c p p 荧光增强，但球蛋白的增强作用不明显；当 有s d s 存在时，白蛋白和球蛋白对t c p p 的荧光增强作用均增加，基于这一现象， 可以利用1 个测定体系分别测定白蛋白和球蛋白。此外，已见报道的蛋白质荧光 探针还有铬天青s 【3 刀、埃铬青r 【3 8 l 、四碘荧光素b 【3 9 】、吖啶橙【训、水杨酸f 4 1 】、四 磺基铝酞青【4 2 1 、曙红y 【4 3 】等。 稀土离子也是一类很重要的荧光染料，其中铽( ) 与蛋白质结合后，一般 可由f o r s t e r 型偶极偶极无辐射能量转移导致荧光的敏化。利用铽( ) 荧光的敏 化，铽( ) 螯合物可以测定1 0p m o l l 的蛋白质。 ( 2 ) 同步荧光法 同步荧光光谱技术是l l o y d1 4 3 1 在7 0 年代初提出的，具有谱带窄化，灵敏 度高，选择性好等优点，可将在普通激发和发射光谱上相互重叠的荧光峰分开 在进行多组分分析时，通过选择合适的波长差入，可以出现每一组分的特征 峰，达到同时监测或分析多组分荧光的目的。 ( 3 ) 共振光散射法 光散射是指一束光线提高通过介质时在入射光方向以外的各个方向上都能 观测到光强的现象，是电磁辐射与物质间相互作用的一种表现形式。共振光散 射是指辐射光波长与入射光波长相同的一类光散射，这种光散射在一定条件下 被称为瑞利( r a y l e i g h ) 散射。近年来，其在分析化学中的应用开始引起人们的 重视。p a s t e r n a s k 等用光散射技术研究了叶琳类化合物在核酸上的聚集实验中 所用光辐射的波长范围位于叶琳类化合物的最大吸收谱带( s o r e t 带) 内，他们称 这种光散射为共振光散射。光散射探针分析的基础是试剂分子或络合物与蛋白 质结合，导致体系的光散射信号明显增强。例如，铬天青s 可以与血清白蛋白 在p h = 3 5 左右的柠檬酸n a o h 介质中生成超分子化合物，产生最大散射波长为 3 7 0n m 的光散射信号，基于这一现象可以测定低至0 0 2 p g m l 的血清白蛋白， 方法的灵敏度高于考马斯亮蓝法5 0 倍i 删。此类探针，有偶氮磺i h 【4 5 】、偶氮胂羧【4 6 1 、 栎皮黄素【4 7 1 、桑色烈钙】以及二溴酚荧光酮钼( v i ) 1 4 9 1 络合体系等。 ( 4 ) 免疫荧光分析法 免疫荧光分析是一种非放射标记的免疫分析方法，它克服了使用放射性标 记带来的许多问题，具有安全、经济等优点。但测量过程中，蛋白质类生物样 8 第1 章绪论 品引起的高背景荧光限制了该法的灵敏度。近二十多年来，人们越来越多地将 钢系络合物( 特别是e u 3 络合物) 用于免疫分析，这是因为锢系络合物有较长的 荧光寿命( 0 o l - l m s ) ，可比生物样品自身的荧光寿命长1 0 倍以上是较理想的荧 光标记物。时间分辨荧光光谱是脉冲激发后不同时刻记录的荧光发射光谱这一 技术可将长寿命和短寿命的荧光信号加以区分，从而解决免疫荧光分析法中蛋 白质背景信号干扰的问题。 1 6十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳 由于t a u 蛋白在人体脑脊液中的含量非常低，浓度在4 0 0 p g m l 左右，因此 需要寻找一种可以快速，简便易行的蛋白质检测方法来检测如此低的浓度。本 文中我们主要使用了十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳( s d s p a g e ) 银染色 的方法。 1 6 1 常用蛋白质分离方法 原理： s d s p a g e ( 十二烷基硫酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳) s d s - - p a g e 电泳技术首先在1 9 6 7 年由s h a p i r o 等l s o 建立，1 9 6 9 年由w e b e r 和o s b o m t 5 1 l 进一步完善。他们发现在样品介质和聚丙烯酰胺凝胶中加入离子去 污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的电泳迁移率主要取决于亚基分子量的大小， 而电荷因素可以被忽略。 s d s 是一种阴离子去污剂，作为变性剂和助溶性试剂，它能断裂分子内和 分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白质分子的二级和三级结构。强还原剂， 例如巯基乙醇( 1 3 - - m e r c a p t o ，e t h a n a l ) 和二硫苏糖醇( d i t h i o t h r e i t o l ，d 踊则能使半 胱氨酸残基之间的二硫键断裂。在样品和凝胶中加入s d s 和还原剂后，分子被 解聚，解聚后氨基酸侧链与s d s 充分结合形成带负电荷的蛋白质一s d s 胶束 ( p r o t e i n s d sm i c e l l e s ) ，所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量， 9 第1 章绪论 这就消除了不同分子之间原有的电荷差异。蛋白质- - s d s 胶束在水溶液中的形 状象一个长椭圆棒。椭圆棒的短轴对不同蛋白质基本是相同的，但长轴的长度 则与亚基分子量大小成正比。因此在s d s - - p a g e 系统中电泳迁移率不受蛋白质 原有电荷的影响，而主要取决于椭圆棒长轴的大小，即蛋白质分子量的大小。 1 6 2s d s - p a g e 分离效果 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳在结合使用考马斯亮蓝染色时可以获 得比较好的分离效果，最低可分离出1 j g m l 浓度的蛋白质条带【5 2 l 。若结合使用 银离子探针的方法，可使分离下限提高1 0 0 倍【5 3 ，5 4 】。 由于蛋白质中存在着酪氨酸和色氨酸故蛋白质本身能吸收2 7 0 - - - 3 0 0 n m 的 紫外光而发生紫外荧光，文献曾报道用2 8 0 n m 的紫外光照射动物蛋白质中性萃 取液然后于3 4 0 - - 3 5 0 n m 处测量其荧光强度，可用于牛乳中蛋白质的测定。在 测定条件下核酸嘌啉和嘧啶都不发生荧光，不干扰蛋白质测定。 1 0 第2 章高效蛋白质s d s p a g e 分离方法研究 第2 章高效蛋白质s d s - p a g e 分离方法研究 2 1s d s - p a g e 影响因素 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳( s d s p a g e ) 是蛋白质分离分析常用 的方法，是对蛋白质进行量化，比较及特性鉴定的一种经济、快速、而且可重 复的方法【5 5 】【5 6 1 。s d s 蛋白质复合物的长度与其分子量成正比。由于在样品介质 相聚丙烯酰胺凝胶中加入离子去污剂和强还原剂后，蛋白质亚基的电泳迁移率 主要取决于亚基分子量的大小，而电荷因素可以被忽略。s d s p a g e 因易于操 作和广泛的用途，使它成为许多研究领域中一种重要的分析技术。聚丙烯酰胺 凝胶是由丙烯酰胺单体和交联剂n ，n 一甲叉双丙烯酰胺在催化剂过硫酸胺或 核黄素的作用下聚合交联而成的三维网状结构凝胶。 此法的优点：( 1 ) 聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺和n ，n t 甲叉双丙烯酰胺聚 合而成的大分子。凝胶有格子是带有酰胺侧链的碳碳聚合物，没有或很少带有 离子的侧基，因而电渗作用比较小，不易和样品相互作用。( 2 ) 由于聚丙烯酰胺 凝胶是一种人工合成的物质，在聚合前可调节单体的浓度比，形成不同程度交 链结构，其空隙度可在一个较广的范围内变化，可以根据要分离物质分子量的 大小，选择合适的凝胶成分，使之既有适宜的空隙度，又有比较好的机械性质。 一般说来，含丙烯酰胺7 - 7 5 的凝胶，机械性能适用于分离分子量范围不1 万 至1 0 0 万物质，1 万以下的蛋白质则采用含丙烯酰胺1 5 3 0 的凝胶，而分子量 特别大的可采用含丙烯酰胺4 的凝胶，大孔胶易碎，小孔胶则难从管中取出， 因此当丙烯酰胺的浓度增加时可以减少双含丙烯酰胺，以改进凝胶的机械性 能。( 3 ) 在一定浓度范围聚丙烯酰胺对热稳定。凝胶无色透明，易观察，可用检 测仪直接测定。( 4 ) 丙烯酰胺是比较纯的化合物，可以精制，减少污染。合成聚 丙烯酰胺凝胶的原料是丙烯酰胺和甲撑双丙烯酰胺。丙烯酰胺称单体，甲撑双 丙烯酰胺称交联剂，在水溶液中，单体和交联剂通过自由基引发的聚合反应形 成凝胶。( 5 ) 它能精细地分离各种蛋白质组分，还可以测定蛋白质及核酸的分 子量，进行核酸的序列分析等。 第2 章高效蛋白质s d s - - p a g e 分离方法研究 催化系统 常用的催化系统( 包括引发剂和加速剂) 有下列两种： 过硫酸铵- - t e m e d ( 四甲基乙二胺) 系统，为化学聚合系统。当单体丙烯 酰胺和交联剂甲叉双丙烯酰胺的溶液中加入这种催化系统后，t e m e d ( 加速剂) 先促使过硫酸铵( 引发剂) 形成自由基( s 2 0 2 8 72 s 0 4 ) ，自由基与丙烯酰铵接 触后，又可使单体形成自由基而活化，从而引发聚合作用。聚合的初速度和过 硫酸铵浓度的平方根成正比。该反应需要在碱性条件下进行t e m e d 方能起作 用。如在p h 8 8 条件下，7 的丙烯酰铵溶液3 0 分钟就能聚合完毕，在p h 4 3 时则聚合很慢。温度与聚合的速度成正比。如温度过低，或溶液体系内有氧分 子及不纯物质存在都会延缓凝胶的聚合。为了防止溶液中气泡含有氧分子而防 碍聚合，在聚合之前须将溶液分别抽气除氧，然后再混合配制。 核黄素- - t e m e d 系统，为光催化系统。核黄素在光照( 灯光或日光) 下部 分分解，并还原成无色型核黄素，在有痕量氧存在条件下，此无色型核黄素又 被氧化成为带有自由基的核黄素，并使丙烯酰铵活化，从而发生聚合作用。其 中核黄素为催化剂，不一定加t e m e d 即能聚合，但加入则可加速聚合。用核黄 素进行聚合的优点是：核黄素用量少( 1 0 m g l ) ，对所分析样品没有任何影 响。聚合作用所需的时间通过变化光照的时间、强度来控制。 由于化学聚合的凝胶孔径较小，因而可采用过硫酸铵- - t e m e d 催化系统制 备小孔凝胶( 分离胶) ，且各次制备的重复性好。光聚合的凝胶孔径大，并且 随着时间的延长而逐渐变小，不太稳定，所以用它制备大孔径凝胶较适合。 影响电泳速度的因素 电泳速度与电泳迁移率密切相关，电泳速度越大，迁移率也越大。影响电 泳速度的因素主要有以下几种： ( 1 ) 样品：被分离物的电荷量多少和电泳速度的关系成正比。带电荷量多，电 泳速度快；反之，则慢。此外，被分离的物质若带电量相同，分子量大的电泳 速度慢，分子量小的则电泳速度快，故分子大小与电泳速度成反比。球形的分 子电泳速度比纤维的快。 1 2 第2 章高效蛋白质s d s - - p a g e 分离方法研究 ( 2 ) 电场：从欧姆定律知道电流( i ) ，电压( v ) ，电阻( r ) 的关系是i = v r 。 所以。带电颗粒在电场中移动是收到上述三个因素的影响。 一是电压：电压的高低影响对带电颗粒的引力，电泳速度与支持介质两端的电 压( 电位差) 成正比。所以。提高电压，可以增大电流而缩短电泳时间。电压 大小常用电场强度来表示，即每厘米的电位差( v c m ) 。电泳时两端电压除以 支持的有效长度( c m ) 为电场强度。根据电场强度的不同，电泳可分为高压电 泳( 5 0 v c m ) ，常压电泳( 1 0 - 5 0 v c m ) 和电压电泳( 1 0 v c m ) 。 二是电流：电泳时必须是恒定的直流电源，如果电压固定，电流的大小是由缓 冲液的离子强度和电极间的距离来决定。总电流则支持介质的宽