（森林培育专业论文）濒危植物沉水樟及其近缘种的遗传多样性分析.pdf

独创- 陛声明 本人声明，所呈交的学位( 毕业) 论文，是本人在指导教师的指导下独立完 成的研究成果，并且是自己撰写的。尽我所知，除了文中作了标注和致谢中已作 了答谢的地方外，论文中不包含其他人发表或撰写过的研究成果。与我一同对本 研究做出贡献的同志，都在论文中作了明确的说明并表示了谤 意，如被查有侵犯 他人知识产权的行为，由本人承担应有的责任。 学位( 毕业) 论文作者亲笔签名：葡j 日期：7 咖加 论文使用授权的说明 本人完全了解福建农林大学有关保留、使用学位( 毕业) 论文的规定，即学 校有权送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅：学校可以公布论文的全部或 部分内容，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文。 保密，在年后解密可适用本授权书。 口 不保密，本论文属于不保密。 囱 学位( 毕业) 论文作者亲笔签名：嘞豸 日期：彤彳加 指导教师亲笔签名 3 嗽 i 日蠲：翘占5 7 福建农林大学2 0 0 6 届硕士学位论文 濒危植物沉水樟及其近缘种的遗传多样性分析 摘要 樟科( l a u r a c e a e ) 是一个较大的木本植物类群，樟科植物起源古老、分布广泛、生态 辅黼- 峨5 、 及经济价值显著，在被子植物分类系统中占有举足轻重的地位。但由于目前对该类群植物 的系统演化关系认识十分匮乏，再加上长期以来对樟科植物无节制的开发利用，导致樟科 植物中的很多种处在濒危境地，被列为我国濒危保护植物。目前国内外有关对樟科这些濒 危植物的濒危机制及遗传多样性的研究很少严重影响了对这些濒危植物的保护。因此开 展樟科植物的系统分类及其遗传多样性研究具有重要的理论意义和应用价值。 沉水樟 c i n n a m o m u mm i c r a n t h u m ( h a y a t a ) h a y a t a 是我国樟科樟属的重要经济树种，其精 油是较好的提炼芳香油的材料；木材是造纸的好材料；其树形优美，也是很好的园林和行道 树种。且沉水樟为我国台湾和大陆的间断分布种。由于长期以来对沉水樟的破坏，导致沉水 樟天然林资源锐减，处在濒危境地，目前仅在福建省建瓯市万木林自然保护区内有大面积的 分布己被列为我国的濒危保护植物。针对目前国内外对樟科植物系统分类的研究现状，本 研究采用i s s r 分子标记技术对棒科沉水樟天然居群和迁地保护居群的遗传多样性进行研 究，从分子水平上分析沉水樟种群的生态遗传及其遗传变异规律；同时利用i s s r 分子标记 技术比较沉水樟及其近缘种香樟、阴香、闽楠、桂北木姜予、新木姜子、香叶树、鳄梨在分 子水平上的亲缘关系，揭示这些树种在樟科植物系统进化中的作用与地位，探讨沉水樟及其 近缘种的遗传多样性及其分化格局，为樟科植物的系统分类提供分子水平的依据。主要研究 结果如下 ( 1 ) 建立了适合樟科植物材料的d n a 提取方法。樟科植物材料中含有大量的多糖和酚 类物质，且不同植物内含物存在一定差异，给樟科植物的d n a 提取增加了难度。本研究 通过大量试验摸索研究出了去除上述物质的方法，从而建立了适合沉水樟及其近缘种香樟、 闽楠、桂北术姜子、新木姜子、香叶树、鳄梨的c t a b 法 而阴香叶片中所含脂类、多糖 气 类物质多，导致提取物粘稠，在提取过程中先进行预处理后采用s d s 法的d n a 提取方法。 所提的d n a 可以满足i s s r p c r 反应的要求。 ( 2 ) 经过反复对比试验，建立了适合沉水樟的i s s r - p c r 分析反应体系和扩增程序。反 应体系：2 0 p l 反应体系中加入模板7 5 n g ，引物0 4 p m o l , q , , d n t p 2 0 0 p m o l l ，t a q 酶1 2 5 u m 9 2 + 1 5 m m ；扩增程序：9 4 ( 2 ，7 m i n - _ | ( 9 4 c ，3 0 s _ 5 3 5 8 ，4 5 s 7 2 c ，9 0 s ) 4 5 - - - * 7 2 ( 3 ， 濒危植物沉水樟及辩近缘种的遗传多样性分析 7m i n _ 4 保存。 ( 3 ) 从u b c # 系列的1 0 0 条引物中筛选出能够扩增出稳定产物、扩增条带清晰、特异性 强的18 条引物用于沉水樟天然居群和迁地保护居群的分析；2 4 条引物用于沉水樟及其近 缘种香樟、阴香、闽楠、桂北木姜子、新木姜子、香叶树、鳄梨的分析。 ( 4 ) 研究筛选出18 个扩增良好的引物，用了二沉水樟两居群的遗传多样性的检测。1 8 个引物扩增了两个沉水樟居群的4 4 个个体，共扩增出d n a 片段9 5 条。不同引物的扩增 片段为3 7 个，平均每个引物扩增出5 2 8 条带。沉水樟天然居群扩增了3 8 条具有多态性 条带，多态位点百分数( p ) 为4 0 ：沉水樟迁地保护居群扩增了3 0 条具有多态性条带，多 态伉点百分数( p ) 为3 1 , 6 。 ( 5 ) 研究筛选出2 4 个扩增效果好的引物进行沉水樟近缘种亲缘关系分析。2 4 个i s s r 引物在樟科6 属8 个物种之间共扩增出2 3 4 条条带，平均每个引物扩增出9 ，7 5 条，多态性 条带在樟属3 个物种间有11 9 条，占总扩增带的5 0 9 ；多态性条带在樟科6 个属8 个种 间有2 1 6 条，占总扩增带的9 2 4 。 ( 6 ) i s s r p c r 扩增结果和u p g m a 聚类分析表明：沉水樟的遗传多样水平较高，其迁 地保护居群的遗传多样性略低于天然居群；i s s r 分子标记可以很好的区分沉水樟与其近缘 种香樟、阴香、闽楠、桂北木姜子、新木姜子、香叶树、鳄梨。 关键词：沉水樟：濒危；近缘种；i s s r 分子标记；遗传多样性 主题词：沉水樟；濒危；近缘种：i s s r 分子标记；遗传多样性 2 褥建农林人学2 0 0 6 届硕1 学位论文 g e n e t i cd i v e r s i t ya n a l y s i so ft h ee n d a n g e r e ds p e c i e sc i n n a m o m u n m i c r a n t h u mh a y a t ap o p u l a t i o n sa n di t sc l o s er e l a t i v es p e c i e s a b s t r a c t t h e t e eb r a n c ho fl a u r a c e a ew h i c hh o l d st h eb a l a n c ei na n g i o s p e r mc a s ss y s t e mi sab i g w o o dc l a s sg r o u p h o w e v e ra tp r e s e n tt h ee v o l u t i o nr e l a t i o n s h i pa b o u tt h i sg r o u pi se x t r e m e l y d e f i c i e n t ，t h i sm a d et h er e s o u r c e sc u td o w ns h a r p l yb e c a u s eo fe x c e s s i v eu t i l i z a t i o no ni tf o ra l o n gt i m e e v e ns o m eo ft h e mm i ns e v e r ed a n g e r a n dn o wt h el i m i t e du n d e r s t a n d i n ga b o u tt h e e n d a n g e r e dm e c h a n i s ma n dg e n e t i cd i v e r s i t yh a se x t r e m e l ya f f e c t e dt h ep r o t e c tt ot h e s e e n d a n g e r e dp l a n t s t h e r e b yc a r r yo ns y s t e m i cc l a s s i f ya n dg e n e t i cd i v e r s i t ya n a l y s i so n l a u r a c e a np l a n t sh a si m p o r t a n ta c a d e m i ca n da p p l i e dv a l u e c i n n a m o m u nm i c r a n t h u mh a y a t ai sa ni m p o r t a n tc a s hp l a n t , w h i c ho i li st h ee s s e n t i a l r e f i n e dm a t e r i a l ，w h i c hw o o di sp a p e rm a k i n gm a t e r i a la n dw i t hb e a u t i f u ls h a p ei sg a r d e n sa n d r o a dp l a n t , i t sd i s t r i b u t i o ni sd i s c o n n e c t e db e t w e e nc h i n e s em a i n l a n da n dt a i w a n e x c e s s i v e u t i l i z a t i o no nc i n n a m o m u nm i c r a n t h u mh a y a t ar e s o u r e e sf o ral o n gt i m e ，t h i sm a d et h er e s o u r g e c u td o w ns h a r p l y n o wc i n n a m o m u nm i c r a n t h u mh a y a t ai se n d a n g e r e d ，t h e r ei so n l yo n eb i g g e r d i s t r i b u t i o no fc i n n a m o m u nm i c r a n t h l mh a y a t af o r e s ti nt h e n a t u l 训p r o t e c tr e s e r v eo f w a n m u l i n , j i a n o u ，f u j i a n , i t so n eo ft h es t a t e - p r o t e c t e dt h r e e - g r a d ea n de n d a n g e r e dp l a n t s a i m e d a tt h es t u d yo fl a u r a e a a cs y s t e mc l a s s i f i c a t i o ni nd o m e s t i ca n do v e r s e a s , g e n e t i cd i v e r s i t ya n d g e n e t i cv a r i a t i o nb e t w e e nc i n n a m o m t * nm i c r a n t h u mh a y a t an a t u r a lp o p u l a t i o n sa n de x s i t u c o n s e r v a t i o np o p u t a t i o n sa n dr e l a t i o n s h i pa m o n gi t sc l o s er e l a t i v es p e c i e so fc i n n a m o m u m c a m p h o r a ( l ) p r e s l ，c i n n a m o m u mb u r m a n n i i ( c g e t t h n e e ) b i ，脚o e b eb o u r n e i ( h e m s l ) y a n g l i t s e as u b c o r i a c e ay a n ge tp h h u a n g , n e o l i t s e aa u r a t a ( h a y ) k o i d 五l i n d e r ac o m m u n i s h e m s la n dp e r s e aa m e r i c a n am i l l w e r es t u d i e d b yi n t e r - s i m p l es e q u e n c er e p e a t s ( i s s r ) m o l e c u l a rm a r k e r t h er e s e a r c ha i m e da t g e n e t i cv a r i a t i o nb e t w e e nc i n n a m o m u nm i c r a n t h u m h a y a t ap o p u l u t i o l x s s o t h a tc a r to f f e rt h em o l e c u l a rt h e o r e t i ca n d p r a c t i c a l m e t h o df o r c o n s e r v a t i o na n du t i l i z a t i o no fc i r m a m o m u nm i c r a n t h u mh a y a t up o p u l a t i o n s t h er e s u l t sa r ea s f o l l o w s ： ( t ) t h ed n ae x t r a c t i o n o f l a u r a c e a ep l a n t sh a ss t a b ! e d t h i si sv e r yd i f f i c u l t yb e c a u s eo f t h e h i g hl e v e lo fs e c o n d a r yc o m p o u n d sa n dt h e i rd i f f e n td i s t r i b u t i n g ，o re x a m p l e , p i g r n e n t a m y l a s e a n dh y d r o x y b e n z a n e t h ei m p r o v e dc t a bm e t h o dw h i c hi ss u i t e df o rc i n n a m o m u nm i e r a n t h u m h a y a ma n d i t sc l o s er e l a t i v es p e c i e so fc i n n a m o m u mc a m r h o r a ( l ) p r e s ，c i n n a m o m w n b u r m a n n 试c g e t t h n e e ) b l ，p h o e b eb o u r n e ( h e m s l ) y a n 舀l i t s e as u b c o r i a c e ay a n ge t p h h u a n g n e o l i t s e aa u r a t a ( h a y ) k o i d z , l i n d e r ae o m m u n i sh e m s la n dp e r s e aa m e r i c a n am i l l i sp u tf o r w a r di nt h i s s t u d y , b u tt h es d sm e t h o do ft h ed n ae x t r a c t i o nf o rc i n n a m o m u m b u r m a n n i ii su s e db e f o r ep r e t r e a t m e n t t h ee x t r a c t e dd n ai ss u i t a b l ef o ri s s r - p c r ( 2 ) ao p t i m a lr e a c t i o ns y s t e ms u i t a b l ef o rt h ei s s ra n a l y s i sh ic i n n a m o m u nm i e r a n t h u m 濒危植物沉水樟及其近缘种的遗传多样性分析 h a y a t aa n di t sc l o s er e l a t i v es p e c i e sw a se s t a b l i s h e d ( 2 c i t l , t o t a lr e a c t i o nb u f f e r ) , c o m p e s e db y 7 5 n gt e m p l a t ed n a ，0 ，4 1 _ i m o l lp r e m i e r , 2 0 0 f m o l ld n t p , 1 2 5 ut a q p u l y m e r a s ea n d m g z + 1 5 r a m t h ep e rp a r a m e t e rw a s ：9 4 cp r e - d e n a t u mf o r7m i n , t h e n4 5c y c l eo f 3 0s e c o n da t 9 4 f o rd e n a t u r a t i o n o f4 5 s e c o n da t5 3 5 8 cf o ra n n e a l i n g , o f9 0s e c o n da t7 2 cf o r e x t e n s i o n , f i n a l l ye x t e n s i o na t7 2 f o r 7 m i n , t h e p r o d u c t o f p e r w a s k e p t a t 4 c ( 3 ) e i g h t o e np r i e r sw h i c hs e l e c t e df r o mo d eh u n d r e dp r i m e r st e s t e do l lt h eb a s eo ft h e n u m b e ra n df r e q u e n c yo f p o l y m o r p h i s m sa r cu t i l i z e di na n a l y z i n gg e n e t i cd i v e r s i t yo f t h en a t u r a l p o p u l a t i o n sa n de x - s i t uc o n s e r v a t i o np o p u t a t i o n 。so f c i n n a m o m u nm i e r a n t h u mh a y a m t w e n t y - f o u rp r i m e x 3w h i c hs e l e c t e df r o mo n eh u n d r e dp r i m e r st e s t e do nt h eb a s eo ft h en u m b e ra n d f r e q u e n c yo f p o l y m o r p h i s m sa r eu t i l i z e di na n a l y z i n gr e l a t i o n s h i po fc i n n a m o m u nm i c r a n t h u m h a y a _ t aa n dh c l o s er e l a t i v es p e c i e s ( 4 ) e j g h t e e np r i m e r sa r eu t i l i z e di na n a l y z i n gg e n e t i cd i v e r s i t yo ft h et w op o p u t a t i o a so f c i n n a m o m u nm i c r a n t h u mh a y a t a t h e yh a d9 5e x c e l l e n ta m p l i f i c a t i o nd n as e g m e n ta n de v e r y p r e m i e ra m p l i f i e d3 | 7 t h em e r os e g m e n to fp e rp r i m e rw a s5 2 8 t h i r t y - e i g h tp o l y m o r p h i cl o c i a r ea m p l i f i e da n dt h ea v e r a g ep e r c e n t a g eo f p o l y m o r p h i cs i t e s ( p ) a r c4 0 a m o n gc i r m a m o m u n m i c r c m t h w nh a y a t en a t u r a l p o p u l a t i o n s ，a m o n g e x - s i t uc o n s e r v a t i o n p o p u t a t i o n st 1 1 i 啊 p o l y m o r p h i c l o c i 勰a m p l i f i e d a n d t h ea v e r a g e p e r c e n t a g e o f p o l y m o r p h i cs i t e s ( p ) a r c3 1 6 ( 5 ) t w e n t y - f o u rp r i m e r sa r eu t i l i z e di na n a l y z i n gr e l a t i o n s h i pa m o n gc i n n a m o m u n m i c r a n t h u mh a y a t ac l o s er e l a t i v es p e c i e s t h et o t a lo fa m p l i f i c a t i o nd n a s e g m e n ti s2 3 4a n d t h em e 4 ms e g m e n to fp e rp r i m e rw a s9 7 5 o n eh u n d r e da n du l n e t w e e np o l y m o r p h i cl o c ia m a m p l i f i e da n dt h ea v e r a g ep e r c e n t a g eo f p o l y m o r p h i cs i t e s ( p ) a 5 0 9 a m o n gt h r e eg e n e r i c c a t e g o r i e so f c i n a a m o m u n8 c h a e 0 r , t w oh u n d r e da n ds i x t w e s np o l y m o r p h i cl o c ia 糟a m p l i f i e d a n dt h ea v e r a g ep e t a g eo f p o l y m o r p h i cs i t e s ( p ) 8 ”9 2 4 a m o n ge i g h tg e n e r i cc a t e g o r i e s o f s i xg e n e t i c ( 6 ) r e s u l t so ft h ei s s r - p c ra n du p g m ac l u s t e r i n ga n a l y s i ss h o w e dt h a tt h eg e n e t i c d i v e b i t yo fc i n n a m o m u nm l c r a n t h u mh a y a t aw a sn o ta tal o wl e v e l ，e x - s i t uc o n s e r v a t i o n p o p u t e f i o n si s al i t t l el e s st h a n ( 协 删硎研m i c r a n t h u mh a y a t an a t u r a lp o p u l a t i o n s ；l s s r m o l e c u l em a r k e r 湖w e l ld i v i d ec i n n a m o m u nm i c r a n t h u mh a y a t aa n di t sc l o s er e l a t i v e s p e c i e s k e yw o r d s ：c i n n a m o m u nm i c r a n t h u mh a y a t a , a n d a n g e r e d ) c l o s er e l a t i v es p e c i e s ，1 s s r m o l e c u l em a r k e r , g e n e t i cd i v e r s i t y 、 s u b j , tw o r d s ：c i n n a m o m u nm i c r a n t h u mh a y a t a , e n d a n g e r e d , c l o s er e l a t i v es p e c i e s , i s s r m o l e c u l em a r k e r , g e n e t i cd i v e 俗i t y 4 福建农林大学2 0 0 6 届硕士学位论文 1 前言 樟科( l a u r a c e a e ) 是个较大的木本植物类群( 除草本寄生无根藤属c a s s y t h a 以外) ， 约包含5 0 属25 0 0 30 0 0 种。樟科植物是被子植物的基部类群之一，有化石记录可追溯 至自垩纪中期l 。它们广泛分布于热带至亚热带地区，目前其多样性中心位于亚太地区、 热带美洲地区及马达加斯加，非洲中部只有少数种类。我国的樟科植物有2 4 属4 2 2 种，大 多数种类集中于b 乏江以南各省区，主要分布于台湾、江西、湖南、云南、浙江、福建、，。 东、。西、四川、贵州等省区，只有少数落叶种类分布较北，大体以秦岭淮河为其北界。 樟科植物具有十分重要的经济利用价值，许多种类是重要的经济用材树种、香料或芳香油 和药用植物资源，其中鳄梨( p e r s e a a m e r w a n a m i l l ) 是广泛栽培的世界著名热带水果。同 时樟科植物也具有举足轻重的生态价值，在古代热带至亚热带森林中扮演着十分重要的角 色是这一地区常绿阔叶林中的一个关键主导类群，在新世界的湿润森林中樟科也是十分 常见的植物1 4 , 5 1 。 尽管樟科植物起源古老、分布广泛、生态及经济价值显著，在被子植物分类系统中占 有举足轻重的地位，但目前我们对该类群植物的系统演化关系认识十分匮乏，许多樟科植 物类群间的亲缘关系紧密，而使得类群间的界限变得含糊不清，种属分类和种类鉴慰滩于 把握，导致樟科植物分类的不确定性和利用的盲目性：同时由于长期以来对樟科植物无节 制的开发利用，导致樟科植物中的很多种处在濒危境地，被列为我国濒危保护植物。而目 前国内外有关对樟科这些濒危植物的濒危机制及遗传多样性的研究很少，严重影响了对这 些濒危植物的保护。因此开展樟科植物的系统分类及其遗传多样性研究具有重要的理论意 义和应用价值。 沉水樟 c i n n a m o m u mm i c r a n t h u m ( h a y a t a ) h a y a t a 是樟科樟属的重要经济树种，是目前 樟科植物中含油量最高的一种，其根、茎、技、叶含黄樟油素，是日用化工、医药、国防 等的重要原料；树形高大，生长迅速，可作水源涵养林、环境绿化林。在1 9 8 4 年我国公布 的中国珍稀濒危保护植物名录中，沉水樟被列为国家三级濒危保护植物| 6 】其除了具 有经济利用价值外，由于其地理分布从大陆到台湾呈间断分布【6 1 ，因而沉水樟对樟科植物 地理区系研究育重要的科学意义。同时樟属的香樟和阴香、楠属的闽楠、术姜子属的桂北 木姜子、新木姜子属的新木姜子、山胡椒属的香叶树、鳄梨属的鳄梨均是与沉水樟亲缘关 系较近的樟科植物。 濒危植物沉水樟及其近缘种的遗传多样性分析 虽然国内外对樟科植物进行了大量研究，取得了一定的研究成果。但传统的分类研究 主要集中在形态、生理、生态分类方面，从分子生物学角度对樟科植物的系统分类及其遗 传多样性研究极少特别是从保护遗传学方面进行的研究还是空白。针对目前国内外对樟 科植物系统分类的研究现状，本研究采用i s s r ( i n t e r - s i m p l es e q u e n c er e p e a t ，简单重复序列 区间扩增) 分子标记对樟科沉水樟天然居群和迁地保护居群的遗传多样性进行比较，从分 子水平上分析沉水樟种群的生态遗传及其遗传变异规律：同时利用i s s r 分子标记比较分 析了沉水樟及其近缘种香樟、阴香、闽楠、桂北木姜子、新木姜子、香叶树、鳄梨在分子 水平上的亲缘关系，揭示这些树种在樟科植物系统进化中的作用与地位，探讨沉水樟及其 近缘种的遗传多样性及其分化格局。为樟科植物的系统分类提供分子水平的依据。该研究 对丁樟科沉水樟及其近缘种种质资源的收集分类、品种鉴定、多样性保护及遗传图谱构建 等均有重大理论价值和实践意义，为樟科植物的育种提供可靠的种群遗传背景资料，并为 樟科濒危植物的保护和天然种群遗传多样性保护的制定提供技术支撑和分子生物学依据。 2 国内外植物遗传多样性保护研究进展 2 1 遗传多样性及遗传标记技术研究 2 1 1 遗传多样性的概念及研究意义 生物多样性( b i o d i v e r s i t y ) 是指地球上各种各样的生物及其与环境形成的生态复合体， 以及与此相关联的各种生态过程的多样性的总和。一般来说，它体现在基因、物种、生态 系统和景观四个层次，包括所有的植物、动物、微生物( 物种多样性) 和它们的遗传信息 ( 基因多样性) 和生物体与生存环境一起集合形成的不同等级的复杂系统口】。生物多样性 是生命最突出的特征之一，有机体的种类、形态、它们之间的相互依存与对抗都是生物多 样性的具体表现，而蛋白质及核酸的多样性则是生物多样性的物质基础。生物从各个高级 分类阶层到种，乃至同一物种的不同居群、同一居群的不同个体，都各有特征，互不相同， 、 形成了自身的独特性，独特性组成多样性，多样性是独特性之和，可见多样性存在于生物 界的每一层次。目前对物种的濒危机制及保护对策研究、栽培植物及其野生近缘种的遗传 多样性研究、生物多样性保护技术与对策等研究均是生物多样性研究的热点口1 。 遗传多样性( g e n e t i cd i v e r s i t y ) 是生物多样性的重要组成部分。任何一个物种都具有 独特的基因库和遗传结构，同时在不同的个体间往往也存在着丰富的遗传变异这些变异 6 福建农林大学2 0 0 6 届硕士学位论文 构成了生物的遗传多样性。根据麦克尼利【9 1 定义，遗传多样性是蕴藏在地球上的植物、动 物和微生物个体的基因库和遗传组织形式，物种的多样性也就显示了基因的多样性i ”1 。另 一方面物种是构成生物群落进而组成生态系统的基本单元，生态系统的多样性离不开物 种的多样性，同样也离不开不同物种所具有的遗传多样性。因此遗传多样性是生态系统多 样性和物种多样性的基础。 从狭义上讲遗传多样性是指种内基因的变化，包括种内显著不同的居群间和同一居 群内的遗传变异吼一个物种的遗传多样性说明了该物种在特定的环境因子作用下，其基 因的丰富程度，而这是物种适应和进化的遗传基础。遗传多样性的数量和方式决定了它适 应环境变化的能力，也是维持生态系统长期稳定的基础。生物的遗传多样性大多是经过染 色体变异、d n a 分子变异等途径演变而来。没有遗传不可能保持性状和物种的相对稳定 性，变异不可能得到积累，生物也就不能进化，不可能产生多样性。但遗传又是个相对 的过程，绝非一成不变，否则仅凭遗传带来的简单重复。不可能产生新的性状，生物也就 失去了进化的素材。因此一个物种的遗传多样性水平和其群体的遗传结构是由长期进化决 定的。 种内的多样性是物种以上各水平多样性的最重要来源。遗传变异、生活史、居群动态 及其遗传结构等决定或影响着一个物种与其它物种及其环境相互作用的方式。而且种内的 多样性是一个物种对人为干扰进行成功反应的决定因素，种内的遗传变异程度也决定其进 化的潜势。作为生物多样性的一个重要层次，遗传多样性所指的主要还是种内的遗传变 异。物种是由个体组成的，个体必须组成群体或群体系统才具有进化意义，遗传上有差别 的个体在组成群体或群体系统时形成各种各样的群体遗传结构，产生新的遗传多样性【”】。 因此种内遗传变异既包括群体内个体间的变异，也包括群体间或群体系统间以及农业上品 系、品种间的遗传差异1 1 3 4 】。 遗传多样性的表现是多层次的，可以表现在外部形态和生理代谢上，也可以表现在染 色体、d n a 分子水平上i ”】。遗传多样性是一个综合和复杂的指标，其最直接的表达形式 就是遗传变异的高低及遗传变异的分布格局，即居群的遗传结构 15 , 1 6 1 。遗传变异是物种进 化的重要“原料储备”，一般来说，一个物种的遗传变异越丰富，对鹣变化的适应性就越 强，反之遗传多样性贫乏的物种通常在进化上的适应性相对较弱，也就是说群体内的遗传 变异反映了物种的进化潜力。 物种的遗传组成决定着它的生存方式，这其中包括它对特定环境的适应性以及它被人 类的可利用性等特点。任何一个特定的个体和物种都保持着大量的遗传类型，就此意义而 7 濒危植物沉水樟及其近缘种的遗传多样性分析 言，它们可以被看作单独的基因库。基因多样性，包括分子、细胞和个体三个水平上的遗 传变异度，因而成为生命进化和物种分化的基础。一个物种的遗传变异愈丰富，它对生存 环境的适应能力便愈强；而一个物种的适应能力愈强，则它的进化潜力也愈大。 对于遗传多样性的科学研究始于2 0 世纪3 0 年代初，它是运用现代遗传学、保护生物 学和稍后的分子生物学的理论和方法，对物种和群体的遗传性状多样性进行深入研究基础 上发展起来的一门学科。从保护生物学的角度来看，对物种遗传多样性的了解有助于物种 濒危原因的探讨以及对物种“命运”的预测，是制定合理保护对策的科学依据。植物的遗 传多样性在某种意义上也就是宝贵的遗传资源，因此对遗传多样性的深入了解不但是现代 植物遗传育种的基础，而且也是为了适应未来人类需求的变化培育相应的品种作准备，特 别是随着当代生物技术的迅猛发展，转基因等技术的成熟，这种研究更具现实意义。保 护生物多样性最终是要保护其遗传多样性 ”】。近年来生物多样性保护的研究在推动多样性 的测定、了解种源的适应性、物种起源及基因资源分布等方面起了重要作用。 植物遗传多样性的高低与其分类地位、生活史、繁育系统、居群大小、分布等因素有 荧。特有植物( 包括稀有和濒危物种) 一般被认为较广布种有较低的遗传多样性，而且迄 今在不少濒危植物中检测到很低甚至没有检测到任何等位酶水平的变异【1 1 4 2 m ；然而也有 许多研究表明濒危种、残存种、稀有种和特有种的遗传多样性和区域分布、广布种之间并 无很明显的差异因此濒危物种并不一定意味着遗传变异水平的下降”j 6 1 2 1j 。 总之，遗传多样性研究无论是对生物多样性的保护，还是对生物资源的可持续利用以 及未来世界的食物与药品供应都有重要的意义陋i 。 2 1 2 遗传多样性的研究方法及其发展 遗传多样性的研究方法主要是利用遗传标记( g e n e t i cm a r k e r ) 。遗传标记是指与目标 性状紧密连锁、同该性状共同分离且易于识别可遗传的等位基因变异“，经历了形态标记、 细胞学标记、生化标记、分子标记等几个主要的发展过程。 、 2 1 2 1 形态标记( m o r p h o l o g i c a lm a r k e r s ) 形态标记是指那些能够明确显示遗传多态性的外观性状的相对差异。典型的形态标记 用肉眼即可识别和观察。广义的形态标记还包括那些借助简单测试即可识别的某些性状如 生理特性、生殖特性、抗病虫性等。由自发突变或物理化学诱变均可获得具有特定形态特 征的遗传标记材料。形态标记材料在遗传研究和作物育种上都有重要的应用价值，因此对 8 福建农林大学2 0 0 6 届硕士学位论文 形态标记材料的收集、保存和利用历来受到各国研究者的重视。但由于形态标记数量少、 可鉴别标记基冈有限，因而难以建立饱和的遗传图谱。另外许多形态标记还受环境、生育 期等因素的影响，使形态标记在植物育种中的应用受到一些限制。 2 1 2 2 细胞学标记( c y t o l o g i c a lm a r k e r s ) 细胞学标记是指能明确显示遗传多态性的细胞学特征。染色体的结构特征和数量特征 是常见的细胞学标记，它们分别反映了染色体结构上和数量上的遗传多态性。染色体结构 特征包括染色体的核型和带型。染色体数量特征是指细胞中染色体数目的多少。由于染色 体结构和数量变异常具有相应的形态特征。冈此有了这样的细胞学标记材料，可以在杂种 后代中直接对相应的形态标记进行选择，不必进行染色体鉴定就可确定其细胞学特征，从 而提高细胞学标记的利用效率。细胞学标记虽然克服了形态标记易受环境影响的缺点，但 这种标记需花费大量的人力物力进行培育和选择，一些物种忍受染色体结构和数目变异的 能力较差而难以获得相应的标记材料，另外，大多数染色体具有细胞学标记数目有限，导 致细胞学标记对这些不具有特异性带型的染色体或片断进行鉴定的结果可靠性差。 2 1 2 3 生化标记( b i o c h e m i c a lm a r k e r s ) 自1 9 5 2 年n e i l a n d s 发现同工酶，1 9 5 9 年m a r k e t 提出同工酶概念，生化标记技术在上 个世纪8 0 年代得到了迅速发展，主要是借助于气相色谱和酶的电泳分析 2 4 - 2 8 i 。利用同工酶 进行植物起源、进化、分类及亲缘关系的研究；测定植物群体的遗传变异性及遗传结构； 研究植物基因计量效应和基因连锁定位：进行种质资源、种子纯度测定、品质鉴定、杂种 优势等研究。同工酶是基因表达的直接产物，其分析能够较直接判断基因的存在及其表达 规律，比较不同对象之间的基因差异。一同时同工酶分析可靠性强、重演性好、实验操作简 单易行、耗费少。但是由于同工酶是基因表达的直接产物，易受环境、栽培条件和植物生 长阶段的影响，同j = 酶标记的基因位点数目少多态性水平低等，限制了同工酶技术在植 物育种上的直接利用，只能成为植物育种的一种辅助手段。 、 2 1 2 4 分子标记( m o l e c u l a rm a r k e r s ) 分子标记是继形态标记、细胞学标记和生化标记之后发展起来的一种以d n a 多态性 为基础的新一代遗传标记。广义的分子标记是指可遗传的并可检测的d n a 序列或蛋白 质。狭义的分子标记是指d n a 标记。d n a 分子标记是d n a 水平遗传多态性的直接反映。 9 濒危植物沉水樟及其近缘种的遗传多样性分析 d n a 水平的遗传多态性表现为核苷酸序列的任何变异。与以往的遗传标记相比，分子标记 具有如卜特点：多态性水平高。分子标记是建立在d n a 水平上的遗传标记，基因组d n a 的变异是遗传多态性形成的分子基础。基因组d n a 的多态性要远远多丁各种基因的遗传 多态性，因为在基因组中存在着大量不编码的d n a 序列，它们的变异不受或较少地受自 然选择的制约。所以分子标记的多态性远高于传统的遗传多态性。数量多。因为分子标 记来源于基因组d n a 的变异。无组织、器官及发育时期的特异性。不受季节和环境 条件的影响。许多分子标记表现为共显性。能区分纯合基因型与杂合基因型，提供完整 的遗传信息。菲等位基因间无上位性作用，互不干扰。多数无表型效应，对目标性状 的表达无影响。因而此技术一经出现就引起了遗传育种研究者的普遍重视，被广泛应用于 种质资源研究、遗传图谱构建、目的基因定位和分子标记辅助选择等方面【3 0 l 。目前常用的 分子标记类型有：基于分子杂交的分子标记，如r f l p 等：基于p c r 的分子标记，如 r a p d ，s s r ，s t s ( s e q u e n c et a g g e ds i t e ) ，i s s r 等；p c r 与r f l p 相结合产生的一些分子 标记，如a f l p , c a p s ( c l e a v e da m p l i f i e dp o l y m o r p h i cs e q u e n c e s ) 等；新型的分子标记， 如s n p ( s i n g l en u c l e o t i d ep o l y m o r p h i s m ) 、e s t (