（病理学与病理生理学专业论文）p16、ki67、cyclind1在胃癌中表达的研究.pdf

目录 f i i h f jr 1 i j l l l l f l l j l i l l f l r l l l i f l i j i i i l l f l l l l 1 l y 19 014 5 5 中文摘要1 英文摘要4 研究论文p 1 6 、k i 6 7 、c y c l i n d l 在胃癌中表达的研究 前言8 一丹l j 舌。 材料与方法9 结果10 附图1 2 附表18 讨 念1 9 结论2 2 参考文献2 3 综述p 1 6 、k i - 6 7 及c y c l i n d l 在胃癌中表达的研究进展2 6 致调 3 4 个人简历3 5 中文摘要 p 1 6 、k i 6 7 、c y c l i n d l 在胃癌中表达的研究 摘要 目的：胃癌是我国常见的恶性肿瘤之一，在我国发病率和死亡率均居 各类肿瘤的首位。目前认为抑癌基因p 16 的突变和缺失及原癌基因 c y c l i n d l 的激活和核增殖抗原k i 6 7 的过表达与胃癌的发生、发展及转移 有关。本实验通过检测p 1 6 、k i 6 7 及c y c l i n d l 蛋白在正常胃组织与胃癌 组织中的表达，分析三者与胃癌分化程度、淋巴结转移的关系，为研究胃 癌的发病机理提供理论依据，同时也为临床治疗胃癌提供新的药物作用靶 点。 方法：收集承德医学院附属医院2 0 0 8 年9 月至2 0 10 年3 月手术切除 经病理证实的胃癌组织标本8 0 例，正常胃组织( 距离肿瘤3 c m 以外) 1o 例。采用免疫组织化学法标记p l6 、k i 6 7 及c y c l i n d l 蛋白，检测三者在 正常胃组织及胃癌组织中的表达，结合临床病理学资料对实验数据进行统 计学分析。 结果： 1p 1 6 阳性信号主要表达于细胞核。1 0 例正常胃组织标本中， p 16 的表达为阴性1 例，弱阳性1 例，中度阳性3 例，强阳性5 例。8 0 例胃癌组织标本中，p 16 的表达为阴性51 例，弱阳性14 例，中度阳性9 例，强阳性6 例。其中高中分化者p l6 的表达为阴性1 6 例，弱阳性9 例， 中度阳性6 例，强阳性4 例；低分化者p l6 的表达为阴性3 5 例，弱阳性 5 例，中度阳性3 例，强阳性2 例；无淋巴结转移者p 16 的表达为阴性l l 例，弱阳性8 例，中度阳性5 例，强阳性6 例；有淋巴结转移者p 1 6 的表 达为阴性4 0 例，弱阳性6 例，中度阳性4 例，强阳性0 例。经两独立样 本秩和检验，p 1 6 在胃癌组织中的表达明显低于胃正常组织( p 如0 5 ) ，高、 中分化胃癌的表达高于低分化胃癌的表达( p 铆0 5 ) ，伴有淋巴结转移的胃 癌组织p 1 6 较无转移病例阳性率低沪如0 5 ) 。 2k i 一6 7 阳性信号主要表达于细胞核。lo 例正常胃组织标本中，k i 6 7 的表达为阴性5 例，弱阳性4 例，中度阳性1 例，强阳性0 例；8 0 例胃 癌组织标本中，k i 6 7 的表达为阴性2 4 例，弱阳性1 2 例，中度阳性18 例，强阳性2 6 例。其中高中分化者k i 6 7 的表达为阴性1 6 例，弱阳性9 中文摘要 例，中度阳性6 例，强阳性4 例；低分化者k i 一6 7 的表达为阴性1 4 例， 弱阳性1 4 例，中度阳性4 例，强阳性0 例；无淋巴结转移者k i 一6 7 的表 达为阴性1 2 例，弱阳性5 例，中度阳性7 例，强阳性6 例；有淋巴结转 移者k i 6 7 的表达为阴性1 2 例，弱阳性7 例，中度阳性1 1 例，强阳性2 0 例。经两独立样本秩和检验，k i 6 7 在胃癌组织中的阳性率明显高于胃正 常组织( 尸铆0 5 ) ，高、中分化胃癌的表达低于低分化胃癌的表达( p 如0 5 ) ， 伴有淋巴结转移的胃癌组织k i 6 7 较无转移病例阳性率高( 尸妃仿) 。 3 c y c l i n d l 阳性信号主要表达于细胞核。1 0 例正常胃组织标本中， c y c l i n d l 的表达为阴性6 例，弱阳性3 例，中度阳性1 例，强阳性0 例； 8 0 例胃癌组织标本中，c y c l i n d l 的表达为阴性2 8 例，弱阳性1 0 例，中 度阳性2 0 例，强阳性2 2 例。其中高中分化者c y c l i n d l 的表达为阴性1 7 例，弱阳性7 例，中度阳性7 例，强阳性4 例；低分化者c y c l i n d l 的表 达为阴性11 例，弱阳性3 例，中度阳性1 3 例，强阳性18 例；无淋巴结 转移者c y c l i n d l 的表达为阴性15 例，弱阳性6 例，中度阳性4 例，强阳 性5 例；有淋巴结转移者c y c l i n d l 的表达为阴性1 3 例，弱阳性4 例，中 度阳性1 6 例，强阳性1 7 例。经两独立样本秩和检验，c y c l i n d l 在胃癌 组织中的表达明显高于胃正常组织彻0 5 ) ，高、中分化胃癌的表达高于 低分化胃癌的表达( 尸如p 5 ) ，伴有淋巴结转移的胃癌组织c y c l i n d l 较无 转移病例阳性率较高锄0 5 ) 。 结论： 1p 1 6 在胃癌组织中的表达明显低于胃正常组织，高、中分化胃癌的 表达高于低分化胃癌的表达，伴有淋巴结转移的胃癌组织较无淋巴结转移 者p 1 6 标记阳性率低。 2k i 6 7 在胃癌组织中的标记阳性率明显高于胃正常组织，高、中分 化胃癌的表达低于低分化胃癌的表达，伴有淋巴结转移的胃癌组织较无淋 巴结转移者飚6 7 标记阳性率高。 3c y c l i n d l 在胃癌组织中的表达明显高于胃正常组织，高中分化胃癌 的表达低于低分化胃癌的表达，伴有淋巴结转移的胃癌组织较无淋巴结转 移者c y c l i n d l 标记阳性率高。 4 在胃癌组织中标记p 1 6 、k i 6 7 和c y c l i n d l 有助于诊断、分化程度 的确定；以及有助于是否发生淋巴结转移风险的预测。 中文摘要 关键词：胃癌分化；p 16 ； k i 6 7 ； c y c l i n d l ；免疫组化 3 英文摘要 r e s e a r c ho nt h er e l a t i o n s h i po ft h ee x p r e s s i o no fp 1 6 、k i 6 7a n d p r o t e i no fc y c l i n d 1w i t hg a s t r i cc a r c i n o m a a b s t r a c t o b je c t i v e g a s t r i cc a n c e ri so n eo ft h em a l i g n a n tt u m o r s ，t h em o r b i d i t y a n dm o r t a l i t yo ft h ed i s e a s ei si nt h ef i r s tp l a c ei nc h i n a i tp r o v e dt h a tg a s t r i c c a n c e ri sr e l a t e dw i t hm u t a t i o na n dd e f i c i e n c yo fs u p p r e s s o rg e n eo fp16a n d a c t i v a t i o no fp r o t o - o n c o g e n e so fc y c l i n d1a n dt h e o v e r e x p r e s s i o n o f p r o l i f e r a t i n ga n t i g e nk i 一6 7 i tp r o v i d e san e we f f e c t i v ed r u gt a r g e tf o rt h e t r e a t m e n to fg a s t r i cc a r c i n o m ab yd e t e c t i n gt h ee x p r e s s i o no fp16 、k i 6 7a n d p r o t e i n o fc y c l i n d1i nn o r m a lt i s s u ea n dt u m o ro fg a s t r i cm u c o s ab y i m m u n o h i s t o c h e m i s t r yt r a c i n g m e t h o d ：t h es p e c i m e no f8 0c a s e so fr e s e c tt h et i s s u e so fg a s t r i ct u m o r s c o n f i r m e dp a t h o l o g i c a l l yi nt h ea f f i l i a t e d h o s p i t a lo fc h e n g d em e d i c a l c o l l e g ef r o ms p e 2 0 0 8t om a r 2 0 10 t h en o r m a lt i s s u eo f10c a s e sg a s t r i c m u c o s a w ea n a l y s e ds t a t i s t i c a l l yt h ee x p r e s s i o no fpl6 、k i 一6 7a n dp r o t e i no f c y c l i n d 1i nn o r m a lt i s s u ea n dt u m o r o f g a s t r i c m u c o s a b y i m m u n o h i s t o c h e m i s t r yt r a c i n g r e s u l t ：1p16p o s i t i v es i g n a lw a sm a i n l ye x p r e s s e di nt h en u c l e u s i n 10c a s e so fn o r m a lg a s t r i ct i s s u e s ，p 16e x p r e s s i o nw a sn e g a t i v ei n1 c a s e ，1 c a s eo fw e a k l yp o s i t i v e ，m o d e r a t e l yp o s i t i v ei n3c a s e s ，s t r o n g l yp o s i t i v ei n5 c a s e s i n8 0c a s e so fg a s t r i cc a n c e rt i s s u e s ，p16e x p r e s s i o nw a s n e g a t i v ei n51 c a s e s ，14c a s e sw e r ew e a k l yp o s i t i v e ，m o d e r a t e l yp o s i t i v ei n9c a s e s ，s t r o n g l y p o s i t i v e i n6c a s e s f o rt h e e x p r e s s i o n o fi ti n h i g h a n dm o d e r a t e d i f f e r e n t i a t i o ng a s t r i cc a n c e r ，t h ee x p r e s s i o no f p l6w e r en e g a t i v ei n16c a 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o d e r a t e l yp o s i t i v e ，s t r o n g l yp o s i t i v ei n 一7t 、 一 一 2 0c a s e s to rt h ee x p r e s s l o no fl ti nh i 曲a n dm o d e r a t ed i f f e r e n t i a t i o ng a s t r i c c a n c e r , k i - 6 7w e r en e g a t i v ei n16c a s e s ，9c a s e sw e r ew e a k l yp o s i t i v e ， m o d e r a t e l yp o s i t i v ei n6c a s e s ，4c a s e sw e r es t r o n g l y p o s i t i v e ；p o o r l y d i f f e r e n t i a t e db yt h ee x p r e s s i o no fk i 一6 7w a sn e g a t i v ei n14c a s e s ，w e a k l y p o s i t i v ei n 14c a s e s ，m o d e r a t ep o s i t i v ei n4c a s e s ，s t r o n gp o s i t i v e0 c a s e ； w i t h o u tl y m p hn o d em e t a s t a s i s ，k i 6 7e x p r e s s i o nw a sn e g a t i v ei n12c a s e s e a k l , 一 5 ，7 m o d e r a t e l yp o s i t i v e 。s t r o n g l ytinweakly p o s i t i v ei n c a s e s7w e r em o d e r a t e l yo o s i t i v es t r o n g l yo o s i t i v e n6，i c a s e s ；l y m p hn o d em e t a s t a s i s ，t h ee x p r e 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婶 o o 父 c o n c l u s i o n ：it h ee x p r e s s i o no fp16i ng a s t r i cc a r c i n o m at i s s u ew a s s i g n i f i c a n t l yl o w e rt h a nt h a ti nn o r m a lg a s t r i ct i s s u e ，t h ep o s i t i v ee x p r e s s i o no f p16i nh i g ha n dm o d e r a t ed i f f e r e n t i a t i o ng a s t r i cc a n c e rw a s s u p e r i o rt ot h a ti n l o wd i f f e r e n t i a t i o no n e ，a n dt h ep o s i t i v e e x p r e s s i o no fp 16o fl y m p hn o d e m e t a s t a s i s g r o u pw a ss i g n i f i c a n t l y l o w e rt h a nt h a to fw i t h o u t l y m p h n o d e m e t a s t a s i sg r o u p 2t h ee x p r e s s i o no fk i - 6 7i n g a s t r i cc a r c i n o m at i s s u ew a ss i g n i f i c a n t l y h i g h e rt h a nt h a ti nn o r m a lg a s t r i ct i s s u e ，t h ep o s i t i v ee x p r e s s i o no fk i 一6 7i n h i g ha n dm o d e r a t ed i f f e r e n t i a t i o ng a s t r i cc a n c e rw a si n f e r i o rt ot h a ti nl o w d i f f e r e n t i a t i o no n e ，a n dt h ep o s i t i v e e x p r e s s i o no fk i - 6 7o fl y m p hn o d e m e t a s t a s i sg r o u pw a ss i g n i f i c a n t l y h i g h e rt h a nt h a to fw i t h o u tl y m p h n o d e m e t a s t a s i sg r o u p 3t h ee x p r e s s i o no fc y c l i n d1i ng a s t r i cc a r c i n o m at i s s u ew a s s i g n i f i c a n t l y h i g h e rt h a nt h a ti nn o r m a lg a s t r i ct i s s u e ，t h ep o s i t i v ee x p r e s s i o no fc y c l i n d1i n h i g ha n dm o d e r a t ed i f f e r e n t i a t i o ng a s t r i cc a n c e rw a si n f e r i o rt ot h a ti nl o w 6 英文摘要 d i f f e r e n t i a t i o no n e ，a n dt h ep o s i t i v ee x p r e s s i o no fc y c l i n d1o fl y m p hn o d e m e t a s t a s i s g r o u p w a s s i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a n t h a to fw i t h o u tl y m p h n o d e m e t a s t a s i sg r o u p 4 i ns t o m a c ht i s s u em a r k e r sk i 一6 7 、p16a n dc y c l i n d1i sh e l p f u lt ot h e d i a g n o s i s ，t h ed e t e r m i n a t i o no fd i f f e r e n t i a t i o nd e g r e e ，a n dh e l pi fa nl y m p h n o d em e t a s t a s i sr i s k p r e d i c t i o n k e y w o r d s ：g a s t r i c c a r c i n o m a ；p 16 ；k i 一6 7 ；c y c l i n d 1 ； i m m u n o h i s t o c h e m i s t 7 研究论文 p 1 6 、k i 6 7 、c y c l i n d l 在胃癌中表达的研究 - j - 刖舌 胃癌( g a s t r i cc a r c i n o m a ) 是我国常见的恶性肿瘤之一，在胃的恶性肿 瘤中，腺癌占9 5 ，在我国其发病率居各类肿瘤的首位。我国胃癌死亡率 为2 5 2 1 0 万，其中男性3 2 8 1 0 万，女性1 7 0 1 0 万，约占人类全部恶性肿 瘤死亡的2 3 2 e 1 1 ，然而关于胃癌的发生和发展过程的研究即发病机制的 研究，目前尚未完全搞清楚，因此胃癌的发生和发展的研究即发病机制的 研究就成为了目前的研究重点。 胃癌的发生、发展是多种原癌基因的活化和多种抑癌基因的失活造成 的，是多种遗传改变累积的结果【2 】。研究表明，抑癌基因p 1 6 的突变和缺失 及原癌基因c y c l i n d l 的激活和核增殖抗原k i 6 7 的过表达与胃癌的发生发 展及转移有关系，成为目前肿瘤研究的热点。 p 1 6 基因( i n k 4 a ) 是1 9 9 4 年k a m b 等口3 首先发现新型的抑癌基因， 其表达产物p 1 6 蛋白通过抑制c d k 4 和c d k 6 使r b 蛋白磷酸化减少， 从而阻断c y c l i n d 、r b 等介导的转录因子e 2 f 的活化，抑制细胞增殖【4 】。 p 1 6 基因的变异或其蛋白的失活会导致c y c l i n d c d k 4 6 - p r b e 2 f 调节途 径的失控，而使细胞过度增殖，导致肿瘤发生。 k i 6 7 是一种核增殖抗原【5 1 ，可姑6 7 只表达于增殖期细胞，其表达的 高低反映了细胞增殖状态。研究表明在多种实体恶性肿瘤中l ( i 6 7 的表达 远高于正常组织，并与恶性肿瘤的发生，转移及预后有关，有可能作为确 定癌前人群高危个体的生物标志物【6 】，并有助于评估预后。 细胞周期素1 ( c y c l i n d l ) 作为细胞周期重要的正调控因子。其表达异常 引起的细胞周期失控是细胞异常增殖和癌变的原因，可能是胃癌发生的早 期分子事件。 本实验通过比较p 1 6 、k i 6 7 及c y c l i n d l 蛋白在正常胃组织及腺癌中 的表达来分析三者与胃癌分化程度、淋巴结转移的关系，为研究胃癌的发 生、发展及预后判断提供理论依据，同时也为临床治疗胃癌提供新的作用 靶点。 研究论文 材料与方法 1 材料 1 1 标本的收集：收集承德医学院附属医院2 0 0 8 年9 月至2 0 1 0 年3 月手 术切除经病理证实的胃癌组织标本8 0 例，正常胃组织( 距离肿瘤3 c m 以 外) 10 例。其中高中分化者3 5 例，低分化者4 5 例；无淋巴结转移3 0 例； 有淋巴结转移5 0 例。 1 2 标本的处理：标本切除后均立即浸入1 0 中性福尔马林固定液中，取 材2 x 2 c m ，厚3 m m 的组织块，经常规石蜡包埋切片，切片厚4 1 t m 。 1 3 试剂：鼠抗人p 1 6 抗体、鼠抗人k i 6 7 抗体、鼠抗人c y c l i n d l 抗体、即 用型d a b 显色试剂盒购( d a b 0 0 3 1 ) 及即用型免疫组化试剂盒羊抗鼠 兔，均购自福州迈新生物技术开发有限公司。二甲苯、乙醇、3 过氧化 氢、枸橼酸钠、苏木素、氨水及中性树胶等常规试剂购自北京化学试剂公 司。 1 4 仪器：全自动脱水机( 英国s h a n d o nt h r m o 公司产品) ，s 3 2 5 石蜡切片 机( 英国s h a n d o n 公司产品) ，g 2 x d h 4 0 x 4 5 电热恒温箱( 山东立鹤公司 产品) ，微波炉( 英国g a l a n z 公司产品) ，4 。c 冰箱( h a i e r 公司产品) ，b x 4 0 f 4 显微镜( 日本o l y m p u s 公司产品) ，显微照相系统( 日本o l y m p u s 公司产品) ， 病理图文分析系统产品。 2 方法 2 1 免疫组织化学方法 2 1 1 正常胃组织与胃癌组织常规石蜡包埋后，连续切片4 9 r n ( 玻片用多聚 赖氨酸作防脱片处理) 。 2 1 2 切片以二甲苯脱蜡及系列乙醇入水。 2 1 3p b s 洗5 m i n ，以3 h 2 0 2 孵育1 0 m i n ( 室温) 。 2 1 4 p b s 洗2 x 6 m i n 后在微波炉中进行抗原修复。 2 1 5 加正常山羊血清工作液进行封闭，在3 7 湿盒中温育6 0 m i n 。 2 1 6 分别加p 16 抗体，k i 6 7 抗体及c y c l i n d l 抗体在3 7 。c 湿盒中温育6 0 m i n 后，在湿盒中4 。c 过夜。 2 1 7p b s 洗3 x 5 m i n ，滴加i i 抗( 快捷型酶标羊抗鼠兔i gg 聚合物) ，室温 孵育1 5 m i n 。 研究论文 2 1 8p b s 洗3 x 5 m i n ，d a b 显色5 m i n ，蒸馏水冲洗终止显色，苏木素复 染核。2 1 9 封片，观察，另外，组织切片用p b s 替代p 1 6 抗体，k i 6 7 抗体及c y c l i n d l 抗体( 其余染色步骤相同) 作为阴性对照，阳性对照为 已知k i 6 7 和c y c l i n d l 阳性的胃癌标本及已知p 1 6 阳性的正常胃组织标 本。 2 2 免疫组化结果判定方法 每例均随机观察5 个高倍视野( x 4 0 0 ) 下的1 0 0 个细胞，用半定量积 分法判断结果：阳性细胞占总细胞的百分率 5 o 为0 分，5 o 2 5 o 为1 分，2 5 o 一5 0 o 为2 分，5 0 旺7 5 o 为3 分，7 5 o 一1 0 0 为4 分； 阳性程度以黄色为1 分，棕色为2 分，棕褐色为3 分；表达强度以两者几 分相乘表示，0 为阴性( 一) 1 3 分为弱阳性( + ) ，4 8 分为中度阳性( + + ) ，9 1 2 分为强阳性( - a t - + + ) 。 3 统计学处理 实验资料的统计学处理通过s p s s l l 5 统计软件完成，计数资料采用 两样本比较的秩和检验( w i l c o x o n 两样本比较法) ，以p o 0 5 为差异有 显著性。 结果 1 正常胃组织p 1 6 阳性信号主要表达于细胞核。在1 0 例正常胃组织 标本中，p 1 6 的表达为阴性1 例，弱阳性l 例，中度阳性3 例，强阳性5 例；8 0 例胃癌组织标本中，p l6 的表达为阴性51 例，弱阳性1 4 例，中度 阳性9 例，强阳性6 例。其中高中分化者3 5 例，低分化者4 5 例，无淋巴 结转移者3 0 例，有淋巴结转移者5 0 例。高中分化者p 16 的表达为阴性 l6 例，弱阳性9 例，中度阳性6 例，强阳性4 例；低分化者p 16 的表达 为阴性3 5 例，弱阳性5 例，中度阳性3 例，强阳性2 例；无淋巴结转移 者p l6 的表达为阴性1 1 例，弱阳性8 例，中度阳性5 例，强阳性6 例； 有淋巴结转移者p 1 6 的表达为阴性4 0 例，弱阳性6 例，中度阳性4 例， 强阳性0 例。经两独立样本秩和检验，p 1 6 在胃癌组织中的表达低于在正 常胃组织中的表达，胃癌组织中高中分化者p 16 的表达高于低分化者的表 达，胃癌组织中无淋巴结转移者p 1 6 的表达高于有淋巴结转移者的表达， 研究论文 且差异有显著性( 户 d 0 5 ，p o 0 5 ，尸 a 0 5 ，t a b l ，f i 9 4 ，5 ，6 ) 。 2 正常胃组织k i 6 7 阳性信号主要表达于细胞核。在l o 例正常胃组 织标本中，k i 6 7 的表达为阴性5 例，弱阳性4 例，中度阳性l 例，强阳 性0 例；8 0 例胃癌组织标本中，k i 6 7 的表达为阴性2 4 例，弱阳性12 例， 中度阳性18 例，强阳性2 6 例。其中高中分化者3 5 例，低分化者4 5 例， 无淋巴结转移者3 0 例，有淋巴结转移者5 0 例。高中分化者k i 6 7 的表达 为阴性1 6 例，弱阳性9 例，中度阳性6 例，强阳性4 例；低分化者k i 6 7 的表达为阴性1 4 例，弱阳性1 4 例，中度阳性4 例，强阳性0 例；无淋巴 结转移者k i 6 7 的表达为阴性1 2 例，弱阳性5 例，中度阳性7 例，强阳 性6 例；有淋巴结转移者k i 6 7 的表达为阴性1 2 例，弱阳性7 例，中度 阳性l l 例，强阳性2 0 例。经两独立样本秩和检验，k i 6 7 在胃癌组织中 的表达高于在正常胃组织中的表达，胃癌组织中高中分化者k i 6 7 的表达 低于低分化者的表达，胃癌组织中无淋巴结转移者k i 6 7 的表达低于有淋 巴结转移者的表达，且差异有显著性伊 n0 5 ，尸 n0 5 ，尸 伊0 5 ， t a b 2 ，f i 9 7 ，8 ，9 ) 。 3 正常胃组织c y c l i n d l 阳性信号主要表达于细胞核。在1 0 例正常 胃组织标本中，c y c l i n d l 的表达为阴性6 例，弱阳性3 例，中度阳性1 例， 强阳性0 例；8 0 例胃癌组织标本中，c y c l i n d l 的表达为阴性2 8 例，弱阳 性1 0 例，中度阳性2 0 例，强阳性2 2 例。其中高中分化者3 5 例，低分化 者4 5 例，无淋巴结转移者