（海洋生物学专业论文）青岛文昌鱼p23基因的克隆、鉴定、表达、纯化和功能分析.pdf

中国海洋大学博士学位论文 青岛文昌鱼p 2 3 基因的克隆、鉴定、 表达、纯化和功能分析 摘要 p 2 3 蛋白作为热激蛋白9 0 ( h s p 9 0 ) 的辅助分予伴侣( c o c h a p e r o n e ) ，在真 核细胞内对许多重要的调控因子和信号蛋白具有调节作用。文昌鱼( a m p h i o x u s ) 是介于无脊椎动物和脊椎动物之间的过渡类型，是研究脊椎动物进化的珍贵材 料。利用分子生物学手段和生物信息学方法，研究文昌鱼p 2 3 基因的结构、进 化和表达，可以揭示文昌鱼p 2 3 基因与无脊椎动物和脊椎动物p 2 3 基因之间的 相互关系及其表达模式的异同，有助于从分子水平上阐释脊椎动物的起源和进 化。本文从青岛文昌鱼( b r a n c h i o s t o m ab e l c h e r it s i n g t a u n e s e ) 肠c d n a 文库( 本 实验室保存) 中，克隆了具有完整编码框的p 2 3 基因( a m p h i p 2 3 ) ，并对其结 构、表达和进化展开了研究。a m p h i p 2 3 全长1 4 5 5 b p ，编码1 7 0 个氨基酸组成 的蛋白。该蛋白在氨基酸水平上与人、小鼠、鸡、爪蟾、斑马鱼、海鞘、果蝇、 线虫等的p 2 3 蛋白的相似性为2 5 3 一3 4 7 ，与人的t s p 2 3 相似性为2 1 2 ，且 具有典型的p 2 3 保守域( 8 一“4 残基) 和p 2 3 蛋白共有的保守残基( 8w 7 9 k ，8 6w 8 9 l ，1 0 6 w , 人的氨基酸序号) 。系统进化分析发现，无脊椎动物和脊椎动物p 2 3 蛋白分化为两个组群，而a m p h i p 2 3 介于脊椎动物和无脊椎动物p 2 3 蛋白之间， 说明脊椎动物和无脊椎动物p 2 3 基因是在5 5 亿年前由共同的祖先分化而成。 人t s p 2 3 蛋白位于脊椎动物进化枝的基部，说明t s p 2 3 可能比脊椎动物p 2 3 蛋白 更原始，脊椎动物p 2 3 和t s p 2 3 可能是由类似于文昌鱼a m p h i p 2 3 基因发生了基 因倍增形成的。 n o r t h e r nb l o t 结果表明，a m p h i p 2 3 在文昌鱼成体组织审、泛表达( 包括脊 索、鳃、肌肉、肠、精巢和卵巢) ，相反，人p 2 3 在小鼠表达于除心脏和骨骼肌 之外的所有组织( 肝、l 学、肺、胸腺、卵巢、脾和胃) ，而人t s p 2 3 基因的表达 则仅限丁心脏和骨骼肌，这种人p 2 3 和t s p 2 3 在小鼠的互补表达图式与a m p h i p 2 3 广泛表达可能说明，p 2 3 在发生基因倍增形成p 2 3 和t s p 2 3 之前，是广泛表达， 而到脊椎动物卅现两个基因和功能l 的分化。原位杂交分析表明，a m p h i p 2 3 在 文昌鱼早期神经胚的近轴中胚层、脊索和神经管开始表达，随着神经胚的发育， 中国海洋大学博士学位论文 转录发生在体节中胚层和神经管的前部，到一天幼虫，a m p h i p 2 3 在脑泡的背部、 后部体节和表皮细胞中表达，而二天幼虫则主要在脑泡表达，在身体的其它部 分也有微弱信号，说明a m p h i p 2 3 可能与前后轴形成有关。 利用原核表达系统表达并纯化了文昌鱼p 2 3 的融合蛋白，获得了分子量大 约为2 2 k d a 的纯化蛋白，n 末端测序表明蛋白表达正确。利用融合蛋白制备了 多克隆抗体，w e s t e r n b l o t 结果表明，抗体能与文昌鱼p 2 3 蛋白特异性杂交。另 外，我们免疫组织化学的结果初步表明，p 2 3 在成体各种组织中分布，证明文 昌鱼p 2 3 蛋白在生物体内是一个广泛分布并具有多重功能的蛋白质。 生物信息学分析发现，p 2 3 蛋白是带有较多净负电荷的酸性蛋白，文昌鱼p 2 3 蛋白具有p 2 3 蛋白大多数的特征性结构，与其它p 2 3 蛋白的氨基酸序列具有相同 的疏水性趋势。文昌鱼p 2 3 蛋白同源模建的三维结构表明，其组成残基的9 8 2 位于合理位置，与人p 2 3 蛋白三维结构比较发现，其表面保守残基和表面静电势 具有较高的相似性，因此，我们认为文昌鱼p 2 3 蛋白的三维结构的模建是合理的， 并推断文昌鱼p 2 3 蛋白在体内可能具有和其同源蛋白相同的功能。 关键词：青岛文昌鱼p 2 3 克隆进化表达多克隆抗体同源模建 中国海洋大学博士学位论文 a m p h i o x u sp 2 3g e n e ：c l o n i n g ，c h a r a c t e r i z a t i o n ， e x p r e s s i o na n dp u r i f i c a t i o no fr e c o m b i n a n tp r o t e i na n d a n t i b o d yp r o d u c t i o n a b s t r a c t t h em o l e c u l a rc h a p e r o n ep 2 3i sac o f a c t o ro ft h eh s p 9 0p r o t e i nt h a tp l a y sa c r i t i c a lr o l ei nt h ef o l d i n go fas e r i e so fi m p o r t a n tr e g u l a t o r so fc e l l u l a rf u n c t i o n i ti s r e q u i r e df o rt h ep r o p e rf o l d i n go fm a n ys i g n a l i n gp r o t e i n sa n do n l yf o u n di n e u k a r y o t e s a m p h i o x u s ，ac e p h a l o c h o r d a t e ，i st h ec l o s e s tl i v i n gr e l a t i v et ov e r t e b r a t e ， a n dh a sb e e nw i d e l yk n o w na st h em o s ti m p o r t a n ta n i m a lt oa n a l y z et h eo r i g i na n d e v o l u t i o no fv e r t e b r a t e s s t u d yo nt h eg e n es t r u c t u r e ，f u n c t i o na n de x p r e s s i o ni n a m p h i o x u sw i l lc o n t r i b u t et ot h eu n d e r s t a n d i n go ft h eo r i g i na n de v o l u t i o no ft h e v e r t e b r a t e s i nt h i sp a p e r , a m p h i p 2 3 ，e n c o d i n ga l la m p h i o x u sp 2 3p r o t e i n ，w a si d e n t i f i e d f r o mt h eg u tc d n a l i b r a r yo f b r a n c h i o s t o m ab e l c h e r it s i n g t a u n e s e i tc o n t a i n sa5 1 3 b po p e nr e a d i n gf r a m ec o r r e s p o n d i n gt oad e d u c e dp r o t e i no f1 7 0a m i n oa c i d s p h y l o g e n e t i ca n a l y s i ss h o w st h a tv e r t e b r a t ea n di n v e r t e b r a t ep 2 3 p 2 3 - l i k ep r o t e i n s a r ee a c hg r o u p e dt o g e t h e r ，w i t ha m p h i p 2 3 f a l l i n g a tt h eb a s eo fv e r t e b r a t e p 2 3 p 2 3 一l i k ec l a d e ，s u g g e s t i n gt h a tt h ed i v e r g e n c eo fv e r t e b r a t ea n di n v e r t e b r a t ep 2 3 g e n e sp r o b a b l yo c c u r sp r i o rt ot h es p l i to fi n v e r t e b r a t e v e r t e b r a t ef r o mac o m m o n a n c e s t o ra r o u n d5 5 0m i l l i o n y e a r s a g o ，n o r t h e r nb l o t t i n gr e v e a l sau b i q u i t o u s e x p r e s s i o np a u e mo fa m p h i p 2 3i na l lt i s s u e se x a m i n e do fa d u l t s ，w h i l ew h o l e m o u n ti ns i t uh y b r i d i z a t i o nd e m o n s t r a t e sht i s s u e - a n ds t a g e s p e c i f i ce x p r e s s m n p a t t e r no f a m p h i p 2 3i nd e v e l o p i n ge m b r y o sa n dl a r v a e p r e s u m a b l y ，t h eu b i q u i t o u s e x p r e s s i o np a t t e r no f a m p h i p 2 3i na d u l t ；a m p h i o x u sr e p r e s e n t st h ea n c e s t r a lt y p eo f p 2 3g e n ep r i o ri oi t ss p l i tt oh u m a np a r a l o g sp 2 3a n dt s p 2 3 ，w h i l et h et i s s u e a n d s t a g e s p e c i f i ce x p r e s s i o np a n 。e md u r i n ge a r l ye m b r y o n i cd e v e l o p m e n ti m p l i c a t e sa r o l eo fa m p h i p 2 3i na n t e r i o r p o s t e r i o rp a t t e r n i n g t h er e c o m b i n a n tp 2 3o fa m p h i o x u sh a sb e e np r o d u c e da n dp u r i f i e d t h ec d n a 中国海洋大学博士学位论文 o fa m p h i o x u sp 2 3w a sc l o n e di n t oap g e x - 6 - p - - 1b a c t e r i ae x p r e s s i o nv e c t o ra n d g s t - t a g g e df u s i o np r o t e i n sw e r ep r o d u c e di ne s e h e r i e h i ae o l id h 5 uc e l l s p u r e r e c o m b i n a n tp 2 3p r o t e i n sw e r eo b t a i n e db ya f f i n i t yp u r i f i c a t i o n t h em o l e c u l a r w e i g h tw a se s t i m a t e dw i t h2 2k d ab ys o d i u md o d e c y ls u l f a t e - p o l y a c r y l a m i d eg e l e l e c t r o p h o r e s i s t h en - t e r m i n a lo fp 2 3w a ss e q u e n c e d ，w h i c hc o r r e l a t e sw i t ht h e s e q u e n c e sf r o mt h ed e d u c e da m i n oa c i do fa m p h i o x u sp 2 3 t h es p e c i f i cp o l y c l o n a l a n t i b o d i e sa g a i n s tt h ep 2 3p r o t e i nw a sd e v e l o p e d w e s t e r nb l o ts h o w e dt h a tt h e a n t i b o d i e sa l s or e a c t e dw i t ht h et o t a lp r o t e i n se x t r a c t e df r o ma d u l ta m p h i o x u s ， f o r m i n gas i n g l ep o s i t i v eb a n do f - 2 2 k d a t h ea p p a r e n tm o l e c u l a rm a s so fp 2 3 r e v e a l e db yw e s t e r nb l o t t i n gi nb o t hc a s e sw e r ea p p r o x i m a t e l y2 2k d a ，w h i c hi s s l i g h t l yh i g h e rt h a tt h ep r e d i c t e do n e ( 1 9 5k d a ) i ti sh i g h l yl i k e l yt h a tt h ei n c r e a s e i nm o l e c u l a rm a s si sd u et op o s t - t r a n s l a t i o n a lm o d i f i c a t i o n so c c u r r i n gi n s i d eb o t h a m p h i o x u sa n dec o l ic e l l s i na d d i t i o n ，t h ei m m u n o h i s t o c h e m i s t r ys h o w e d t h a tp 2 3 l o c a t e di na l lt i s s u e so fa d u l ta m p h i o x u s ，w h i c hi n d i c a t e dt h ep 2 3w a sam u l t i p l e f u n c t i o n a lp r o t e i n a m p h i o x u sp 2 3p r o t e i na n a l y s i sw i t hb i o i n f o r m a t i o nr e v e a l e dt h a ti ti sa na c i d p r o t e i na n ds h a r e st h ed i r e c t i o no fh y d r o p h o b ew i 1o t h e rp 2 3p r o t e i n s h o m o l o g y m o d e l i n go fa m p h i o x u sp 2 3p r o t e i nw a se v a l u a t e db yp r o c h e c k 9 8 2 o fa m i n o a c i d sw e r el o c a t e di nr e a s o np o s i t i o n s c o m p a r a t i o nw i t hh u m a np 2 3t h r e e d i m e n t i o n a ls t r u c t u r eo fk e yr e s i d u e sa n de l e c t r o s t a t i cs t a t e si nt h es u r f a c eo f p r o t e i n ss h o w e dt h a tt h e yw e r eg r e a t l ys i m i l a r i t yi nt h ep o s i t i o n sa n dn u m b e r s t h e r e s u l t si n d i c a t e dt h a ta m h i o x u sp 2 3w a st h eh o m o l o go fh u m a np 2 3p r o t e i n sa n d p l a y e dt h es i m i l a rf u n c t i o n si nt h ea n i m a l s k e yw o r d s ：a m p h i o x u s ，p 2 3 ，g e n es t r u c t u r e ，p h y l o g e n e t i ca n a l y s i s ，e x p r e s s i o n ， p o l y c l o n a la n t i b o d y , h o m o l o g ym o d e l i n g 中国海洋大学博士学位论文 缩略语 a m p ( a m p i c i l l i n ) b p ( b a s ep a i r ) b s a 0 3 0 v i n es e r u ma l b u m i n ) e d n a ( c o m p l e m e n t a r yd n a ) d a ( d a l t o n ) d e p c ( d i e t h y lp y r o c a r b o n a t e ) d m s o ( d i m e t h y ls u l f o x i d e ) d n t p ( d e o x y r i b o n u c l e o s i d et r i p h o s p h a t e ) d t t ( d i t h i o t h r e i t 0 1 ) e b t h i d i 啪b r o m i d e ) e c o n ( e s c h e r i c h i ac o l o e d t a ( t h y l e n e d i a m i n e t e t r a a c e t i ca c i d ) g s t ( g l u t h i o n es - t r a n s f e r a s e ) h r ( h o u o k b ( k i l o b a s e ) k d a ( k i l o d a l t o n ) i p t g ( i s o p r o p y l t h i o n b - d g a l a e t o s i d e ) m o p s ( 3 一( n - m o r p h o l i n o ) p r o p a n e s u l f o n i ca c i d ) m r n a ( m e s s e n g e rr n a ) o r f ( o p e nr e a d i n gf r a m e ) u t r ( u n t r a n s l a t e dr e g i o n ) p b s ( p h o s p h a t eb u f f e r e ds a l i n e ) p c r ( p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ) r t - p c r ( r e v e r s et r a n s c r i p t a s e p c r l r n a s ea ( r n ae n z y m ea 、 r p m ( r e v o l u t i o np e rm i n u t e ) s d s ( s o d i u md o d e c y ls u l f a t e ) i r i s ( t r i s 一( h y d r o x y m e t h y l ) 一a m i n o m c t h a n e ) s ( s e c o n d ) v ( v o l t a g e ) 氨卞青霉素 碱基对 牛血清白蛋白 互补d n a 道尔顿 焦碳酸二乙酯 二甲基亚砜 脱氧核糖核苷三磷酸 二硫苏糖醇 溴化乙锭 大肠杆菌 乙二胺四乙酸 谷胱甘肽硫转移酶 小时 千碱基对 千道尔顿 异丙基硫代半乳糖苷 3 ( n 一玛琳代) 丙黄酸 信使r n a 框开放阅读 非翻译 磷酸盐缓冲液 多聚酶链式反应 逆转录酶一多聚酶链式反应 核糖核酸酶a 每分钟转数 十二烷基硫酸钠 三( 羟甲基) 氨基甲烷 秒钟 电压 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过晌研究成果，也不包岔未获得 l 逵! 翅遗直墓熊盂要壁 型直盟鲍! 奎拦丑窒2 或其他教育机构的学位或证书使用过的材料。与我同工作的 同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学一名拗特噍z o o e 年月j 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向l 弼 家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许沦文被查阅和借i j 。本人授权学校 可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数掘库进行检索，可以采用影印、缩印或 扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作荷签名 黝孵雅 签字f _ _ 1 期： 年月f j 签字闩期；年月f l 学位论文作者毕业后去向 1 ：作单位： 通i f 址止址： 电话 邮编 青岛文昌鱼p 2 3 基因的克隆、鉴定、表达、纯化和功能分析 第一章文献综述 l 发育生物学和进化生物学研究的模式动物- 文昌鱼 文昌鱼属脊索动物门头索动物亚门。由于其成体结构与脊椎动物有相 似之处但又具有不同的特征，因此，文昌鱼被认为是现存的与脊椎动物最 为接近的原索动物( h o l l a n de ta 1 ，2 0 0 4 ) 。随着分子生物学技术应用于文昌 鱼研究，文昌鱼在生物发育和进化中的作用和地位被愈来愈凸现出来。文 昌鱼基因组大小是人类基因组的1 7 ，相对于人类基因组大小5 的尾索动 物而言，其基因组异化较少( h o l l a n d 等，2 0 0 3 ；d e h a l 等，2 0 0 2 ；c a s t r o 等，2 0 0 4 ) 。如文昌鱼有一个h o x 基因簇包含1 4 个h o x 基因( h o x l 4 是文 昌鱼经独立基因复制而产生) ，而尾索动物的一个基因簇丢失了4 个h o x 基因( h 筛7 9 ，h o x l l ) ，并且这个基因簇分裂成5 个不同的支架结构 ( s c a f f o l d s ) ( h o l l a n d 等，2 0 0 3 ：d e h a l 等，2 0 0 2 ) 。所以，文昌鱼是最被 推崇的接近古老脊椎动物的现存模式动物( 图1 1 ) 。 龟耵州跳脚 f i g 1 1t h ea m p h i o x u sh o xc l u s t e lw i t h1 4c o l i n e a rg e n e si sag o o dp r o t o t y p ef o rt h a to f t i l ea n c e s t r a lv e r t e b r a t e 图1 1 文吕鱼h o x 基因簇及其与其它生物的进化关系 l 青岛文昌鱼p 2 3 基因的克隆、鉴定、表达、纯化和功能分析 传统的以人类为中心的后口动物进化图已经取得了很大进展( 图 1 2 a ) ，但是，仍然有许多海洋生物的问题不能解释，例如，半索动物或柱 头虫鳃裂的形成、海鞘的背部管状神经索、肌肉的分节、脊索的形成及信 号传导等问题一直是生物学家探索进化的主要问题。后口动物以其特有的 对称，奇特的骨架被定义为进化图中的顶层。很久以前，人们认为半索动 物与棘皮动物形成一个分离的进化枝，这种观点由于文昌鱼和脊椎动物之 间形态学和分子生物学方面实验证据的相似性而得到了很多支持( 图 1 2 b ) 。最近，应用一系列同源分析法和大量基因组资料分析认为，文昌鱼 既不是最靠近脊椎动物，也不是最靠近海鞘的动物，而是与棘皮动物同族 的动物，海鞘是最接近脊椎动物的观点( 图1 2 c ) ( g e e2 0 0 6 ) 。这显然 与从前基于形态学研究结果得出的结论不一致。文昌鱼被认为是脊椎动物 进化过程中的一个模式动物，其在进化过程中的地位还需要包括基因组测 序等工作的支持和证据。 e 曲i n o 画# ”t h e m d m d m 1 “n i c a t e ( s o 斑i 乱口d k t 纰3 v o 妇t e e f i m a d e r n 噬 h e n 撼h o m a l - 簋 t u n i c a 塘s 麓口h “础# r 觑，n 、蛔t e b f a “ e 亡h l l l l l d t f f r , l c e o b a l 。d | 删o t 8 h n i e 越e l 姒e h - a t e j 开g r e l2 d e u t e r o s | o m er e l 哦函n s h 缸氩 1 h e c l a s s i c t e x t b o o k v i e , 哺i r a p | v i n g d s m o o t h i d c r 蝴 p i n c u t u p ! e x i t 甲i r o l n dr e l a t w c l y l m p l e d a d , , c d e a t , 0 3 , d e 1 t i o t o l r t e 4 n c e r 协m o t k v c r t c b r a t c t b ，a m 衅群c e n t 、i 州r e f o r m e d b r m a k x u k l r e i d c a g e 0 i n h l c h h c m i c i l d l 髂4 r l 4 h l 甜w i e h e c h i n a d e r m s i m p l y , n 8 a m o r e c o m p l e x c ：h i n , d e r m h i s t o r y c t h e i q m l o g y u 彗s n l 列竹t h e r e s u l t s e l l h + l + t | c f f ，正t 瞄i l i l l 帆t b 1 t t h e t i r e d t e l0 、t f i m c a i t c e s t o r w m t l d h a v e b e c n m m i l e a n d r e l a t i v e l y c o m p l e x , d f t a t t h es e s s t l e h a b i t s o l m o s t e h l n o d c r m sa n d t u o c a t e s c v t , l v c d l a t e r | l e m i c h o r d a t e s a r e n o t a h l y a b s e n t 。 图1 2 后口动物的进化关系( g e e2 0 0 6 ) 。 发育相关基因在揭示文昌鱼与脊椎动物形体结构同源性方面具有两方 面的作用，其一是发育基因具有保守的碱基序列，可以鉴别不同动物中密 切相关的基因；其次是同源发育基因在不同动物中常常位于相同的位置、 相同的发育阶段表达。因此，研究文昌鱼与其它动物的同源基因对于探索 脊椎动物的发育、起源、进化具有重要的意义。 2 青岛文昌鱼p 2 3 基因的克隆，箍定、表达纯化和功能分析 1 1 与文昌鱼神经系统发育相关的基因 文昌鱼中枢神经系统由一根中空的背神经管组成，是由胚胎期的神经 板形成，其前端膨大，称为脑泡( c e r e b r a lv e s i c l e ) 。在脊椎动物中，o t x 和 e m x 家族基因( o t x l ，o t x 2 ，e m x l ，e m x 2 ) 在神经系统中表达于正在发 育的前脑和中脑，d m b x l 在中脑和后脑表达，g b x ，e n 和p a x 2 5 8 家族 基因与中脑后脑的组织者区的形成有关，许多h o x 基因在后脑表达，说明 了脊椎动物神经系统发育的复杂性( h o l l a n da n dt a k a h a s h i 。2 0 0 5 ) 。 z o o t y p e 1 i k e 基因已经发现在文昌鱼神经管表达，d 协同源基因在神经管前 部表达( w i l l i a ma n dh o l l a n d ，1 9 9 6 ) ，h o x 基因在后部表达图式的建立( w a d a e ta 1 ，1 9 9 9 ) ，表明文昌鱼脑前后表达图式的本质与脊椎动物一样是保守的。 脊椎动物中脑后脑边界( m i d b r a i n h i n d b r a i nb o u n d a r y , m h b ) ，是脑中具有 组织活性的区域，p a x - 2 基因是m h b 分化所必需的基因( j o y n e r1 9 9 6 ) 。 文昌鱼o t x 基因表达的后边界大概位于第一体节的后端( w i l l i a m sa n d h o l l a n d ，1 9 9 8 ) ，a m p h i h o x l 的表达到达了第二体节的中部( w a d ae ta 1 ， 1 9 9 9 ) 。因此，o t x 和h o x 基因表达区域的中间就形成了一个间隙( g a p ) ，但 是，在这个间隙没有发现p 戤滩同源基因的表达( k o z m i k e t a l ，1 9 9 9 ) ， 其它脊椎动物m h b 表达的指示基因砌和w n t l 也都没有在这个间隙表达。 文昌鱼的这种表达图式提升了人们对脊椎动物m h b 区与原索动物o t x 和 h o x 基因表达间隙区同源学说的怀疑。p a x - 侣基因，尤其是p a x 2 基因 的功能主要是给予中脑和后脑分界的位置信息( j o y n e r , 1 9 9 6 ) ，因此， p a x - 2 5 8 基因可以作为识别位置同源性的指示基因。a m p h i p a x - 2 5 8 和 a m p h i e n 基因表达在神经管边界更靠后一点，大约在第五体节的区域，这 可能表明p 甜身留和砌基因起初是在边界表达，后来在文昌鱼进化过程 中其位置发生了改变。 在脊椎动物后脑和脊髓之间有一类h o x 5 同源基因作为前区的边界指 示基因( f a v o re ta 1 ，1 9 9 6 ) ，在文昌鱼神经管，h o x 基因簇呈线性表达，每 一个h o x 基因每间隔2 个体节表达( 即h o x l 基因在第二体节表达，h o x 3 在第四体节表达，h o x 4 在第六体节表达，h o x 2 基因从线性模式中溢出) ， a m p h i h o x 5 的表达区域还没有发现，但根据双节分布的规律可以推测 青岛文昌鱼p 2 3 基因的克隆、鉴定、表达、纯化和功能分析 a m p h i h o x 5 可能在第八体节表达( 图1 3 ) ，因为a m p h i h o x 4 在第六体节表 达，当然这还需要试验的检验( w a d ae ta 1 ，1 9 9 9 ) 。文昌鱼s e t 同源基因在 前部每一个体节( 1 7 体节) 的运动神经元中表达( j a c k m a ne ta 1 。2 0 0 0 ) ， 表明i s l e t 基因是在文昌鱼神经管的后脑运动神经元中表达，而不是在脊髓 的运动神经元中表达，说明后脑和脊髓的界限是在第八体节。结果表明文 昌鱼h o x 5 基因表达是后脑和脊髓分界的指示基因，其分界线位于第八体 节。 a m p h k 瓢u s m a j f o 怕b r a i n m t d b r a l n m h b ；i s l h m u , s h m d b r a h ：0 啊 s 岬一删枷i p a x 2 5 1 8 凇， 丽船5 f i g 1 3z o o t y p e l i k eg e n ee x p r e s s i o np a t t e r n si nc h o r d a t en e u r a lt u b e t h em o s ta n t e r i o r r e g i o ni sm a r k e db ye x p r e s s i o no fo t x , w h o s ep o s t e r i o rl i m i tc o r r e s p o n d st ot h ep o s t e r i o r e n ddt h em i d b r a i ni nv e r t e b r a t e s p “五 5 8f i l l st h eg a pb e t w e e nt h eo t x e x p r e s s i n g r e g i o na n dar e g i o ng o v e r n e db yh o xc o d ei nv e r t e b r a t e t h ee x p r e s s i o n 试p 2 ，57 8i si na m o r ep o s t e r i o rr e g i o na tt h el e v e lo ft h ef i f t hs o m i t ei na m p h i o x u s t h ea n t e r i o rl i m i to f h o x 5e x p r e s s i o nm a r k st h eh i n d b r a i n - s p i n a lc o r db o u n d a r yi nv e r t e b r a t e s t h i sb o u n d a r y c o r r e s p o n d st 0ah o m o l o g o u sb o u n d a r ym a yb ef o u n da tt h el e v e lo ft h ee i g h t hs o m i t eo f a m p h i o x u s 图1 3z o o t y p e - l i k e 基因在脊索动物神经管的表达图式。o t x 的表达为最前端的指示 基因，它的后端与脊椎动物的中脑后端相对应。脊椎动物p a x 2 5 8 表达在o t x 表达 区和h o x 基因编码区之间，而在文昌鱼第五体节后部表达。脊椎动物h o x 5 表达在后 4 青岛文昌鱼p 2 3 基因的克隆、鉴定、表达，纯化和功能分析 脑- 脊髓连接处，与文昌鱼第八体节的位置相对应。 近几年，神经管的背腹图式的遗传系统研究已引起人们的重视，发现 在脊椎动物和原索动物的神经管，h n f - 3 基因表达在神经管的腹侧 ( s 1 1 i m e i d ，1 9 9 7 ；c o r b oe ta 1 ，1 9 9 7 ) ，s m i l l s l u g 和p 饿- 3 7 基因表达在背侧 ( w a d ae ta 1 ，1 9 9 6 ；c o r b oe ta 1 ，1 9 9 7 ；l m g e l m de ta 1 ，1 9 9 8 ；h o l l a n de ta i ， 1 9 9 9 ) 。在脊椎动物中，勋矗( s o n i ch e d g e h o g ) 基因表达于从前脑到脊髓的 神经管腹部，而文昌鱼砌( h e d g e h o g ) 基因则表达于除了脑泡之外的神经管 腹部的其它区域( s m m e l d 。1 9 9 9 ) 。 尽管文昌鱼缺少神经嵴，但是，文昌鱼和脊椎动物神经胚形成有许多 共同之处。与蛙、鸟及哺乳动物一样，文昌鱼的神经板由背部外胚层形成， 随后卷起形成神经管。不同之处在于文昌鱼的非神经外胚层从神经板的边 缘分离，并迁移越过神经扳，最后在背中线融合。只有在这时，神经板才 卷起。而蛙、鸟及哺乳动物神经管在与非神经外胚层分离前就开始卷起。 脊椎动物迁移前和迁移中的神经嵴表达的大部分基因同样在文昌鱼的神经 板边缘和，或相邻的非神经外胚层表达。这些基因包括s o x l 2 3 、s h a h 和 p 僦3 7 等等( h o l l a n de ta 1 j 0 0 0 ；h o l l a i l dc ta 1 ，1 9 9 9 ；l 肋g c l a n de ta 1 ， 1 9 9 8 ) 。有趣的是，文昌鱼迁移的外胚层表达d h 基因，这种基因在脊椎动 物中表达在神经外胚层和非神经外胚层的边界以及正在迁移的神经嵴中。 但是，文昌鱼表达d l l 基因的细胞最终只局限于表皮，而不会和脊椎动物 神经嵴一样，分化成各种组织( h o l l a n de ta 1 ，1 9 9 6 ) 。文昌鱼和脊椎动物在 神经板边缘基因表达的相似，导致提出这样的问题，哪些基因与迁移神经 嵴的产生有关。一些基因如a p 2 只有在脊椎动物神经嵴刚开始迁移时才表 达，但文昌鱼中，a p 2 在神经板边缘或非神经外胚层都不表达( m e u l e m a n s e ta 1 ，2 0 0 2 ) 。再者，文昌鱼中一些迁移前的神经嵴指示物同源物，神经胚 形成时不在文昌鱼神经板的边缘表达。如z i c 基因，在文昌鱼神经胚早期 神经板中表达，但当神经扳卷起时关闭表达，神经胚期结束后，又在神经 管的背部开启( g o s t l m ga i l ds l l i m e l d ，2 0 0 3 ) 。文昌鱼中脊椎动物四个尉基 因唯一的同源基因，被认为是脊椎动物神经嵴迁移前和迁移中的指示物， 原肠期在神经板前端表达，但在神经胚期，在神经板中关闭时表达 青岛文昌鱼p 2 3 基因的克隆、鉴定，表达、纯化和功能分析 ( m e f l e m a n se ta 1 ，2 0 0 3 ) 。 在神经嵴进化过程中起潜在重要作用的基因是f o x d 3 ，它是脊椎动物 五个f o x d 基因中唯一一个在神经嵴表达的基因。文昌鱼中唯一的f o x d 基 因并不在神经板边缘或毗邻的非神经外胚层表达，提示f o x d 3 在脊椎动物 神经嵴表达以及随后的f o x d 基因复制中起作用。在一些条件下，过度表 达的f o x d 3 基因可以保持神经嵴始祖细胞不断增殖和相对未分化的状态， 尽管其它条件下f o x d 3 促进神经崤细胞分化。到目前为止，可作为神经嵴 指示物的基因只是少数( p o h l 锄dk n o c h e l ，2 0 0 1 ) 。最近，b e n i t o g u t i 辩z 等( 2 0 0 5 ) 研究了神经板指示基因a m p h i e l 邪的表达图式，结果表明， a m p h i 踟表达于已从中期神经胚分裂的表皮细胞中，这些表皮细胞可能是 感觉神经元的前体，认为文昌鱼在表皮中的神经分化可能是在进化过程中， 与脊椎动物神经嵴和软骨基板起源相联系的基本特征。 视黄酸( r a ) 是维生素a 的衍生物，用r a 处理脊椎动物原肠期的胚 胎，后脑后移，h o x 基因表达则前移，从而使从后脑迁移的神经嵴携带被 改变的h o x 进入鳃弓。神经嵴影响咽的图式形成，经r a 处理的胚胎表型 ( 鳃弓融合和导致的非正常软骨) 和胚胎神经嵴中h o x l 和h o x 2 基因的错 误表达是相似的( a l e x a n d r e 武a 1 ，1 9 9 6 ；y a ne ta 1 ，1 9 9 8 ) 。对文昌鱼咽 发育的研究主要着重于咽内胚层的内在信号。尽管文昌鱼缺少神经嵴，r a 处理脊椎动物导致的咽缺损，在文昌鱼中经类似处理也出现相似的表型。 对于鼠，r a 阻止咽裂的形成，引起鳃弓融合。同样地在文昌鱼，鳃裂和口 也不会形成。