（植物病理学专业论文）煤绒菌和扁绒泡菌的培养及显微和超微结构研究.pdf

煤绒菌和扁绒泡菌的培养及显微和超微结构研究 摘要 本实验选用的两种材料分别是绒泡菌目绒泡菌科煤绒菌属煤绒菌和绒泡菌目绒泡 菌科绒泡菌属扁绒泡菌，原质团类型均属于显型原质团。 通过对两种黏菌原质团的培养，即2 水琼脂为培养基，饲喂无菌燕麦粉和无菌水， 观察发现长势良好情况下煤绒菌原质团较为粗壮，扇面结构较厚，分枝不明显；而扁绒 泡原质团较为细弱，扇面结构较为明显，但较薄，分枝明显。煤绒菌原质团生长条件要 求宽泛，而扁绒泡菌原质团生长条件尤其温度要求较为严格。 实验观察发现培养煤绒菌原质团较易形成菌核，所以通过干燥和饥饿诱导煤绒菌形 成菌核来观察黏菌菌核形成过程的显微及超微结构变化；扁绒泡菌较易形成子实体，所 以通过升高培养温度诱导子实体形成来观察黏菌子实体形成过程( 孢子形成过程) 的显 微及超微结构。观察手段主要是细胞器特异染色后光学显微镜观察；细胞器分离后特异 染色光学显微镜观察；细胞器超活染色后光学显微镜观察；细胞核d a p i 染色后荧光显 微镜观察；制作超薄切片透射电子显微镜超微观察；细胞器分离后磷钨酸负染后透射电 子显微镜超微结构观察。 显微及超微结构研究发现煤绒菌在菌核形成初期内孢囊刚刚形成，原质团内部割 裂，随着原质团聚缩加剧和褶皱状形成，内部水分散失，内孢囊紧密排列，为防止内孢 囊内水分继续散失形成较厚的角质膜。 通过透射电子显微镜观察正在形成孢囊的扁绒泡菌，发现当原质团开始形成原始孢 囊时，内部结构与原质团正常生长时相比密度增大，随着原质团继续注入原始孢囊，原 始孢囊继续发育，孢囊由最初透明的白色逐渐过渡到黑色，内部原质团开始割裂，形成 小的球体，即孢子前期。割裂的各个球体之间有一层电子致密层，电子致密层内有一层 电子稀薄层，原始孢囊颜色继续变深，水分继续散失，继而观察到电子致密层分开，成 为相邻的两个孢子球体的外壁，有凸凹契合点，即为后期成熟的孢子壁的纹饰。本实验 观察认为，孢丝的形成是由于孢子之间的电子致密层分开后并非一分为二成为两个孢子 的外壁，而是一分为三除靠近相邻的两个孢子的成为孢子外壁后，中间剩余的物质即为 孢丝。这与传统认为原始孢囊形成后先形成孢丝后形成孢子的观点相反。 本文实验还包括d a p i 荧光染色剂进行染色，在荧光显微镜下观察，并通过j a n u sb 染液对原质团进行超活染色均取得较好的观察效果；另外通过对分离细胞核进行核染色 和直接挑取小块原质团进行核染色对比观察研究发现，前者效果要明显优于后者。 本实验还独创了将线粒体从生长旺盛的原质团中通过两次低速离心和两次高速离 心分离，然后磷钨酸负染，直接电镜观察，能够较容易且较清晰的观察到黏菌的线粒体 形状和密集的管状脊，与原生动物相同，为黏菌的归属问题提供佐证。 关键词：黏菌，原质团，菌核，内孢囊。孢囊 c u l t u r ea n dm i c r o s t r u c t u r ea n du l t r a s t r u c t u r es t u d yo n f u l i g os e p t i c aa n dp h y s a r u mc o m p r e s s u m a b s t r a e t t w om a t e r i a l si nt h i se x p e r i m e n ta l ef u l i g os e p t i c a ( l ) w i g g e r sw h i c hb e l o n g st op h y s a l a l e s ， p h y s a l a c , e a e ，f u l i g o ，a n d 尸幻m mc o m p r e s s u ma l b & s c h w e i n w h i c hb e l o n g st op h y s a l a l e s ， p h y s a l a e e a e p h y s a r u m b o t hp l a s m o d i ao f t h e s et w os p e c i e sa p h a n e r o p l a s m o d i a t h r o u g ht h ec u l t u r ew i t hs t e r i l eo a tp o w d e ra n dw a t e ro nt h es u b s t r a t eo f2 w a t e r - a g a l , w ec a ns t h a tt h ep l a s m o d i ao f f u l i g o s e p t i c aw i t hb i gt h i c kf a ns h a p et os w a r mw i t h o u tf e wr e m i f i c a t i o n sw e r ev e r y s t r o n g , a n dt h e ys h o u l db ec o n v e y e dt on e ws u b s t r a t eo v e r1 0d a y s ；b u tp l a m o d i ao f p h y s a r w mc o m p r s s w n w i t han o tb i gt h i nf a ns h a p ea n dm o r er e m i f i c a t i o n sw e r ev e r ys l i m , t h e ys h o u l db ec o n v e y e dt on e w s u b s t r a l eo v e r1 5d a y s t h ep l a s m i d i a sl i v i n gc o n d i t i o no fp h y s a r u mc o m p r e s s u mi sm o r es t r i c tt h a n f u l i g o s e p t i c a e s p e c i a l l yi nt h ef a c t o f t e m p e r a t u r e t h er e s u l t ss h o w e dt h a tf u l i g os e p t i c ap l a s m o d i aa r ee a s yt of o r ms e l e r o t i a , s ot h a tt h e yw e r eu s e dt o b et h em a t e r i a l st o s t u d yt h em i c r o s t m c t u r ea n du l t r a s t r u c t u r ea b o u tt r a n s f o r m a t i o nf r o mp l a s m o d i at o s e l e r o t i u mb yd r y i n ga n ds t a r v i n g t h ep h y s a r u mc o m p r e s s u mp l a m o d i aa ne a s yt of o r ms p o r a n g i a , s ot h a t t h e yw e r eu s e dt ob et h em a t e r l a l st os t u d yt h em i c r o s t r u e t u r ea n du l t r a a t r u e t u r ea b o u tt r a n s f o r m a t i o nf r o m p l a s m o d i at os p o r a n g i u mb yh o i s t i n gt h et e m p e r a t u r e t h em a j o rm e t h o d sw e r et oo b s e r v es p e c i a ld y et o t h eo r g a n d i e sa n di s o l a t e do r g a n e l l e sa n dl i v i n go r g a n d i e sf r o mm i c r o s c o p e ，a n dt oo b s e r v eo r g a n d i e sa n d n e g a t i v es t a i n e di s o l a t e do r g a n e l l e sf r o mt e m t h er e s u l t so fm i c r o s t r u c t u r a la n du l t r a s t r u c t u r a lo b s e r v a t i o n ss h o w e dt h a tp l a s m o d i aw o u l db e c l e a v a g e dt of o r ms p h e r u l e sa lt h eb e g i n n i n go fs e l e r o t i u mf o r m a t i o n t h es p h e r u l e sa r r a n g e dc l o s e l ya n d f o r m e dc u t i c l e sf o l l o w i n gt h ep l a s m o d i aa s s e m b l e dt op l i c a t ea n dd i s s i p a t et h ei n n e rw a t e r t h r o u g ht h eo b s e r v a t i o n st ot h ep h y s a r u me o m p r e s s u mw h i c hw a st r a n s f o r m i n gt os p o r a n g i af r o m p l a s m o d i af r o mt e m w e c a nf o u n dt h ei n n e rs l r u c l u r e sw e ”d e n s e rt h a nt h ef o r m e r s t h ei n n e rp l a s m o d i a w e r ec l e a v a g e dt o 锄a l ls p h e r e sw h i c hw e r ep r o t o - s p o r e sf o l l o w i n gt h ep r o t o - s p o r a n g i ad e v e l o p e dw i t h p l a s m o d i ai n j e c t e da n dt h ec o l o rc h a n g e df r o mw h i t et od a r kg r d u a l l y t h e r ew a sa ne l e c t r o n d e n s el a y e r b e t w e e nt w oc l o s e ds p h e r e sa n dt w oe l e c t r o n - l u c e n tl a y e r sa tt h eo p p o s i t es i d e so f t h ee l e c t r o n d e n s el a y e r w h e nt h ec o l o ro fs p o r a n g i ac h a n g e dt od e e p l yd a r k w ec a l ls e et h a tt h ee l e c t r o n d e n s el a y e rt o r nt w o l a y e r s ，e a c hl a y e rb e c a m et h eo u t e rs p o r o d e r m so ft h et w on e i g h b o r e ds p h e r e s a f t e rt w oj o i n e ds p h e r e s d i v i d e d , w ec a l ls e et h a tt h eo u t e rs p o r o d e r m sh a dp r o t r u d e dw a r ta n dc o n c a v eh o l l o o n e s st h a ta d a p t e dt o e a c ho t h e r , a n dt h e s ew e r et h eo r n a m e n t a t i o n so ft h em a t u r e ds p o r e s t h er e s u l t ss h o w e dt h a ts o m e 1 1 1 e l e c t r o n d e n s el a y e r sd i d n td i v i d e di n t ot w ol a y e r sb u tt h r e el a y e r s a n dt h em i d d l el a y e rw o u l db e c a m et o c a p l l i t i aa f t e rs p o r e sf o r m e d t h i sv i e w p o i n ti se x t r e m e l yd i f f e r e n tf r o mt r a d i t i o n a l t h i se x p e r i m e n ta l s oc o n t a i n su s i n gf l u o r e s c e n c ed y et oo b s e r v ef r o mf l u o r e s c e n c em i c r o s c o p e ，a n d u s i n gj a n u sg r e e nbt oa y et h el i v i n go r g a n e l l e st oo b s e r v ef r o mm i c r o s c o p e ，b o t ht h e mh a da c q u i r e db e t t e r o b s e r v a t i o nr e s u l t s i na d d i t i o n , w ea l s ou s e ds p e c i a ld y et od y et h en u c l e ia n di s o l a t e dn u c l e i ，w ec a ns e e t h a tt h ef b r m e rm a r f f t e rw a sr 2 e 口- t e rt h a nt h el a s t t h i se x p e r i m e n tc r e a t e dan e wm e t h o dt oo b s 日v et h es h a p eo f m i t o c h o n d r i o nw i t ht u b e s h a p e dc d s t a c l e a r l yi i l t h es t r o n gp l a s m o d i ao fm y x o m y c e t e sf r o mt e mn e g a t i v es t a i n i n ga f t e rt w i c el o w - s p e e d c e n 魄e sa n dt w i c eh i g h s p e e dc e n t r i f u g e s m i t o c h o n d r i o nw i t ht u b e s h a p e dc r i s t a i ss a m et ot h e p r o t o z o a n , b u td i f f e r e n tf r o mf u n g i t h i sp h e n o m e n o nc a nb eo n eo ft h ee v i d e n c et op r o v ew h i c ht h e m y x o m y c e t e sb e l o n gt o k e yw o r d s ：m y x o m y e e t e s , p l a s m o d i u m ，s c l e r o f i u m , s p h e r u l e s ，s p o r a n g i u m i v 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。 尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰 写过的研究成果，也不包含为获得吉林农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过 的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并 表示了谢意。 学位论文作者躲李艳玖签字日期如7 年占月妒 关于论文使用授权的说明 本人完全了解吉林农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留送 交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手 段保存、汇编学位论文。同意吉林农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学 位论文的全部或部分内容。 学位论文作者 导师签名： 签字日期：二p 7 年月2 多日 签字日期：伽7 年舌月2 夕日 直拄壅些盘堂亟堂僮监塞 搓堡重塑危缝盥茴曲生堑芏壁羞丞星煎塑塑煎堕擅丑宜 1 1 研究目的和意义 第一章前言 真黏菌是一类鲜为人知的生物，一般情况下常常发生在湿热的森林中。黏菌的数量 很少，全世界大约有6 0 0 种【1 1 ，而我国约有4 1 2 种【2 1 。黏菌的个体通常很微小，但内部 结构和生活习性却极为特殊。在真核生物中它属于一个独立的类群，以最简单的方式表 现出基本的生活循环。 a l e x o p o u l o s 将黏菌的生活循环描述为：( 1 ) 单核细胞有三种类型，其中之一具鞭 毛：( 2 ) 多核的营养体阶段转入繁殖阶段前，即原质团能吞噬，移动和进行原生质可逆 的往返流动；( 3 ) 抵抗不良环境阶段由菌核组成；( 4 ) 从营养体阶段转入繁殖阶段时， 原质团转变为一个或一群非细胞结构的固定的子实体，子实体含有有壁的孢子。孢子被 风和水、生活在子实体上及以子实体为食的一些动物所散布p 1 。因此，黏菌兼有动物和 真菌的特征1 4 1 。 在各种不同的生境中都能够发现黏菌。一些黏菌世界性分布【5 6 7 1 ，例如煤绒菌 f u l i g o s e p t i c a ( l ) f h w i g g ，粉瘤菌 l y c o g a l ae p i d e n d r u m ( l ) f r 】等。另有一些黏菌则只在 特定的环境下才能生存。然而，一般来说，最有可能找到黏菌的地方是湿热的森林地区， 黏菌生长在腐朽的木段，枯叶和其他有机物上。 黏菌具有重要的理论和应用价值【4 1 ，是细胞学，遗传学，分子生物学，生物化学， 生物物理学等领域重要的试验材料，特别是研究核有丝分裂，形态发生，制约生殖的化 学变化，原生质的结构和生理等基础理论上更为理想。最常用的种是多头绒泡菌 ( p h y s a r u mp o l y c e p h a l u ms c h w e i n ) ，美国威斯康星大学的肿瘤研究所最早研究了它的 细胞循环。黏菌子实体具精细奇妙的结构和艳丽的色彩，它不乏观赏价值。有人把黏菌 的幼子实体采来食用。此外黏菌在生态系统中也有着重要意义。 有些黏菌的原质团和子实体经常出现在草坪和装饰植物上而有碍观瞻。另外，在食 用菌栽培场所经常出现各种黏菌，例如煤绒菌 f u l i g os e p t i c a ( l ) f h w i g g 】，灰团网菌 口r c y r i a c i n e m a ( b u l l ) p e t s 】，绒泡菌属( p h y s a r u ms p p p e r s ) 和发网菌属( s t e m o n # i ss p p r o t h ) 的一些种。因为黏菌可以以真菌孢子和菌丝为食，所以在食用菌栽培中黏菌是有 害的。m i y a i r i 等人【8 】曾从光盖鳞伞【尸幻f f d 缸n a m e k o ( t i t o ) s i t o & i m a i 】腐烂的子实体 中分离出彩囊钙丝菌 b a d h a m i au t r i c u l a r i s ( b u l l ) b e r k ，检测用它的原质团所制备的粗 酶提取物，得到了纤维素酶、几丁质酶等，证明这种黏菌上述几种酶能引起光盖鳞伞子 实体的溶解。黏菌的原质团和子实体覆盖在食用菌的栽培料上，会影响食用菌的正常生 长。 考拄壅些太掌塑生僮迨童 搓缝苴塑扈缝塑茸鲍生堑堂揸羞厘垦煎塑塑煎丝擅盈荭 在3 5 0 多年的科学研究中，黏菌学取得了重大突破【9 】。早期的研究以黏菌分类学和 黏菌生物学的研究成绩突出。为进一步深入研究黏菌打下了基础。2 0 世纪后半叶，特别 是8 0 年代之后，由于高新技术特别是分子生物学技术的发展和应用，以及生物化学， 遗传学，细胞学等相关学科的发展，有力地推动了黏菌学研究的进步，黏菌学研究进入 了新时期。但近十年来国际黏菌生物学和细胞生物学与分子生物学、生态学和分类学等 比较相对处于沉寂状态。 我国地域辽阔，气候类型多样，黏菌资源极其丰富，但黏菌学的研究起步较晚，研 究人员更是风毛麟角。经过几代人的努力，特别是2 0 世纪8 0 年代后，已在黏菌系统分 类、黏菌分子生物学、黏菌生态学、黏菌生物学及黏菌细胞生物学等方面取得了很多成 就，使得我国在黏菌研究方面一直处于世界前沿水平。本文通过光学显微镜、荧光显微 镜和电子显微镜等一系列观察手段对煤绒菌 f u l i g os e p t i c a ( l ) f h w i g g 】的原质团、菌 核形成过程及扁绒泡菌( p h y s a r u mc o m p r e s s u m a l b & s c h w e i n ) 原质团、孢子形成过程 进行了详细的观察与记录，以期对黏菌研究提供新的研究佐证1 1 2 黏菌学的国内外研究概况 黏菌这一类奇妙的生物尽管推测在距今1 0 0 万年前就已出现，有人认为一些中国古 代典籍中记载的“碧血”、“鬼屎”或许就是黏菌【i ，但是真正的现代黏菌的最早公认的记 载是俄国人p a n e k o w l 6 5 4 年对现在名为粉瘤菌 l y c o g a l ae p i d e n d r u m ( l ) f r _ 】的这个常见 种所作的简单描述f l l 】。1 7 2 9 年m i e h e l i 描述了黏菌的若干属并进行绘图【9 j 。1 7 5 3 年 l i n n a e u s 描述了6 个种，并且他的 s p e c i e s p l a n t a r u m ) ) 被定为黏菌命名的起点，l i n k l 8 6 6 年认为黏菌是菌而使用了黏菌这个名称i l “。d eb a r y 在系列文章和至少2 部著作 ( 1 8 6 4 ，1 8 8 7 ) 讲述了包括形态学和生活史等在内的大量有关黏菌的知识，他称之为“菌 虫”【l2 】。d eb a r y 的学生j o s e p hr o s t a f i n s k i ( 1 8 7 3 ，1 8 7 4 - - 1 8 7 8 ) 建立了第一个黏菌的现 代分类系统，这一系统成为今天所用分类系统的基础【i 。从d eb a r y 开始，黏菌学的研 究真正进入了快速发展阶段。从1 8 7 3 年以后，涌现了以t h m a e b r i d e ，a & gl i s t e r ， gw m a r t i n ，c j a l e x o p o u l o s ，n e n a n n e n g a - b r e m e k a r n p ，m l f a r r 等为代表的一 大批卓有建树的几代黏菌学家【9 】。近代国际黏菌研究形式主要是以n a n n e n g a - b r e m e k a m p 和山本幸宪为代表的黏菌分类学研究；以s t e p h e n s o n 为代表的黏菌生态学研究；以j c l a r k 为代表的个体发育研究和以c a v e n d e r 和蔌原博光为代表的细胞黏菌研究。 黏菌的营养生长阶段是独立生活的、多核非细胞结构的、仅有表面质膜无细胞壁的、 能变形移动和摄食有机物的一团原生质，称为原质团【l “。原质团具有质膜和胶黏质鞘， 鞘上有微纤丝，原质团无结构，含有小颗粒、液泡和其它物体，没有形状大小的限制； 具有一定的黏度，原生质具有节律性的往返运动，这种运动与原质团的伸展方向并无相 2 吉拄盔些盍堂亟堂僮迨室 墟缝萱塑扈缝塑苴鲍生麴堂堡羞丞垦煎塑塑煎茎拉丑密 关性；在原生质流动和原质团移动中起作用的还有纤丝，纤丝常形成团集的网体【l ”。从 营养生长阶段转入繁殖阶段时，原质团转变为一个或一群非细胞结构的子实体，子实体 表面或内部产生孢子。孢子是黏菌的繁殖器官，通常为球形，有明确的较厚的细胞壁， 壁上具有点、刺、疣、突起的网纹或网眼坑窝等纹饰，有的则是光滑的。成熟的孢子有 一个单倍体的细胞核，也有可能含有多个，它由核膜和一个核仁组成，还有线粒体、液 泡、泡囊、核糖体和胞质网等，线粒体为管状突起。在整个生活史核循环中以双倍体阶 段为主。 黏菌在系统发育上是一个独立的类群。从鞭毛结构、摄食营养和同一生活史中有丝 分裂的不同方式可以推测，起源于原生生物而和根肿菌相近；从其繁殖方式以双倍体为 主的生活史核循环类型和其形态学和形态发生学，特别是子实体的精巧结构来看，其进 化发展已达到相当高的水平，与真菌是一个源相远而性相近的独立类科州。 在正常的发育过程中，原质团产生孢子体。但在某些条件下，一个显型原质团会沿 另一条发育途径发展而转变为一个坚硬的不规则的团块，即菌核。菌核长期处于休眠状 态当适宜生长条件恢复时，又可恢复生长为原质团。菌核除了可免受高温和干燥以外， 有些黏菌还可以菌核状态越冬。 1 2 1 黏菌的生物学及细胞生物学研究概况 1 2 1 1 孢子萌发的有关研究 最早研究黏菌孢子萌发的是d eb a r y i ”l ，他在1 9 5 4 年报导了对紫红半网菌 h e m i t r i c h i av e s p a r i u m ( b a t s c h ) t m a c b r 1 的萌发过程的研究结果，发现孢子产生的是具 鞭毛的游动胞而非高等真菌所特有的管状菌丝。2 0 世纪3 0 年代，g i l b e r t 【j ”对不同科的 黏菌的孢子萌发进行了比较研究，他发现在他所研究的5 6 个种中，所有的假丝菌科 ( r e t i c u l a r i a o e a e ) 萌发均很好，其他科黏菌的萌发能力在不同的种属之间是有区别的。 同期的s m i t h t l 8 】对5 - 2 5 年的黏菌孢子进行了萌发实验研究，他指出所用的实验材料的年 龄和萌发率之间并无相关性。s m a r t t l 9 1 于1 9 3 3 年对孢子萌发所需的营养条件，氢离子 浓度，温度，多孢子播种等因素开展了工作。共选择了7 0 个种和变种的黏菌作为研究 对象，通过实验得出如下结论：第一，绒泡菌目的黏菌对营养介质具有广泛的适应性， 比任何其他目黏菌的是适应能力都强。特别是煤绒菌 f u l i g os e p t i c a ) f h w i g g 】，在 自然基物中具有高萌发率和较快萌发速度。尽管多数种的孢子可以在蒸馏水中萌发，但 来自基物中营养稀释液可以促进孢子的萌发。在实验的营养物质中，腐烂的橡树、松木、 松皮、稻草、橡树叶、松针和腐殖土对研究中多数黏菌的种的有促进萌发作用。同时， 他还指出孢子萌发是由于细胞质吸水产生内压使孢子壁破裂，释放出原生质。第二，弱 直蛙盔些盘生亟堂僮熊室搓缝茴塑扈缝也茸的生丝堂壁羞区垦煎塑塑煎壁擅丑塞 酸性基质有利于大多数黏菌孢子的萌发。第三，孢子萌发的温度范围可从2 3 6 c 。实验 中所有种的孢子萌发的最适温度为2 2 3 0 ，且在适宜的温度范围内，在较高温度下更 易萌发。煤绒菌属( f u l i g oh a i l e r ) 和钙皮菌属( d i d y m i u ms c h r a d ) 等对温度有广泛的 适应性。绒泡菌属( p h y s a r u mp e r s ) 的孢子萌发范围最窄，在2 8 。c 以上不能萌剔归】。 e l l i o t t l l 6 】利用胆盐方法来促进孢子萌发，取得较好效果；k o e v e n i 9 1 9 6 4 年发现纤维 素酶使圈绒泡菌的裂式萌发变为孔式萌发1 2 0 1 ；d a h l b e 唱认为煤绒菌孢子悬浮液的滤液对 孢子萌发具有促进作用，孢子萌发率与悬浮滤液的温度以及悬浮孢子本身的年龄有关 1 2 1 1 。 2 0 世纪7 0 、8 0 年代，随着电镜技术的应用与发展，人们开始研究孢子萌发时的超 微结构的变化。s t e m p e n l 2 2 1 1 9 8 2 年报导了煤绒菌的孢子壁分为两层：电子稠密、具棘的 外层和电子透明的含纤维的内层。孢子壁内层的纤维物质通常紧紧束缚着。当孢子萌发 时外层首先开裂，但此时内层并不同时开裂，而是在开裂部分保持完整。内层的残留部 分存在刚释放出的原生质周围。看来内层似乎更有弹性，当游动胞释放时才断裂i 内层 残留部分似乎来自于孢子壁的纤维物质。但游动胞并非如此。 孢子萌发之后产生游动胞及黏变形体，g i l b e r t ”j 观察发现，从脆光果菌的孢子中产 生一个、两个或四个原生质。s m i t l l 【l 驯观察到黑柄钙丝菌( b a d h a m i aa f f l n i sr o s t a f ) 孢 子萌发时可产生四个原生质，而多头绒泡菌的孢子产生一个或两个原生质。 2 0 世纪6 0 年代，m c m a n u s ”1 报导了对蛇形半网菌f h e m i t r i c h i as e r p u l a ( s c o p ) r o s t a f 】和紫红半网菌 h e m i w i c h i av e s p a r i u m ( b a t s c h ) t m a c b r 】的早期发育情况的研究。 他指出，蛇形半网菌的孢子萌发不佳，对发育初期的观察未得到令人满意的结果。紫红 半网菌的孢子在悬浮2 4 小时后开裂，在孢子附近有卵圆形的几乎透明的原生质，能够 缓慢移动。一天后圆形的原生质变成变形体。变形体具有颜色较深的颗粒物质，在变形 体内无规律地运动。m c m a n u s 还观察到典型的游动胞，但游动胞存活不超过3 天。 1 2 1 2 原质团的相关研究 1 2 121 原质团的类型a l e x o p o u l o s 用琼脂方法成功地培养了小刺轴菌( e c h i n o s t e l i u m m i n u t u md eb a r y ) 。通过对小刺轴菌原质团的观察和研究，确定为原始型原质团这一原质 团类型。小刺轴菌初始阶段的原质团类似于大的变形虫，扁平、近圆形，无色。其他类 型的原质团在刚生长后不久就继续发育，呈现出与初期不同的外部形态，而小刺轴菌与 初始形态相比变化很小，只是大小上发生了变化。成熟的原始型原质团在子实体形成前 在结构基本为均质的，原质团仍为近圆形，有时为不规则外观，前缘无扇形区域，亦无 菌脉和网状结构。原质团流速度较慢且无规律性阱1 。 m c m a n u s 报导了无丝菌e l 中的两个小型种纵裂无丝菌( l i c e ab i f o r 捃m o r g a nj ) 4 直整室些盘堂亟芏焦监塞搓煞萱堑扈煞塑萱曲生堑生壁羞区星煎塑塑堂缱拍丑塞 和紫筛菌( c r i b r a r i av i o l a c e ar e x ) 的原质团培养情况，纵裂无丝菌的原质团为浅棕色，近 球形，直径约3 0 0a m ，即使在迁移时也保持圆形，在琼脂上不形成扁平状，无菌脉和原 生质流，每个原质团形成3 5 个无柄孢囊。紫筛菌的原质团很微小，肉眼可观察到黑色 污点状结构即为原质团，迁移时原质团经常扩展成一小菌脉网，在高倍镜下可观察发现 菌脉中有某些流动的原生质且只向一个方向流动，没有向相反方向的流动。在形成子实 体之前原质团始终保持黑色，形成子实体时，菌柄顶端的原生质变为奶白色，逐渐经玫 瑰色至成熟子实体的紫刨2 5 】。每个原质团产生一个孢囊。 异宗配合黏菌通过两个胚子的结合( 游动细胞或黏变形体的结合) 就形成了合子。 随着合子的生长，其核进行连续的有丝分裂但没有紧随的胞质分裂，细胞转变成多核的 变形体结构，即原质团，在这个生活循环阶段发生的游丝分裂是核内型的( 封闭的) ， 并且不牵涉中心粒，完整的核膜保持到后期之末或末期之初，这与孢子萌发后黏变形体 中发生的包含中心粒的开放型核分裂形成鲜明对照。 合子，通过连续的核分裂，合子很快长成一个微小的原质团，此时流动限于原质团 的中央区域，缓慢且不规则原质团迅速变长且发育成明显的管状结构，其内部原生质开 始前后方向上进行规律性的流动。此后长形结构的一端开始加宽，这时极性已经建立起 来，原质团在它的加宽的部分移动。此时，前部开始呈扇形。原质团原生质划分为流动 和非流动部分，且界限清楚。随着原质团的生长，扇形结构加厚且发育成片状原生质， 内部形成一些流动的管状结构，主要的管状结构前后方向排列着，更小的管状结构与主 要的管状物横向或斜向联系。后面的原质团呈网状，但网状结构的细线状不同于在隐型 原质团中，成规则排列及菌丝状，而且宽度不一。绒泡菌原质团的另一特征是具有三维 外观。这一点与隐型原质团不同。绒泡菌原质团即使长度小于l1 1 1 1 1 1 肉眼也可观察到。 绒泡菌原生质比发网菌原质团的密度大。 a l e x a p o u l o s 还对刺发网菌( s t e m o n i t i s f l a v o g e n i t a j a h n ) 的原质团进行琼脂培养并观察 其从最早阶段直到结实的过程，了解了发网菌原质团与绒泡菌原质团的区别。发网菌原 质团第一个可识别的阶段是一个圆形的原质团团块，接下来原质团变长，且有伸出突出 的假足的倾向，或产生一些分枝，然后开始形成网络。但即使在一个相当大的网络建成 之后，发网菌的原质团也没有确定的边缘，且无已分化的前缘为扇形结构。随着原质团 老化，变成一个或几个扇形结构，并具有确定的边缘，它的形状开始时与绒泡菌类似。 成熟且较大的发网菌原质团扁平、透明。用肉眼看不到且用反射光在解剖镜下识别也较 难。未成熟发网菌原质团的“不可见的特征”是其原质团的主要特征，被定义为“隐型 原质团”。只有在原质团将要结实时，分枝才变粗，且变成珊瑚状。然后原质团容易见 到，但仍与多数绒泡菌的原质团有着明显的区别i 矧。 m c m a n u s l 2 3 1 详细观察了紫红半网菌 h e m i t r i c h i av e s p a r i u m ( b a t s c h ) t m a c b r 和蛇形 半网菌 h e m i t r i c h i a s e r p u l a ( s e o p ) r o s t a f 的原质团。原质团类型介于显型原质团和隐型 直盐盔些太生亟堂焦迨室搓缝茴塑扈缝塑菌曲生堑生缝羞区垦煎塑叠垡丝控丑荭 原质团之间。在紫红半网菌原质团的扇形结构部分，原质团扩展成连续的片状结构，其 中有的部分很薄。随着原生质流将更多的物质带进扇形区域，透明的伪足沿着扇形区域 的边缘以很小的间隔不断扩展。当颗粒物质流入伪足时，伪足在扇形区域的前缘开始变 得膨大呈“气球”状结构；当原生质流向相反的方向流动时，颗粒物质逐渐流出“气球” 状的伪足，伪足就收缩，如此反复。晟后成熟原质团边缘膜的弹性只能够稍稍扩展。 a l e x o p o u l o s t 卅发现发网菌科的两属5 个种为隐型原质团，未发现这一以外的种产生 隐型原质团。绒泡菌目的两科4 属的1 6 种黏菌产生显型原质团。未发现除此目之外的 黏菌产生显型原质团，也未发现这一目中的黏菌产生其他两种类型的原质团。发网菌科 其它种是否产生隐型原质团尚有待发现。他认为可以预期发网菌属多数产生隐型原质 团。 1 9 8 6 年，a l e x o p o u l o s 3 】将黏菌的原质团总结为三种基本类型：原始型原质团 ( p r o t o p l a s m o d i u m ) 、隐型原质 ( a p h a n o p l a s m o d i u m ) 、显型原质团( p h a n e r o p l a s m o d i u m ) 。 最小的原质团类型是原始型原质团包括刺轴菌目以及许多的无丝菌目种类。其特点 为原质团一生始终很微小，质地比较均一，不形成菌脉，没有其他原质团类型的快速节 律性往返流动。原始型原质团通常只产生一个孢囊。隐型原质团一初期类似原始型原 质团，但不久就伸长、分枝，形成由很细的线条构成的网体，原生质颗粒状结构很不明 显，没有黏质鞘，不易看见。菌脉中并非明显地分为胶质和流动的两部分。流动的原质 团像是被极纤薄的膜所包裹，流动快速且有反复的节律性。隐型原质团是发网菌目的特 征。显型原质团一为绒泡菌目的特征，起初也像原始型原质团，但不久就长成大块。 原生质颗粒状结构很明显，原质团即使在发育早期也能看到。菌脉中胶质的和流动的部 分容易分辨，节律性往返流动很明显。 a i e x o p o u l o s z 4 1 并1 r a m m e l 0 0 1 2 7 1 指出还有一种原质团类型介于显型原质团和隐型原 质团之间，团毛菌目中黏菌原质团大多为此种。因为团毛菌目中只有极少数的种可在人 工培养基上完成了从孢子到孢子的生长过程，所以对这一类型的原质团的了解远少于其 他三种类型。 1 2 1 2 2 原质团的培养c u r r i e 在1 9 1 8 1 9 2 0 年通过试验发现，燕麦琼脂培养基和玉米种 子琼脂培养基最适于黏菌原质团的培养。h o w a r d 2 8 1 等人在1 9 3 1 年观察发现彩囊钙丝菌 【b a d h a m i au t r i c u l a r i s ( b u l l ) b e r k 】的原质团能够消化和同化某些层菌的子实体，第一次 提到黏菌原质团的营养介质。此后便以真菌子实体作为原质团的营养物质，并发现某些 产生白色孢子的伞菌为最佳的营养物质，能够使多头绒泡菌原质团快速生长。 h o k l 2 9 】以多头绒泡菌等为实验材料，试验证明了原质团可以通过吞噬活的微生物而 获得营养，当活体有机物食物不存在时，原质团的生长趋势常常减弱。灭菌和自溶后的 酵母不能支持1 7 个原质团的正常生长表明，加热破坏了活酵母中存在的生长刺激物。 但他同时指出，用致命剂量的紫外线处理酵母可使细胞中全部营养成分保存下来。原质 6 吉拄盔些盎堂亟堂僮缝室堪缝菌塑扈缝= | 豇菌数生堑堂壁羞厘里煎垄整煎箜擅叠蕴 团的所有培养都在避光下完成。控制温度在2 l 。在1 6 生长缓慢，在3 0 限制生长， 在3 4 没有培养物可存活2 天以上。为了满足这些原质团的纯化和迁移，实验发现进行 原质团转移至新的培养基后停止饲喂原质团，直到原质团开始活动为止，再添加营养物 质，这样有利于原质团的迁移。然后将- 4 , 匙死的酵母制品小心的散布在琼脂表面，距 离原质团周围的最l 临近处。每天逐步增加营养的数量。史立平 3 0 , 3 1 j 对培养若干种显型原 质团时就采用此种饲喂方法，即将长势较好的黏菌原质团连同被附着的旧的培养基，迁 移至新的培养基上，待原质团已经由旧的培养基爬到新的培养基上之后，再饲喂无菌燕 麦粉和无菌水。实验证明应用此种方法，原质团迁移速度较快，且原质团生长旺盛，菌 脉较粗，扇面结构较密集。 d a n i e l 等人i ”j 首先在部分确定溶液培养基上对多头绒泡菌进行了纯培养。悬浮培养 是在三角瓶中加入生长培养基，接种原质团的碎片，搅拌培养。表面培养是使原质团在 一个液面培养基的表面上生长。将玻璃珠置于培养皿中或三角瓶中，培养物为其他平皿 原质团的一小片或用摇床培养扣3 天的悬浮液。悬浮液用吸管直接取放在干滤纸上，待 几小时后融合成一个原质团，再在滤纸上加培养基。研究表明，多头绒泡菌悬浮培养比 表面培养更有效，对于确定营养和生长特性，在悬浮培养中生长更快，更易测量，更易 保存和不易污染。微小的原质团很容易融合，长成的大原质团便于研究同步生长。原质 团在营养培养基上的玻璃珠滤纸表面也生长良好。在适宜条件下，3 天悬浮培养的1m l 接种体在融合成一个原质团后，3 天后长成直径达7 c m 的原质团。这种原质团为薄的圆 盘状，在最大生长时，不迁移但向周边扩展；然而，当营养用尽或被无营养培养基取代 时，盘状培养物迅速变成高速移动的树状网络。原质团在营养琼脂上的生长比在营养的 潮湿的滤纸上长的缓慢，且呈现疏松的网状。原质团浮在营养培养基表面也长的很好， 但要小心防止它的浸没。以前认为多头绒泡菌只能在表面作为一个大的原质团生长，通 过d a n i e l 等人的努力能在悬浮培养基中作为多核微原质团生长。在生长一致的表面原质 团中，同步的有丝分裂最容易研究。摇床培养的小原质团可在几小时内融合，形成大的 原质团。这种培养方法也促进了黏菌生活史的研究，因为摇床培养的营养体的原质团， 可在纯化培养条件下诱导产生子实体。 1 2 1 3 菌核的相关研究 生长阶段转入繁殖阶段时，原质团转变为一个或一群非细胞结构的子实体，子实体 表面或内部产生孢子。但在