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血痕检验,中山医学院法医物证教研室李建金,概述肉眼检查血痕预试验血痕确证试验种属鉴定血痕的个人识别,血痕（bloodstains),血液在人体外干燥后形成的斑迹称为血痕血痕检验是法医物证检验中最常遇到和最重要的项目。,血痕的特点：,现场血痕的分布，形状可推断性质，被害人死亡原因，案件发生的时间，地点等血液一旦离开人体降解和腐败速度迅速应及时提取和送检,血痕检验的目的和要求,是否为血痕是否为人的血痕人血痕的个体识别(ABO，DNA)人血痕的其它检验（性别、部位、时间、量等）,检验程序,肉眼检查,血痕的部位血痕的颜色:大概推断出血时间血痕的形状:滴状、流柱状、擦拭状、喷溅状、血印痕、血泊、血水、隐蔽血痕血痕的范围：估计出血量,颜色变化：Hb-变性Hb-正铁血红素-血红素-血卟啉暗红-红褐-褐绿-褐黄-灰色溶解度：时间越长越难溶解。氯的渗透：血痕中的氯随时间经过，逐渐向基质周围渗透，时间越长，则渗透的范围越大。,血痕的形状,血痕预试验,预试验（preliminarytest)目的：从大量可疑血痕中筛除不是血痕的检材意义：阳性结果仅表示可能是血但阴性结果可断定不是血痕,血痕预试验,联苯胺试验,1,酚酞试验,2,氨基比林试验,3,孔雀绿试验,4,一、联苯胺试验原理：血红蛋白具有过氧化物酶的活性，可使过氧化氢释放出新生态氧，将无色联苯胺氧化为蓝色（联苯胺蓝）。H2OHb/hematinPoH2O+联苯胺O联苯胺蓝（无色）（紫蓝色）,联苯胺试验操作,剪取检材滤纸轻擦斑痕依次滴加,冰醋酸联苯胺无水乙醇饱和液过氧化氢,*阳性结果：,紫蓝色,可能是血痕,video,二、酚酞试验原理与联苯胺试验相同，红色为阳性。三、无色孔雀绿试验原理：新生态氧将无色孔雀绿氧化成孔雀绿。青蓝色为阳性。四、氨基比林试验原理与联苯胺试验相同，紫蓝色为阳性。,确证试验Conclusivetest,目的：确证检材是否为血检测检材中是否有血红蛋白或其衍生物阳性结果可确证为血痕，但阴性并不能否定血痕灵敏度低，检材经污染后常呈假阴性,确证试验,1,血色原结晶试验,3,光谱检查,2,氯化血色素结晶试验,一、血色原结晶试验原理：血红蛋白在碱性溶液中分解为正铁血红素和变性珠蛋白，还原剂将正铁血红素还原为血红素，血红素与变性珠蛋白、其它含氮化合物结合形成血色原结晶（樱红色）。,二、氯化血色素结晶试验原理：血红蛋白（酸性下）-正铁血红素+氯离子-氯化血色素结晶（褐色）。,三、光谱检查原理：血红蛋白及其衍生物均是有色物质，具有吸光性，在分光镜下可见特定吸收线（黑色）。,种属试验,种属鉴定（speciesidentification)血痕的种属试验是血痕鉴定的一个关键必须确定血痕是人血后才能做DNA分析,种属试验,沉淀反应免疫扩散试验抗人球蛋白消耗试验抗人血红蛋白胶体金试验间接酶联免疫吸附试验DNA检验,沉淀反应（percipitationreaction)原理:可溶性抗原与相应抗体在适当电解质存在的条件下发生特异性结合，当抗原与抗体的比例适合时，经一段时间可形成肉眼可见的抗原-抗体复合物沉淀。,沉淀反应的条件,抗血清的制备：血痕的种属鉴定常采用人的血红蛋白和人的血清蛋白免疫动物而获得相应的抗血清，即抗人血红蛋白血清和抗人血清蛋白血清。抗血清须具备种属特异性和器官特异性种属特异性抗体只对某一物种的抗原发生特异性反应器官特异性抗体只对某一器官成分发生特异反应,交叉反应：,抗体除与其相应的抗原发生特异反应外，有时会与其他抗原发生交叉反应。产生的原因：(1)人与动物血清蛋白有共同的抗原。(2)人与有些动物血红蛋白分子结构差异小。解决方法：吸收法除去交叉反应性抗体稀释抗原。将抗原溶液稀释500l0000倍通常类属反应容易消除，近亲反应难以消除,(二)血痕浸出液的制备1血痕浸出液的制备生理盐水浸泡血痕212h基本要求：澄清、透亮、淡稻草黄色离心沉淀，吸取上清作沉淀反应。陈旧血痕的蛋白不易溶解，可适当延长浸泡时间,三）影响沉淀反应的因素温度、PH、离子强度、抗原抗体的浓度和比例等。,环状沉淀试验(ringpercipitation)原理：可溶性抗原与相应抗体结合相遇且比例适合时，形成抗原-抗体复合物沉淀，在抗原与抗血清的界面出现白色沉淀环。方法：反应管中加入抗血清血痕浸出液层叠于抗血清之上室温静置1h后观察注：制备浸出液的浓度：1/1000左右抗体的制备（免疫家兔而得）抗人血红蛋白抗体抗人血清抗体,阴性对照阳性对照检材是人血空白对照阴性对照,已知人血痕,检材血痕,动物血痕,空白检材,兔抗人血红蛋白血清,兔血清,抗人血红蛋白胶体金试验胶体金吸附免疫球蛋白，固定在硝纤膜上，与相应抗原结合后再与相应抗体结合，胶体金颗粒聚集，呈现红色。适用于微量检材,胶体金,抗原,抗体,(-)仅在控制区出现一条红色带而在测定区无红色带的出现为阴性(+)在控制区和测定区都有红色线的出现则为阳性，表明检材中有人的Hb,间接酶联免疫吸附试验（ELISA）enzyme-linkedimmunosorbentassay是一种固相酶免疫分析法。1、将血痕浸泡液包被于反应板上。2、抗人血清抗体滴于反应板上。3、加入酶标羊抗兔抗体。4、加入底物显色。不显色-阴性褐色-阳性,DNA检验,根据Alu序列作种属鉴定Alu家族：DNA中一段中度重复序列，重复单位长约300bp。其中在170bp附近有限制性内切酶Alu切割的AGCT序列，命名为“Alu”家族。Alu序列为人和灵长类所特有，具有种属特异性。用PCR扩增血痕检材Alu家族进行检测，作种属鉴定。,Alu引物序列：Alu9.15-GGCACTTTGGGAGGCCAAGG-3Alu9.25-TACAAGCTTGTGCCACCATGCCCAAC-3扩增产物在2琼脂糖凝胶中电泳，可获得DNA长度为130bp的特异性条带。牛、大鼠、蛙、鲫鱼等的扩增片段大于130bp，且扩增产量非常少。除猴血外，其他动物均无扩增产物。,根据28SrRNA序列鉴定种属,40s人类rRNA28s60s5.8s5s28srRNA编码序列的区域进化缓慢相对保守，但保守区中的可变区进化较快，种属之间差异较大。针对这一区域进行PCR扩增，可获得人和动物有差异的特异性片段。,28SrRNA引物序列,引物A：5一ATCTAGTAGCTGGTTCCCTC-3引物B：5-CCTCTAATCATTCGCTTTAC-3经PCR扩增，电泳检测，人类DNA扩增片段为108、104、101及99bp，主要产物为99bp，不同动物PCR扩增产物长度不同。,细胞色素b基因序列,位于mtDNA上具有种属差异，几乎所有的生物检材都可检验。检测的灵敏度较高人和其他哺乳动物的细胞色素b基因片段均存在AluI酶切位点，但酶切片段大小不同，可区分人与其他哺乳动物。,引物序列,引物1：5一CATCGACCTTCCAGCCCCATCAAACAT-3引物2：5-TGTTCTACTGGTTGGCCTCCAATTCA-3PCR扩增产物琼脂糖凝胶检测，可见一条981bp长的DNA片段两种限制酶切割(AluI、NcoI)聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，银染色方法显现酶解片段人类与动物酶切片段大小不同。,血痕的个人识别,血型测定血清型红细胞酶型血痕的DNA分析血痕的性别鉴定其他,凝集原（抗原）测定1、吸收试验（absorption-inhibitiontest)：原理：血痕上的抗原与其相应的抗体结合，使抗体的效价下降或消失，不能再与相应的指示红细胞发生凝集反应,血痕ABO血型检测,方法：取血痕二份（lcm0.5cm），剪碎分置二根试管内加抗A抗、抗B（效价1632，0.1ml）浸泡过夜取出浸泡液，测抗A、抗B抗体效价,根据血清在与血痕吸收反映前后的效价改变情况来推断血痕所含的血型抗原种类结果判断：检材无血痕部分吸收后抗体效价不降低，而待测血痕吸收后抗体效价比空白检材低3级或3级以上为阳性注：吸收试验结果稳定可靠，但要求检材量较多对于较少检材或陈旧血痕要降低抗体效价，以免出现假阴性,凝集原测定,2.解离试验（elutiontest)又称吸收-解离试验（absorption-elutiontest）原理：Ag-Ab的结合是可逆的，在56oc加热时原本结合的抗体可解离出来，与新加入的指示红细胞表面抗原发生凝集注：抗血清（128256倍）0.1%指示红细胞,解离试验原理,试管解离法玻片解离法结果判断：低倍镜下视野以每3个或3个以上红细胞凝集者为一处凝集，以出现3处或3处以上凝集者为（+）,解离试验镜下结果判断,（-）（+）注：必须用已知A型血痕、已知B型血痕作已知对照，对照准确才能判断待测血痕的结果。,血痕ABO血型检测,凝集素（抗体）测定原理：用已知红细胞的表面抗原推测检材血清中的凝集素，继而推测检材的抗原类型试剂：0.2%的A、B、O红细胞悬液器材：玻片/试管、保湿盒、显微镜,1、玻片法：血痕分为二份，置于玻片二端，一份加A红细胞，一份加B红细胞。镜下观察红细胞凝集情况。,A,B,2、试管法：血痕用少量生理盐水浸泡，过夜，离心。上清液分为二份，分别置于试管内。分别加入A红细胞与B红细胞，离心。肉眼观察红细胞凝集情况。,TheABOBloodsystem,血痕血清型测定,应用于法医血痕检验的遗传多态性蛋白成分有Hp、Gc、Gm、Km电泳法血痕中含有大量的血红蛋白，会干扰血清型的分型，解决方法：对检材作前处理，除去血红蛋白免疫固定技术,血痕红细胞酶型测定,电泳分离和酶活性显色相结合酶的活性不稳定，易受温度和适度的影响用DDT处理血痕后可提高检出率,血痕DNA分析,DNA分析技术的关键在于DNA的提取有机溶剂提取的DNA纯度较高Chelex-100提取方法简单，但提取纯度较差仅适用于PCR在PCR反应液中加入小牛血清蛋白可消除血红蛋白衍生物、染色染料的影响检测分型STR、HLA-DQ、PM、mtDNA等,血痕的性别鉴定,性染色质检查同时扩增两条染色体的特异性片段牙釉基因（amelogeninAMG)ZFY/ZFX基因扩增Y染色体特异性片段,性染色质检查：,盐酸阿的平染色（荧光染料），荧光显微镜下观察Y染色质（绿色荧光小体）。计数100个细胞，Y染色质检出率大于10%可判定为男性。,牙釉基因（amelogeninAMG),Xp22，编码牙釉质蛋白Y染色体：类牙釉基因（AMGL)同时扩增AMG/AMGL，X特异片段长977bp,Y特异片段长788bp,788977,男女,ZFY/ZFX基因,位于Y染色体的ZFY基因片段长340bp位于X染色体的ZFX基因片段长488bp,340488,男女,扩增Y染色体特异性片段,扩增男性Y染色体特有的片段用人类ALU序列作对照,YALU,男女,血痕的其他检验,出血部位的判断血痕混有组织细胞时可根据细胞形态推测出血部位如：鼻部纤毛柱状上皮细胞、口腔扁平上皮细胞、阴道上皮细胞，月经血子宫内膜细胞等出血量的测定计算重量、分光光度计测定出血时间的测定,出血部位的判断,凃片检查不同部位的特殊成份：鼻出血：可见纤毛柱状细胞。口腔出血：可见口腔粘膜上皮细胞。肺出血：可见纤毛柱状细胞及口腔粘膜上皮细胞。胃出血：可见食物残渣、胃粘膜上皮细胞及口腔粘膜上皮细胞。内脏损伤出血：可见相应的组织细胞。噬血昆虫的血：可见