（植物病理学专业论文）水稻鞘氨醇激酶OsSPK1的克隆鉴定与功能分析.pdf

浙江大学硕士学位论文 摘要 鞘脂普遍存在于包括植物在内的各种真核生物的生物膜中。鞘脂及其衍生物 在生物体内参与了极重要的细胞功能，它们可以作为第二信使调控细胞生长、分 化、存活、增殖和程序性死亡等。近年来，1 磷酸鞘氨醇作为细胞外递质和胞内 第二信使的功能受到关注。细胞内的s p p 水平高低是由其合成、分解和转运到 胞外这三者相互作用调控，其中鞘氨醇激酶催化鞘氨醇形成1 一磷酸鞘氨醇，1 磷酸鞘氨醇磷酸酶催化1 一磷酸鞘氨醇还原为鞘氨醇，同时1 磷酸鞘氨醇裂解酶 将1 磷酸鞘氨醇分解。为探讨s p p 在植物抗逆反应中的作用，我们克隆得到水 稻中编码鞘氨醇激酶的基因，o s s p k l ，并通过转基因烟草分析了o s s p k l 在抗 病反应中的功能。 以水稻e d n a 文库为模板，p c r 扩增得到了水稻s p k 基因o s s p k l 全长 e d n a 。o s s p k l 全长e d n a 序列为2 9 1 0b p ，含有一个2 2 4 7b p 的o r f 区域， 预测编码一个7 5 7 个氨基酸组成的s p k 蛋白，推测的分子量为8 3 2 7 k d a ，等电 点为7 ，4 。o s s p k l 基因位于水稻1 0 号染色体上，含有8 外显子和7 个内含子。 根据水稻o s s p k l 基因氨基酸序列与人类、老鼠、酵母、线虫和植物中的s p k s 家族的氨基酸序列进行比对分析，我们发现都包含一个1 2 5 a a 左右的保守 d a g k 催化结构域。同样，o s s p k l 氨基酸序列还含有保守的c 1 c 4 保守结 构域。在c 1 结构域中的g x g x 基序是这类鞘脂激酶的a 丁p 结合位点。 为了进一步明确o s s p k l 在水稻抗病性中的作用，我们将o s s p k l 基因编码 区置于植物双元载体c h f 3 p p 2 p 2 1 2 中c a m v3 5 s 组成型强表达启动子的下游， 运用根癌农杆菌介导的叶盘法转化烟草，经卡那霉素抗性筛选和p c r 检测获 得1 4 株o s s p k l 转基因植株。r t - p c r 分析表明，转基因t l 代烟草植株都正常 表达o s s p k l 基因。抗病性测定表明，过量表达o s s p k l 的转基因烟草植株提高 了对烟草黑胫病菌( p h y t o p h t h o r ap a r a s i t i c av a t n i c o t i a n a e ) 和烟草野火病 ( p s e u d o m o n a ss y r i n g a ep v t a b a c i ) 的抗病性。 关键词：水稻( o r y z as a t i v al ) ：烟草( n i c o t i a n at a b a c u ml ) ；诱导抗病性：鞘 氨醇；1 一磷酸鞘氨醇：鞘氨醇激酶；甘油二酯激酶 浙江大学硕士学位论文 a b s t r a c t s p h i n g o l i p i d sa r eu b i q u i t o u sc o n s t i t u e n t so fm e m b r a n es y s t e m si na l le u k a r y o t i c o r g a n i m s t h e r ei sn o ws u b s t a n t i a le v i d e n c et h a ts p h i n g o l i p i d sa n dt h e i rm e t a b o l i c p r o d u c t sa r ei n v o l v e d i nt h e r e g u l a t i o no fc e l lg r o w t h ，d i f f e r e n t i a t i o n ，s u r v i v a l ， p r o l i f e r a t i o na n dp r o g r a m m e dc e l ld e a t hv i at h e i rp a r t i c i p a t i o na ss e c o n dm e s s e n g e r s i ns p e c i f i cs i g n a l t r a n s d u c t i o np a t h w a y s a san o v e lc l a s so f s p h i n g o l i p i dm e t a b o l i t e s ， s p h i n g i s i n e 一1 一p h o s p h a t e ( s p p ) f u n c t i o n sa sas e c o n dm e s s e n g e ra n da sl i g a n d sf o rc e l l s u r f a c er e c e p t o r s c e l l u l a rl e v e l so fs p pa r el a r g e l ym e d i a t e db yi t sf o r m a t i o nf r o m s p h i n g o s i n eb ym ea c t i v i t yo fs p h i n g o s i n ek i n a s e ( s p k ) a n dt oal e s s e re x t e n tb yi t s d e g r a d a t i o nb ys p pl y a s ea n ds p pp h o s p h a t a s ea c t i v i t i e s i no r d e rt oe l u c i d a t et h e b i o l o g i c a lf u n c t i o no fs p p i np l a n tr e s p o n s e st oa b i o f i ca n db i o t i cs t r e s s e s 、w ec l o n e d a n di d e n t i f i e dar i c es p k g e n e ，o s s p k l ，a n ds t u d i e di t sf u n c t i o ni nd i s e a s er e s i s t a n c e r e s p o n s eb yo v e r e x p r e s s i n gi nt r a n s g e n i ct o b a c c o 1 b ee d n ao f o s s p k jw a sa m p l i f i e db yp c r u s i n gp h a g ed n ap r e p a r e df r o ma r i c ec d n al i b r a r ya st e m p l a t e t h ef u l l - l e n g t hc d n ao ft h eo s s p k il s2 9 1 0b dw 破l ap r e d i c t e do p e nr e a d i n gf r a m eo f2 2 4 7b pi nl e n g t h ，w h i c hp r e d i c t e dt oe n c o d ea p u t a t i v es p kp r o t e i nw i t h7 5 7a m i n oa c i dr e s i d u e sw i 廿lap r e d i c t e dm o l e c u l a rm a s so f 8 3 2 7k d aa n dp io f 7 4 t h eo s s p k lg e n ew a sl o c a t e do nc h r o m o s o m e1 0o f t h er i c e g e n o m e sa n di sc o m p o s e do f8e x o n sa n d7i n t r o n s a l i g n m e n to fo s s p k lw i t l lo t h e r s p k sf r o mh u m a n ，m o u s e ，y e a s t ，c a e n o r h a b d i t i se l e g a n sa n dp l a n t ss h o w e dt h a t o s s p k lh a sac o n s e r v e dd i a c y l g l y e e r o lk i n a s ec a t a l y t i cd o r a a i no f 1 2 5a m i n oa c i d r e s i d u e si nl e n g t h a l s o o s s p k lc o n t a i n sa ne x t r ac o n s e r v e dc 1 c 4r e g i o n s i n c l u d i n gg x g x m o t i fi nt h ec 1d o m a i n w h i c hm a yb ei n v o l v e di na t pb i n d i n g t ob e 仕e ru n d e r s t a n dt h ef u n c t i o no f 伪即足，i nd i s e a s er e s i s t a n c er e s p o n s e w e c l o n e dt h eo s s p k lc o d i n gr e g i o ni n t oap l a n tb i n a r yv e c t o r , c h f 3 p p 2 p 2 1 2 ，u n d e r c o n t r o lo ft h ec a m v3 5 sp r o m o t e ra n dt r a n s f o r m e dt o b a c c ol e a fd i s c sb y a g r o b a c t e r i u m m e d i a t e dt r a n s f o r i l l a t i o n at o t a lo ff o u r t e e ni n d e p e n d e n to s s p k l t r a n s g n e i ct o b a c c ol i n e sw e r eo b t a i n e da n dc o n f i r m e db yp c rd e t e c t i o n r t p c r a n a l y s i si n d i c a t e dt h a to s s p k ig e n ew a st r a n s c r i b e di nt h et r a n s g e n i ct o b a c c op l a n t s w ee v a l u a t e dd i s e a s er e s i s t a n c eo ft h et r a n s g e n i cl i n e sa n df o u n dt h a tt h et r a n s g e n i c p l a n t ss h o w e de n h a n c e dd i s e a s er e s i s t a n c ea g a i n s tp h y t o p h t h o r ap a r a s i t i c a v a t 疗i c o l i a n a ea n dp h y t o p h t h o r ap a r a s i t i e av a rn i c o t i a n a e 0 u rp r e l i m i n a r yr e s u l t s i n d i c a t et h a to s s p k1 - m e d i a t e ds p ps i g n a l i n gm a yp l a yar o l ei nd i s e a s er e s i s t a n c e r e s p o n s ei np l a n t s k e yw o r d s ：r i c e ( o r y z as a t i v al ) ；t o b a c o o ( n i c o t i a n at a b a c u ml ) ；s p h i n g o s i n e ( s p h ) ；s p h i n g i s i n e 一1 - p h o s p h a t e ( s p p ) ；s p h i n g o s i n ek i n a s e ( s p k ) ；d i a c y l g l y c e r o l k i n a s e ( d a g k ) 浙江大学硕士学位论文 图表目录 图l水稻鞘氨醇激酶基因o s s p k lo r f 的p c r 扩增以及重组质粒的酶 切鉴定 图2o s s p k l 核菅酸序列及预测的氨基酸序列 2 2 2 3 图3 水稻鞘氨醇激酶基因的基因结构和预测的蛋白功能保守结构域2 4 图4 水稻o s s p k l 与其他生物s p k 蛋白保守区氨基酸序列的同源性分析2 5 图s 水稻o s s p k l 蛋白与其他生物s p k 蛋白氨基酸序列的系统进化关系2 7 图6 植物双元表达质粒c h f 3 一o s s p k l 的构建与鉴定2 8 图7 烟草叶盘转化及转基因烟草的获得2 9 图8o s s p l 转基因烟草植株的p c r 检测结果3 0 图9 过量表达水稻o s s p k l 基因的t 2 代烟草植株的抗性筛选3 1 图1 0 烟草野火病菌叶片离体接种和黑胫病茎部活体接种后不同级别症状 代表3 2 图1 1 过量表达水稻o s s p k i 基因的烟草植株提高对烟草黑胫病的抗性3 3 图1 2 过量表达水稻o s s p k l 基因的烟草植株提高对烟草野火病的抗性3 4 表l 过量表达水稻o s s p k l 基因的t 2 代烟草植株的抗性筛选_ 3 5 表2 过量表达水稻o s s p k l 基因的烟草植株提高对烟草野火病的抗性3 5 浙江大学硕士学位论文 致谢 本论文是在导师宋风呜教授的悉心指导下完成的。本论文从论文选题，实验 设计和工作开展，论文撰写、修改、定稿等各个方面都倾注了导师大量的心血。 “学高为人师、身正为人范”，宋老师严谨务实的治学态度、渊博深广的学术知 识、锐意进取的科研作风和宽广仁厚的为人不仅使我在专业上不断进步，而且使 我对科研精神和为人处世有了更深刻的理解，这将使我终身受益。在本论文完成 之际，谨让我向恩师致以最诚挚的谢意和最衷心的祝愿。 感谢郑重老师和葛秀春老师，他们在我的求学过程中给予了很大的帮助。本 研究的完成离不开他们给予的深切指导、热忱帮助和宝贵的意见。在此衷心感谢。 感谢植物病理组的全体老师和同学们，本实验室的全体师兄妹们，特别是张 卫东、朱廷恒、曹亦菲、罗红丽、方丽、李大勇、李国钧、任琰、宋莉芸、王晓 娥、张慧娟、吴叶飞、刘海青、谌江华、刘辉志、杨雅云、张新春、余辛。他们 与我朝夕相处，无论是在学习上、实验工作上和日常生活中，都给了我无私的帮 助和深厚的友谊，对这一切我将永远铭已于心。 深深的感谢一直以来给予我关爱、理解、支持和帮助的家人和朋友。 陈洁 2 0 0 6 年5 月于华家池畔 浙江大学硕士学位论文 1 文献综述 1 1 植物的抗病信号传导途径： 植物在生长过程中，经常受到病害的侵染。植物在与病原物的长期相互影响 协同进化的过程中，形成了一套复杂而有效的抗病机制来抵御细菌、真菌和病毒 大多数病原物的侵入、扩展。在植物与病原相互识别、交换信息的同时，植物体 内也发生了一系列的信号传导，各信号转导途径之间相互交叉形成网络，从而产 生一系列防卫反应。一方面，植物受到病原入侵后时诱导产生了防御结构( 周皮、 胼胝体、胶滞体、侵填、乳突、晕圈等) 及一些功能分子( 植保素、酚类物质、病 程相关蛋白等) ，它们在植物抗病作用中起直接作用：另一方面，植物细胞的木 质化和木质素沉淀、富羟蛋白的积累及有关酶系统的诱发合成等，在植物抗病作 用中起间接作用。 在植物与病原物互作表现基因对基n ( g e n ef o rg e n e ) 的抗病性时，植物抗病基 i n ( d i s e a s er e s i s t a n c eg e n e ，rg e n e ) 的产物作为受体分子，识别来自病原物对应的 无毒基因( a v i r u l e n c eg e n e ，a v rg e n e ) 编码的激发子，通过激活胞内信号转导途径， 在细胞核内的终端信号激活各种防卫反应相关基i n ( d e f e n s eg e n e s ) 的表达，表现 抗病性( f l o re t f ，1 9 7 1 ；k e e ne ta 1 ，1 9 9 0 ；s t a s k a w i c ze ta 1 ，1 9 9 5 ；v a nd e re la 1 ， 1 9 9 8 ) 。在过去的研究中，对植物抗病基因的分子本质及其介导的抗病信号传导 途径取得了瞩目的进展。利用转座子标签法( t r a n s p o s o nt a g g i n g ) 及图位法 ( m a p - b a s e dc l o n i n g ) 从烟草、拟南芥、番茄、水稻等双子叶和单子叶植物中克隆 获得分别控制真菌、细菌、病毒以及线虫等病害抗性的多个抗病基因。从已克隆 的抗病基因看，r 基因产物( r 蛋白) 具有氨基酸序列的保守性以及特征性结构域 ( t a n ge l a l ，1 9 9 6 ；s c o f i e l d 甜耐，1 9 9 6 ；l e i s t e r e l 耐，2 0 0 0 ；j i ae t 口，2 0 0 0 ) 。根据抗 病蛋白的结构特征，可将抗病基因分为以下几类：( 1 ) 细胞质丝氨酸苏氨酸蛋 白激酶型( c y t o p l a s m i cs e r i n e t h r e o n i n ep r o t e i nk i n a s e ，s t k ) ，如番茄抗细菌叶斑病 的基因p t o ，其编码蛋白p t o 就是一种丝氨酸苏氨酸激酶。( 2 ) 丝氨酸苏氨 酸蛋白激酶一富含亮氨酸重复型( s t k l e u c i n e r i c hr e p e a t ，e r r ) ，如水稻抗白叶 枯病的基因x a 2 1 。x a 2 l 蛋白具有3 个受体激酶特征的主要结构域：胞外l r r s 结构、跨膜结构域和胞内激酶结构域( s o n ge t a l ，1 9 9 5 ) 。( 3 ) 含富含亮氨酸重复序 浙江大学硕士学位论文 歹l j ( l e o c i n e - - r i c hr e p e a t ，l r r ) 编码序列的抗病基因，如番茄c 厂基因类型，其蛋 白包含胞外n 端l r r 重复区、膜锚定蛋白和胞质内c 末端部分。( 4 ) 玉米抗圆 斑病的基因h m l ，其编码的解毒酶能钝化病原真菌所产生的h c 毒素，代表着抗 病基因中与病原物亲和性因子作用的一类基因。 绝大多数r 基因编码的蛋白都含有一个氨基端信号域、一个核苷酸结台位点 ( n u c l e o t i d eb i n d i n gs i t e , n b s ) 和富含亮氨酸的重复序y l j ( 1 e u c i n e r i c hr e p e a t s ，l r r s ) ( d a n g le l a l ，2 0 0 1 ；v a n d e re t a l ，1 9 9 8 ；h a m m o n de t a l ，1 9 9 7 ) 。这些n b s - l r r 型 的抗病基因又可以分成两个亚类。一类是烟草中t m v 抗病基因、亚麻抗锈病 的基因上6 及拟南芥抗霜霉病的基因r p p 5 等，它们编码的蛋白具有与果蝇t o l l 和人类白细胞介素l 受体相类似的氨基端t i p 结构域( o n e i l le ta 1 ，1 9 9 8 ；v a n d e r e ta l ，1 9 9 8 ) 。另一类是n b s l i 泳一c c ( 又称n b s l r r 一亮氨酸拉链， n b s l r r l e u c i n ez i p p e r ) q 7 类包括拟南芥r 只铂和r p m l 、水稻尸胁以及马铃薯 r x l 和r x 2 等( p a ne t a l ，2 0 0 0 ) 。最近的研究中发现白粉病抗病基因r p w 8 = j 常特 殊：这个来源于拟南芥的蛋白比较小，只有一个氨基端的跨膜结构域和一个c c 结构域，但是有着广谱抗性( x i a oe ta 1 ，2 0 0 3 ) 。 在拟南芥尺基因介导的信号传导途径方面的研究工作中，根据推导的蛋白 氨基酸序列来看，已克隆鉴定的拟南芥抗病基因的产物大多属于n b l r r 类的 抗病蛋白。为了鉴定r 基因下游信号传导途径的可能组分，运用反向遗传学方法 已经分离和鉴定到一批能抑制已知r 基因功能的突变体，如n d r l ( n o n r a c e ，s p e c i f i c d i s e a s er e s i s t a n c e ) 、e d s l ( e n h a n c e dd i s e a s es i i s c e p t i b i l i t y ) 等。研究表明，n d r l 突变 体完全丧失由r p s 2 、r p s 5 和r p m l 基因控制的对p s y r i n g a e 的抗性( c e n t u r ye l a l , 1 9 9 5 ) ；e d s l 突变体失去由不同r p p 基因和r p s 4 基因控制的分别对霜霉病 ( p e r o n o s p o r a p a r a s i t i c a ) 并gp s y r i n g a e 的抗性。n b l r r c c 亚类的拟南芥r 基因 需要n d r l ，而n b ，l r r t i r 亚类则需要e d s l ，但不会同时需要二者。但是， 还有一些n b l r r c c 亚类的且基因( 如r p p 7 、r p p 8 和r p p l 3 等) 既不需要n d r l 和p 口s ，也不需要e d s l 和p a d 4f a a r t se ta 1 1 9 9 8 ；m c d o w e l le ta 1 ，2 0 0 0 ) 。这 些结果说明，在拟南芥中至少存在三条由月基因所介导的抗病信号传导途径 ( g l a z e b r o o k ，2 0 0 i ) 。 当植物受到无毒性病原物侵染时通常会发生过敏反应( h y p e r s e n s i t i v e r e s p o n s e ，h r ) 。h r 是植物抗病反应的一种典型症状，其特征是在病原物侵染部 浙江大学硕士学位论文 位寄主植物细胞迅速而局部性死亡形成枯斑，导致病原物不易获得营养，从而限 制病原物生长和扩散。活性氧迸发( o x i d a t i v eb u r s 0 在激发h r 中起着至关重要的 作用，也是植物对病原菌应答的最早期反应之一( l a m be ta l ，1 9 9 7 ； w o j t a s z e k ，1 9 9 7 ) 。随着h r 产生局部抗性之后，植物常会在整体水平上产生非专 化抗性，从而对病原菌的再侵染，甚至对其它病原物的侵染均产生很强的抗性， 即系统抗性( s y s t e m i ca c q u i r e dr e s i s t a n c e ，s a r ) 。s a r 是指在植物受到坏死性病原 物侵染产生局部坏死斑或者经化合物的诱导处理后，在未侵染和未处理组织中产 生对以后多种病原物侵染的增强抗性( r o s se ta l ，1 9 6 1 ；r y k se ta 1 ，1 9 9 6 ；s t i c h e r e ta 1 ，1 9 9 7 ) 。s a r 是一种在植物抗病中起重要作用、且在植物界普遍存在的可诱 导性防御机制，s a r 显著区别与其它抗病反应的主要标志是：对病原菌的广谱 抗性，长效性以及病程相关( p a t h o g e n e s i s - | r e l a t e d ，p r ) 蛋白的表达( u k n e se la 1 ， 1 9 9 2 ；s t i c h e re ta l ，1 9 9 7 ) 。 1 2 植物中磷脂信号传导途径 磷脂不仅是生物膜的主要骨架成分，而且还参与细胞的信息传递过程，参与 第二信使的产生。磷脂在磷脂酶的作用下，水解为脂肪酸，肌醇三磷酸 ( t r i p h o s p h a t ei n o s i t o k ，i p 3 ) 、甘油二酯( d i a c y l g l y c e r o l ，d a g ) 、磷脂酸( g h o s p h a t i d i c a c i d ，p a ) 平n 乙酰胆碱等。i p 3 、p a 、d a g 和乙酰胆碱将外部信号转换并传递到胞 内，引发一系列级联反应，完成细胞对外部信号的响应过程( w a n g , 1 9 9 9 ； c h a p m a n ，1 9 9 8 ；c h e t a le t 甜，1 9 8 2 ) 。由磷脂酶水解磷脂产生第二信使物质，进行 信号传递的过程称为磷酸肌醇脂信号途径( m u n n i ke ta 1 ，1 9 9 8 ；m u n n i ke ta l ， 2 0 0 1 ) 。肌醇磷脂( i n o s i t o l p h o s p h o i i p i d ) 主要分布在质膜内侧，约占膜磷脂总量1 0 ，主要有三种：磷脂酰肌醇( p h o s p h a t i d y l i n o s i t o l ，p i ) 、磷脂酰肌醇4 - 磷酸 ( p h o s p h a t i d y l i n o s i t o l ，4 - p h o s p h a t e ，p i p ) 和磷脂酰肌醇一4 ，5 一二磷酸 ( p h o s p h a t i d y l i n o s i t o l ，4 ，5 一b i s p h o s p h a t e ，p i p 2 ) 。按照裂解磷脂底物的部位划分，磷 脂酶基本上可以分成五类，即磷脂酶a l ( p h o s p h o l i p a s ea l ，p l a i ) 、磷脂酶 a 2 ( p h o s p h o l i p a s ea 2 ，p l a2 ) 、磷脂酶c ( p h o s p h o l i p a s ec ，p l c ) 和磷脂酶 d ( p h o s p h ( o l i p a s ed ，p l d ) 和磷脂酶b ( p h o s p h o l i p a s eb ，p l b ) ( m u n n i ke la 1 ，1 9 9 8 ； w a n ge ta 1 ，1 9 9 9 ) 。在植物体内可能存在多种磷脂酶，其d p p l c ( p i p l c ) 和p l d 对 浙江大学硕士学位论文 信号传导的作用更为直接( q i ne l a l ，1 9 9 7 ；k o p k ae t a l ，1 9 9 8 ) 。 1 2 1 磷脂酶c 和甘油二脂激酶信号传导途径 研究发现，激素和生长因子等外界刺激物质能够与细胞表面受体结合，通过 细胞质膜上的o 一蛋白或者硌氨酸蛋白激酶激活p l c 途径( m u r m i k ，1 9 9 8 ；k o p k a e l a 1 ，1 9 9 8 ) 。p l c 包括1 个保守的x 署i i y 域构成的水解域，2 个e f - - h a n d 和1 个c 2 域， 水解p i p 2 产生两个第二信使：i p 3 和d a g ( m u n n i ke ta 1 ，1 9 9 8 ；m u n n i ke la 1 ，2 0 0 1 ) 。 b 分散在细胞质中，通过与内质网上的专一受体结合，能够激发胞内钙离- 子( c a 2 + ) 的释放，调节c a 2 + 钙调素依赖性激酶的活性，启动胞内c a ”信号传导系统，被称 为i p 3 c a 2 + 信号传递途径。研究表明，植物中存在i p 3 c a 2 + 信号传递途径，如 m y c o s p h a e r e l l a p i n o d e s 、p h y t o p h t h o r an c o h a n a e 等真菌的激发子都能刺激豌豆和 烟草悬浮细胞i p 3 水平的增加，从而激活抗病防卫反应( b e r r i d g ee ta 1 ，1 9 9 3 ； m u n n i ke t a l ，1 9 9 8 ) 。而d a g 主要存在的细胞膜上，具有胞内信使的功能。细胞 在受到刺激后d a g 的产生分为二个时相，第一时相d a g 的产生量少且短暂，与 i p 3 的产生相应，主要是p l c 水解p i ，尤其是p i p 2 的结果；随之第二时相d a g 的产 生量多且持久，由细胞膜其它磷脂尤其是磷脂酰胆碱水解产生。第二时相d a g 对蛋白激酶c ( p r o t e i nk i n a s ec ，p k c ) 的激活具有重要意义，而且p l d 年i i p l a 2 水解 的其它产物如溶血磷脂酸和花生四烯酸( a r a c hi d o ni ca c i d ，a a ) 等亦参与协同 d a g 增强并延长p k c 的活性。以上被称为p l c d a c r 信号传导途径，它对调控配 子形成、受精、细胞增殖、早期发育和分化以及对外界环境因子应答的信号传导 过程是必需的( n i s h ，1 9 9 2 ；b e r r i d g ee ta 1 ，1 9 9 3 ；m u n n i ke ta 1 ，1 9 9 8 ) 。然而植物中 缺少p k c ，d a g 被甘油二酯激酶( d i a c y l g l y c e r o lk i n a s e ，d a g k ) 快速的催化生成 p a 。p a 具有极高的代谢速率，在胞内可迅速产生和灭活，是细胞内重要的第二 信使分子，在各条磷脂代谢途径中起枢纽的作用，与多条抗病防卫反应密切相关 ( m u r m i ke t a l ，2 0 0 l ；f a r m e re ta 1 ，1 9 9 9 ；d e a ke t a l ，1 9 9 9 ；m u t m i ke ta l ，2 0 0 1 ；l e e e fa 1 ，2 0 0 1 ) 。 在用真菌激发子诱导处理的大豆细胞中，p l c 的激活同样与氧化迸发密切相 关( l e g e n d r ee la 1 ，1 9 9 3 ) 。在拟南芥叶片、烟草细胞、番茄细胞和大豆细胞中， p a 处理能够诱发了氧化迸发和激活m a p k 信号传递链，但是当用p l c 抑制剂 新霉素以及u 7 3 1 2 2 抑制剂处理能够抑制活性氧的产生，这表明p a 存在于氧化 浙江大学硕士学位论文 迸发的上游；并且p l c 抑制剂也可以抑制了m a p k 信号传递( j o o s t e n e ta 1 ，1 9 9 9 ； s a n ge t a l ，2 0 0 1 ；l e ee t a l ，2 0 0 1 ) 。m a p k 信号传递链是单细胞和多细胞真核生物 中的一条共有信号传递途径，在传递各种胞外刺激信号的同时，还调节着抗病反 应的快慢和强弱，在抗病基因介导的信号传导途径中具有重要作用( d a v i se ta 1 ， 2 0 0 0 ；m a d h a n ie ta i ，1 9 9 8 ；h a r d i ee ta 1 ，1 9 9 9 ) 。同时研究发现在离体条件下，p a 和c a 2 + 都能激活钙调素依赖性激酶在大肠杆菌中的表达，依赖磷酸肌醇的蛋白激 酶1 能够特异性地结合p a ( f a r m e re ta 1 ，1 9 9 9 ；d e a ke ta 1 ，1 9 9 9 ) 。这表明 p l c d g k 信号是激活植物多个防卫反应所必须的。 研究还表明，磷酸肌醇系统参与了a b a 介导的逆境信号传导，尤其是在气 孔开闭的调节过程。a b a 通过诱导p l c 的产生或者直接激活p l c ，水解p i p 2 ， 开启钙离子( c a 2 + ) 通道激发c a 2 + 的释放，同时抑制了保卫细胞k + 离子通道，调控 气孔的关( m u n n i ke ta 1 ，1 9 9 8 ；l e m t i r ie ta 1 ，2 0 0 0 ；l e ee ta 1 ，2 0 0 1 ) 。利用p l c 特 异性抑制剂v - 7 3 1 1 2 处理可以抑制由a b a 处理引起的胞质c a 2 + 振荡、气孔关闭 以及p l c 的活性，而v 7 3 1 1 2 的一种无活性类似物却不能，表明v - 7 3 1 1 2 抑制 效应是由抑制p l c 活性而产生的，p l c 是a b a 信号传导途径所必需的( b r e a r l e y “口，1 9 9 7 ；r i t e h i ee ta 1 1 9 9 8 ) 。 1 2 2 磷脂酶d 信号传导途径 自1 9 9 4 年从萌发的蓖麻种子中获得有活性的p l d 酶( w a n ge t a l ，1 9 9 4 ) 后， 相继从8 种植物中分离克隆得到了1 5 种不同结构的p l d 基因，发现p l d 的n 末端有c a 2 + 与磷脂结合的c 2 区域，是其催化活性部位，c 端为信号刺激感受以 及运输部位。p l d 水解磷脂酰胆碱( p h o s p h a t i d y l c h 0 1 i n e ，p c ) 等结构磷脂，生成胆 碱和p a ( m u n n i ke ta 1 ，1 9 9 8 ) 。p l d 的活性受c a ”磷脂、d a g 、l y s o p a 、p i p 2 和 不饱和脂肪酸如亚麻酸、花生四烯酸、油酸等因子调节( m u n n i ke ta i ，2 0 0 1 ) 。在 植物中，p l d 的快速激活同干旱、渗透压力、霜冻、低温冷害、创伤因子以及 植物防卫反应相关限i t c h i ee ta 1 ，1 9 9 8 ；m u n n i ke t a l ，2 0 0 1 ；w a n ge t a l ，2 0 0 1 ) 。 m t c h i e 和g i i r o v 报道，大麦糊粉层原生质体加人a b a 能增强p l d 活性( 1o 分钟 内) ，增加水解产物p a 。在糊粉层原生质体中直接加入p a ，产生类似a b a 的效应： 抑制淀粉酶，降低胞质c a 2 + 浓度，并且诱导a b a 调节的淀粉酶枯草溶菌素抑制物 浙江大学硕士学位论文 ( a m y l a s es u b t i l i s l ni n h i b i t o r ，a s i ) 、a b a n 自 应( r e s p o n s i v et oa b a ，a a b ) 蛋白的产 生。在a b a 处理前2 0m i n 内加人0 1 的1 正丁醇，以抑制p l d 产物( p a ) 的产生， 导致对a b a 调节过程的阻遏。这种阻遏作用与a b a 激活p l d 在时间上是吻合的， 而且可以被同时加人p a 逆转。以上结果说明，a b a 可激活p l d ，产生p a ，而后 者则参与启动糊粉层对a b a 的响应。此外，研究人员还发现在植物处于水分胁迫 时或用a b a 处理组织，p l d 会被激活以及基因表达也会增加。a b a 处理可增加 p l d 的启动子的转录活性，m r n a 水平和膜结合的活性( x ue ta 1 ，1 9 9 6 ；l ue la 1 ， 1 9 9 7 ；w a n g ，1 9 9 7 ) 。在保卫细胞中，a b a 激活p l d ，水解产生p a ，而p a 又激活 了一系列的信号分子从而导致了k + 通道及气孔的关n ( w a n g ，2 0 0 1 ) 。这些资料都 表明p l d 在a b a 信号中起重要的介导作用。然而与p l c d g k 途径不同的是，p l d 途径中的p l d 和p a 都不影响活性氧的产生( s c h r o e d e re ta 1 ，1 9 9 7 ) 。此外，p l d 还 可被胁迫环境如机械损伤、霜冻、低温冷害、干旱、射线等所激活，引起p l d 酶 活性增力n ( r y ue t a l ，1 9 9 6 ) 。机械伤害可通过c a 2 + 的变化激活p l d 的酶活性，并使 p l d 转移到质膜上，这种p l d 的激活可以看作植物应答环境胁迫的早期事件( r y u e t 甜，1 9 9 8 ) 。在胡萝h 的悬浮培养细胞中，葡萄糖匮乏的初期会产生乙烯跃变， 因此p l d 的激活还被认为是转导乙烯跃变信号的途径之一。乙烯跃变发生在葡萄 糖饥饿前期，通过阻碍p l d 的活性可以延迟衰老，因此p l d 被认为促进乙烯跃变 ( l e ee ta 1 ，1 9 9 8 ) 。 1 3 植物中鞘脂信号传导途径 鞘脂普遍存在于各种动、植物细胞的细胞膜、细胞器膜、载脂蛋白和富脂器 官中。鞘脂质是一类以鞘氨醇为骨架的较复杂的化台物，分为鞘磷脂、鞘糖脂和 神经酰胺。鞘磷脂由脂肪酸、鞘氨醇( s p h i n g o s i n e ，s p h ) 并i 磷酸胆碱三部分组成， 鞘糖脂由脂肪酸、鞘氨醇和糖基构成，神经酰胺是鞘磷脂的一个特殊形式，只是 以氢代替磷酸胆碱( m e r r i l le ta 1 ，1 9 9 6 ；d i c k s o ne ta 1 ，1 9 9 9 ；w o r r a l le ta 1 ，2 0 0 3 ； s p e r l i n ge t a l ，2 0 0 3 ) 。鞘脂及其代谢物参与了许多重要的信号转导过程，进而使 细胞产生各种生物学效应。鞘磷脂酶激活鞘脂质会产生许多物质，如神经酰胺， 进一步激活神经酰胺酶，又可产生鞘氨醇和鞘氨醇1 一磷酸 ( s p h i n g i s i n e 1 一p h o s p h a t e ，s p p ) ，鞘脂及其衍生物在生物体内参与了极重要的细胞 浙江大学硕士学位论文 功能，如细胞膜功能、细胞间接触、细胞识别、通过影响与生长因子受体有关的 蛋白激酶和蛋白激酶c 来调节跨膜信号转导，从而调节细胞生长、分化、增殖、 诱导细胞分化、程序性死亡和干旱胁迫反应等。( k o g ae t a l ，1 9 9 8 ；w o r r a l le t a l ， 2 0 0 3 ；s p e r l i n ge t a l ，2 0 0 3 ；s a n c h e ze ta l ，2 0 0 4 ) 。 近年来，1 - 磷酸鞘氨醇( s p h i n g i s i n e 一1 一p h o s p h a t e ，s p p ) 作为细胞外递质和胞内 第二信使的功能受到关注( h l ae ta l ，2 0 0 1 ；s p i e g e l ，2 0 0 2 ) 。在动物细胞中，胞内1 一磷酸鞘氨醇作为重要信号分子主要调节细胞的生长、增殖、分化、衰老、运动、 细胞骨架组成、钙离子转移以及细胞程序性死亡( b r o w n l e ee ta 1 ，2 0 0 1 ) ，而胞外1 一磷酸鞘氨醇是g 蛋白偶联受体内皮分化基因( e n d o t h e l i a ld i f f e r e n t i a t i o ng e n e ， e d g ) 家族的配体，目前已鉴定的受体有e d g 一1 、e d g 一3 、e d g 一5 、e d g 一6 、e d g 8 以及g p r 3 、g p r 6 、g p r l 2 ( t o m a ne ta 1 ，2 0 0 2 ；u h l e n b r o e ke ta l ，2 0 0 2 ) 。现已发现 s p p 可参与几条信号传导通路的传导：( 1 ) 可通过非三磷酸激醇途径释放细胞内的 黼t c a 2 + ( g h o s he t a l ，1 9 9 4 ) 。( 2 ) 通过种g 蛋白偶联机制激活m a p k 通路( w ue t a l ，1 9 9 5 ；c u v i l l i e re ta 1 ，1 9 9 6 ) 。( 3 ) 参与激活转录因子n f k b 和激活磷脂酶d 的通 路等( d e s a ie t a l ，1 9 9 2 ) 。s p p 作为胞内的第二信使，( 1 ) 可以引发细胞的多种反应； ( 2 ) 在特殊激酶的催化下快速产生，并可在特定的裂解酶作用下迅速降解：( 3 ) 在静 止细胞内的浓度很低，但在受到生长因子刺激后浓度可迅速、短暂的升高；( 4 ) 通 过非i p 3 依赖性