（有机化学专业论文）多氨基小檗碱衍生物作为新型高效dna结合剂的研究.pdf

摘要 多氨基小檗碱衍生物作为新型高效d n a 结合剂的 研究 有机化学 黎姗 指导老师：庞冀燕副教授 摘要 本文以小檗碱为原料，通过高温选择性脱甲基得小檗红碱( 2 ) ，2 与l ，2 二 溴乙烷反应得9 氧- 2 溴乙基小檗碱( 3 ) ，3 进一步氨解得9 氧2 胺乙基小檗碱 ( 4 ) ，然后以4 为原料分别与b o c l l y s ( b o c ) - o s u 、b o c l y s - l 一( b o c ) 一l y s ( b o c ) - o h 及 b o c l - l y s ( b o c ) 2 - l y s o h 缩合得到c - 9 位叔丁氧羰基( b o c ) 保护的赖氨酸修 饰的小檗碱( 5 ) 、c 9 位b o c 保护的赖氨酸二肽修饰小檗碱( 7 ) 及c 9 位b o c 保护的赖氨酸三肽修饰小檗碱( 9 ) ，最后在三氟乙酸的作用下脱去保护基团得目 标产物l s 一1 、l s - 2 、l s - 3 。并用e s i m s 、1 h n m r 确认其结构。 运用紫外可见吸收光谱法和e b 荧光置换光谱法研究了b e r b e r i n e 、化合物4 、 l s 1 、l s - 2 及l s - 3 与c td n a 的结合情况并利用非线性拟合方法计算了它们与 c td n a 的结合常数l e a ，结果发现这些化合物与c td n a 的结合常数的大d , j 顿 序为：k a ( l s - 3 ) k a ( l s - 2 ) k a ( l s - 1 ) k a ( 4 ) ，这说明氨基的数目会影响化 合物与c td n a 的结合强度，氮正离子的增加会使结合作用增强。同时在紫外 可见吸收光谱实验中还观察到减色红移现象，这表明这些多氨基小檗碱衍生物可 能是以嵌插的方式与c t d n a 发生相互作用的。 关键词：小檗碱，多氨基，c td n a , 紫外可见吸收光谱，e b 荧光置换光谱 p o l y a m i n o m o d i f i e db e r b e r i n ed e r i v a t i v e sa sn e w a n d s t r o n gd n a b i n d e r o r g a n i cc h e m i s t r y l is h a n s u p e r v i s o r ：a s s o p r o f j i y a np a n g a b s t r a c t s e v e r a lp o l y a m i n o m o d i f i e db e r b e r i n e sw e r es y n t h e s i z e di nm o d e r a t et og o o d y i e l d s a n dt h e i rs t r u c t u r e sw e r ef u l l yc h a r a c t e r i z e db ym sa n d1 hn m s p e c t r o m e t r i c t i t r a t i o n e x p e r i m e n t s a n de b d i s p l a c e m e n ts p e c t r o p h o t o m e t d c e x p e r i m e n t sw e r ep e r f o r m e df o rs t u d y i n gt h ea c t i v i t i e so ft h e s eb e r h e r i n ed e r i v a t i v e s b i n d i n gw i t hc td n a s e l e c t i v e l yd e m e t h y l a t i o no fb e r b e r i n ea t1 9 0 cu n d e rv a c u u mg a v eb e r b e r r u b i n e ( 2 ) a l k y l a t i o n so f 2 w i t h1 , 2 一d i b r o m o e t h a n ea f f o r d e d9 - o 一2 - b r o m o e t h y l b e r b e r i n e ( 3 ) 9 - o - 2 一a m i n o e t h y l b e r b e r i n e ( 4 ) w e r ep r e p a r e dt h r o u g ht h er e a c t i o no f a m m o n o l y s i so f 3 a tl a s t l s - 1 、l s - 2a n dl s - 3w e r es y n t h e s i z e db yc o n d e n s a t i o no f4w i t h b o e l - l y s ( b o o - o s u 、b o c 山l y s ( b o c ) - l y s ( b o c ) - o ha n d 【b o c - l l y s ( b o c ) 2 - l y s - o h r e s p e c t i v e l y , f o l l o w e db yd e p r o t e c t i n gw i t ht f a t h ei n t e r a c t i o a sb e t w e e nt h e s eb e r b e r i n ed e r i v a t i v e sa n dc td n aw e r e i n v e s t i g a t e db ya b s o r p t i o ns p e c t r o m e t r y a n de bd i s p l a c e m e n tf l u o r e s c e n c e s p e c t r o m e t r y t h ea s s o c i a t i o nc o n s t a n t s ( 枷w e r ec a l c u l a t e dw i t hn o n l i n e a rc u r v e f a t i n g m e t h o d s t h eo r d e ro ft h e s eh e r h e r i n ed e r i v a t i v e s a s s o c i a t i o nc o n s t a n t s t o w a r dc td n ai sk a ( l s - 3 ) k a ( l s - 2 ) k a ( l s - 1 ) k a ( 4 ) mr e s u i t s i n d i c a t e dt h a tt h ei n c r e a s e dn u m b e r so fp r o t o n a t e da m i n o g r o u po fh e r b e r i n e d e r i v a t i v e sc a l le n h a n c et h e i rb i n d i n ga t y m i t i e sw i t hc td n a b e s i d e s ，t h eo b s e r v e d r e ds h i f t sa n dh y p o c h r o m i c i t i e so ft h e s ec o m p o u n d sb i n d i n gw i t hc td n ai n a b s o r p t i o ns p e c t r o m e t r yp r o v i d e dp r i m af a c i e se v i d e n c ef o ri n t e r c a l a t i v eb i n d i n g k e y w o r d s ：b e r b e r i n e 、p o l y a m i n o - m o d i f i e d 、c td n a 、a b s o r p t i o ns p e c t r o m e t r y 、 e bd i s p l a c e m e n tf l u o r e s c e n c es p e c t r o m e t r y 第1 章前言 第1 章口 1 1 小分子化合物与d n a 作用的研究进展 脱氧核糖核酸( d n a ) 是一类很重要的生命物质，是生物体遗传信息的载 体。在生命体中，基因是生物遗传的功能单位。自从1 9 5 3 年w a t s o n 弄1 c r i e k l l 】提出 d n a 的双螺旋结构模型以来，有关生物基本遗传物质d n a 的研究也就成为分子 生物学、生物化学及医药学的一个重要课题。研究发现很多常见病主要都是各种 因素，如环境因素诱导了基因的表达的异常。研究d n a 与其他能识别特定碱基 序列的小分子( 如各类金属离子、金属螯合物、小分子物质，尤其是药物分子等) 相互作用，有助于人们了解某些分子对d n a 体内复制和转录的影响，以及由此 引起的物种性变异、各种化合物与d n a 问亲和力的大小和化学核酸酶的作用机 制等信息，从分子水平上了解导致基因结构变异的原因，进一步寻找出毒副作用 小，疗效好的药物 2 1 。临床上使用的许多抗癌药物都是以d n a 为作用的主要靶点， 通过与癌细胞d n a 发生相互作用破坏其结构，进而影响基因调控与表达的功能， 表现出抗癌活性。 1 1 1d n a 的结构特点 核酸是由很多核苷酸单体组成的线性大分子化合物，其基本组成单元是核 营酸。脱氧核苷酸之间由3 ，5 磷酸二酯键连接形成单键，称作d n a 的一级结 构【3 l 。两条单链之自j 的碱基由氢键连接，形成两种特定的碱基配对：a - t 和g c 。 相邻碱基对间的间隔处于v a l ld e r - w a a l s 距离内，因此碱基之间存在堆积作用。 氢键和堆积作用使两条脱氧核苷酸单链组成一条双螺旋，这就是d n a 的二级 结构 4 1 。碱基对与糖环的连接在碱基对的同侧，这种不对称的连接使双螺旋表 面形成两个凹下去的沟，宽的称为大沟，窄的称为小沟。d n a 是一种柔韧的生 物大分子，这使得d n a 可以采用不同的构象，如a 、b 、c 、d 、z s 6 1 等形式。 中山大学硕士学位论文 d n a 采用哪种构象，主要取决于环境条件，如盐的种类，相对湿度等。在一些 条件下，双链d n a 可形成松弛型、浓缩型、超浓缩型和花束型等多种拓扑各 异的高级结构。除此之外，人们还发现了与传统双螺旋截然不同的三链、四链 d n a 以及一些非线性结构的核酸分子，如三臂、五臂、六臂d n a 等m 。 f i g 1 - 1d n a 的般螺旋结构 1 1 21 ) n a 与小分子化合物作用的模式 小分子与d n a 的结合区位于碱基、磷酸骨架及戊糖环部分。d n a 由平行 堆积的碱基、聚合的阴离子磷酸骨架以及两条脱氧核苷酸形成的大沟、小沟组 成分子的识别位点。d n a 结构的复杂性决定了小分子化合物与其作用的多样性 和复杂性，它们的作用方式主要有三种：非共价结合、共价结合和剪切作用【8 】。 1 1 2 1 非共价结合 非共价结合包括静电结合、嵌插结合和沟内结合。另外还有氢键、离子键、 范德华力、疏水键等一些弱作用键。这些键是一种决定性的因素，形成了核酸 生物功能所需的空间结构。 幻静电结合 核酸是一个高度带电的聚合电解质，它的阴离子磷酸恨部分强烈地影响 d n a 的构象及其反应。一些分子通过非特异性的相互作用，作用于磷酸骨架【9 1 ， 2 第1 章前言 这种结合没有选择性。通常认为这种作用模式在作为药物的应用价值不大，但 并不完全如此，例如，t m p y p 金属卟啉带正电荷的侧链与d n a 磷酸骨架的静 电结合对它能嵌入结合在g c 碱基对之间起了必不可少的稳定作用。 嵌插结合 嵌插作用在碱基对间嵌入平面的或几乎平面的芳香环系统，嵌插结合的作 用力来自芳环的离域体系之间的相互作用及疏水相互作用。这是药物分子与 d n a 发生作用的最重要的形式之- - 1 1 0 1 。基于小分子的结构不同，嵌插作用又可 以分为单嵌插和双嵌插作用。经典的嵌入剂主要是平面的带正电的芳香族小分 子，由于其分子体积小，具有一定的平面性，可以嵌入到d n a 的双螺旋碱基 对之自j 。非经典的嵌入剂主要有两类：一类是双嵌入剂，它是两个嵌插环被不 同长度所的链共价连接起来，相对于一元嵌插剂来说，作为药物的生物活性往 往d n a 的强结合而加强。另外一类是带有多个大取代基。通常稠合芳环体系 都倾向于结合在o c 富集区f 1 i j 。当小分子嵌入d n a 碱基对之间后，有的可以 直接抑制d n a 的复制和转录功能；有的则在经过进一步活化后，使d n a 断裂 受损而影响其功能。研究表明，小分子d n a 相互作用形式还有“半嵌插结合” f 1 2 】。 c 1 沟槽结合 即靶向分子与d n a 的大沟或小沟的碱基对边缘直接发生相互作用。大分 子蛋白质结合于d n a 的大沟槽中，而多数小分子则是在小沟槽区作用。小沟 槽区是a t 富集区【”】，小分子通过与胸腺嘧啶碱基c - 2 上的羰基氧或腺嘌呤碱 基n 3 上的氮形成氢键与a t 碱基结合。纺锤菌素和h o e c h s t3 3 2 5 8 是两种经典 的小沟结合分子，它们与d n a 切割剂( 如阳离子卟啉) 连接后，能够得到亲 和性及对a t 序列选择性都明显增强的人工核酸酶【1 4 ，1 5 1 。近年发展起来的反义 寡聚核苷酸可精确识别核酸所携带信息的特意性序列。因此一方面可通过将一 些具有特定功能的活性基团接在寡聚核苷酸末端，得到高度选择性的人工核酸 酶或药物分子原型；另一方面如果己知靶分子的核苷酸序列，有可能根据反义 寡聚核苷酸的碱基序列直接写出抑制物的化学结构，这对药物分子的合成是非 常有利的。 这三种非共价作用模式并不是互相排斥的，往往许多试剂可以通过多种模 3 中山大学硕士学位论文 式与d n a 结合，有时是一种作用模式结合诱导另一种模式的结合。如 c o ( p h e n ) 3 0 2 既可以通过静电作用与d n a 结合，又可以采取嵌入模式结合到 d n a 双螺旋结构中。在沟结合方面，人们也提出了序列选择性识别、位点专一 性识别、形状选择性识别等识别机理。 1 1 2 2 共价结合 f i g 1 - 2d n a 与小分子非共价结合的二种模式 与非共价结合作用相比，d n a 靶向分子与d n a 共价结合的序列特异识别 功能要强的多。它们之间发生的反应主要是亲核反应，亲电反应，加成反应等。 早期的绝大多数抗癌药物具有使d n a 烷基化的功能，它们对细胞的作用基本 上没有选择性，所以临床使用有严重的毒副作用。 1 1 2 3 剪切作用 d n a 断裂在d n a 修复、转录及突变中是很重要的生物学过程。具有剪切 作用的分子断裂d n a 的位点是由其与d n a 结合的选择性决定的。目前天然的 抗生素类d n a 断裂剂有针棘霉素，博莱霉素等。合成的d n a 断裂剂有以邻菲 咯啉为配体的弱酸性余属配合物，它们有对d n a 结构特异性断裂的功能。 4 第1 章前言 1 1 3d n a 与小分子化合物的研究方法及其特点 人们采用各种现代实验手段如光谱、电泳及电化学方法等从不同的角度对 小分子与d n a 之问的作用进行了广泛的研究。 1 1 3 1 光谱法 a ) 紫外可见吸收光谱法 由于核酸分子本身有光吸收活性，许多小分子与核酸结合后，对核酸或小分 子的吸收光谱都会引起变化。利用紫外可见吸收光谱法是研究小分子与核酸相互 作用机理的最常用、方便的方法。小分子与核酸相互作用后，会引起吸收谱带变 宽、红移( 或蓝移) 效应和减色( 或增色) 效应。尤其是以嵌插方式结合的分子，变 化会更大，粘度增大，熔点升高。可通过光谱测量，得到表观稳定常数、结合位 点数。在光照作用下，有些分子会切断核酸的键，实验可用紫外光谱法进行监测。 热和碱的作用可破坏d n a 双链螺旋结构，使双链变成单链，吸光度a 2 6 0 增 大。小分子与d n a 结合后会给这种变性带来影响，进而可考察小分子与d n a 的 作用方式。嵌插作用对d n a 的双螺旋结构起稳定作用，可导致熔链温度t m 值增 大5 8 c 。而非嵌插作用的小分子不会使砌值增大如此明显【16 1 。g a n e s h 等【1 7 1 于艮道 了阳离子表面活性剂与寡聚核苷酸作用后a 2 6 0 随温度的变化曲线为双s i g i i l a 曲 线，由此推断阳离子表面活性剂首先通过静电作用与寡聚核苷酸结合，然后在疏 水力的驱动下以协作方式结合于相同的寡聚核苷酸上，从而使溶液中同时存在两 种寡聚核苷酸，即自由和与表面活性剂结合的寡聚核苷酸，最终导致出现两个熔 链温度。跟踪小分子与d n a 作用前后a 2 6 0 随p h 值的变化情况，也可判断小分子 与d n a 之间的作用方式。文献【1 s l 研究t g e2 1 3 2 与d n a 的相互作用，在g e2 1 3 2 不存在的情况下，d n a 喊变性的p h 为1 2 2 7 ，变性后增2 6 ；而在g e2 1 3 2 存在 下，d n a 碱变性的p h 增大为1 2 9 0 ，变性后增色1 4 ，因此初步断：g e2 1 3 2 以 嵌插方式与d n a 发生了作用。 m 荧光光谱法 d n a 的吸收波长在2 6 0a m ，而其荧光很弱，直接利用荧光光谱法研究小分 5 中山大学硕士学位论文 子与d n a 的相互作用受到一定的限制。因此，在用荧光光谱法研究药物与d n a 相互作用时，一般要利用与之相互作用的小分子的自身荧光，或者利用荧光探针 试剂与d n a 作用后产生的荧光。 若药物本身有荧光，当与d n a 发生某种形式的作用后，其荧光光谱发生了 变化。阿霉素、柔红霉素、喜树碱等就是具有这种性质的药物，其作用模型可由 s c a t c h a r d 方程描述。根据实验数据作图，按所得的斜率和截距可计算出药物d n a 的稳定常数k 及每个核苷酸可结合的药物的分子数。药物与d n a 的作用方式可通 过离子强度对结合常数罔拘影响情况来判断。若n a + 浓度的增加对药物与d n a 的 作用影响较大，髟扣n 均会发生变化，则药物与d n a 的作用主要表现为静电力作 用；若药物与d n a 相互作用的结合常数不受n a + 浓度影响，则药物与d n a 的作用 主要为嵌入作用。 若药物本身没有荧光，与d n a 的作用可用溴化乙锭( e b ) 、噻唑橙二聚 体、唑黄二聚体等荧光探针来研究。e b 是检测双链d n a 的灵敏探针试剂，它 本身仅有很弱的荧光，与d n a 作用时生色团嵌插入d n a 碱基对中使荧光大大 增强。溴化乙锭( e b ) 是应用最早的荧光探针，被广泛应用于抗癌药物的筛选 和小分子与d n a 作用的研烈1 1 1 。当向e b 中加入d n a 后，体系的吸光度降 低，最大吸收峰红移，这是e b 峰值的平面菲罗啉环嵌入d n a 堆积的碱基对之 间所致。当向e b d n a 体系中加入药物后，若e b 的最大吸收峰值增加，且 e b 红移后的吸收峰是向原位( 紫外) 回复，则可证明药物的存在破坏了d n a 与e b 之间的嵌入作用，e b 又游离出来；如果作用不强，影响不大，就需借助 其他方法作进一步判断。吖啶橙( a o ) 与核酸的结合方式有2 种：一种是嵌入 核酸双链的碱基对之问形成a o d n a 复合物，另一种是与单链核酸的磷酸发生 静电问相互作用，形成a o r n a 复合物。唐宏武等【2 2 1 以荧光探针a o 判断药物 能否进入细胞核及其与核d n a 的结合能力，用阿达玛变换显微荧光图像分析 仪( h t m i ) 检测单细胞核的a o d n a 复合物在发射峰5 3 0n i n 处的荧光强度。 溴化乙锭早期常用作d n a 探针，因其有很强的致癌性，目前已很少采用，而 那些无毒性或含有可被衍生的活性基团的探针分子越来越受到青睐i l 蚍。 有些小分子与核酸结合后，会发生荧光淬灭作用。利用这些现象，可用荧光 光谱法进行分析，获得热力学和动力学数据。和k 4 f e ( c n ) 6 为典型荧光猝 6 第1 章前言 灭剂，通过考察其对小分子荧光的猝灭作用可以判断小分子与d n a2 _ f o j 的作 用方式。与纯水介质相比，当小分子与d n a 属于嵌插作用时，i 或f c ( c n ) 6 4 的猝灭作用减弱嘲；而当小分子与d n a 属于沟槽作用时，猝灭作用增强 z 3 l 。 郭东方等阱1 研究了肉桂酸、邻菲罗啉及稀土离子三元配合物与e b d n a 体系的 荧光淬灭光谱，共振荧光光谱，电子光谱以及d n a 对e b 光谱的影响等性质， 探讨了它们与d n a 的作用方式。结果表明与d n a 存在静电与插入两种作用模 式。 小分子与d n a 作用后荧光偏振的变化情况是判断小分子是否与d n a 发生嵌 插作用的又一标准。通常当小分子嵌插到碱基中时，其转动受阻，荧光偏振会随 之变大。而非嵌插作用不会引起荧光偏振的增大渊。文献 2 5 1 利用荧光偏振方法研 究了小分子与d n a 之间的相互作用，小分子的荧光偏振随着d n a 浓度的增加而 增大，由此推断小分子与d n a 发生了嵌插作用。贺吉香等 2 6 1 采用紫外光谱、荧 光光谱、荧光偏振等手段，对小檗碱( b r ) 与小牛胸腺脱氧核糖核酸( c td n a ) 的作用方式进行了研究，证实了盐酸小檗碱通过嵌插方式与c td n a 相互作用 的。朱展才等 2 7 】探讨了应用铌桑色素( m r ) 络合物作为荧光探针测定核酸的方 法，对络合物与d n a 的吸收光谱、荧光偏振与热变性行为进行了测量，结果指 出：n bv m 始各合物嵌入d n a 的双螺旋结构中。 c ) 线二色光谱和圆二色光谱 线二色光谱( l d ) 采用与固定光轴方向平行或垂直的平面偏振光，能快速 区分经典的嵌入结合、沟槽结合和表面结合模式，并能获得小分子结合在d n a 上的准确方向信息及动力学数据【2 规。圆二色光谱( c d ) 以高频变换的左旋或右 旋偏振光作为入射光，为有机化合物的绝对构型、构象和反应机理的研究提供 了很多信息，是研究有机化合物和生物大分子的构型、构象和三维空问结构强 有力的工具。彭小彬等1 2 9 1 通过圆二色光谱等手段研究了手性苏氨酸卟啉锌配合 物聚集体与小牛胸腺d n a 构建的新超分子，依据卟啉与d n a 作用时c d 光谱 的外型来判断卟啉与d n a 的结合模式，提出了具有不同构型的手性苏氨酸卟 啉锌配合物聚集体与d n a 构建新的超分子时不同的构建方式。 1 1 3 2 电化学法 7 中山大学硕士学位论文 电化学研究溶液中d n a 分子与其它物质分子相互作用是基于d n a 分子存 在与否时体系伏安特性的差异，包括由于嵌入反应引起的体系式电位( e o ) 的 移动和当小分子与d n a 分子结合后扩散系数( d ) 值大幅度的下降而导致扩散 电流的减小等1 3 0 , 3 ”。并由此通过非线性拟合可得到一些相互作用的热力学和动 力学参数，如结合常数，结合位点，结合自由能，相互作用模式等信息。计亮 年等1 3 2 噪用c v 比较一系列钴( h i ) 多吡啶配合物与d n a 间的相互作用。陈 洪渊等吲则采用循环伏安法、微分脉冲伏安法研究了c u ( p h e n ) 2 2 + 和c u ( b p y ) 2 2 + 与6 巯基嘌呤、腺嘌呤、鸟嘌呤、鸟苷及d n a 之间的相互作用。c h e n 3 4 蟠将 b 环糊精的包络作用引入到小分子与d n a 作用研究体系中，利用光谱电化学 方法作用研究了染料分子被b c d 包络前后与d n a 作用性质的变化，阐述了 染料与d n a 的作用机制。虽然电化学方法在一定程度上受到分子电活性的限 制，但对于一些吸收光谱比较弱，或由于其电子跃迁谱带与d n a 的发生重叠， 而无法用如紫外可见等方法来研究的分子，却有可能用直接或间接伏安法方便 地进行研究1 3 5 1 ，尤其对于一些主要通过静电结合模式与d n a 作用的分子，采 用表面电化学方法可获得许多其它方法无法得到的信息。 1 1 3 3 凝胶电泳法 f i e l 3 6 i 等认为嵌插作用可导致小分子一d n a 复合物电泳迁移率明显降低， 而仅仅静电作用不会对迁移率产生大的影响，据此可初步断定小分子是否与 d n a 发生了嵌插作用。王玉琦口7 1 等利用生化分离流程及琼脂凝胶电泳从铁芒其 叶中提取纯度比较高的稀土元素一d n a 复合物，并证明稀土元素与d n a 的结 合是紧密的。文献【3 8 】比较了耐尔蓝一d n a 、e b - - d n a 和d n a 电泳迁移率的 大小，得出耐尔蓝以嵌插方式与d n a 发生作用。文献口9 】报道了二价金属离子 对平阳霉素与d n a 作用的影响。电泳实验表明，当f e 2 + 浓度较低时，其作用主 要是促进平阳霉素对入d n a 的降解；当f e 2 + 浓度较高时，一方面起促进作用， 另一方面它本身也会降解九d n a 。随着f e 2 + 浓度增大，产生平阳霉素严重降解 d n a 的现象。 第l 章前言 1 1 3 4 质谱法 随着软电离技术的发展，质谱法( m s ) 在药物分子一q a 加和物的结构 分析中发挥独特的作用1 4 0 , 4 1 1 ，m s 和m s m s 能灵敏、快速地获得药物分子与 d n a 结合位点数，结合区域以及非共价结合方式，l c m s 也在d n a 及其加和 物的分析中得到广泛的应用 4 2 1 。w a n g 等h 3 1 快速检测非共价结合药物与寡聚核 苷酸及它们的相对亲和力，发现药物h o e c h s t3 3 2 5 8 、h o e e h s t3 3 3 4 2 、d i s t a m y e i n 、 b e r e n i l 、a e t i n o m y e i nd 1 、d 2 、d 3 、d 4 、d 5 是典型的小沟结合剂或嵌插剂，小 沟结合部位在a t 富集区，a e t i n o m y e i nd 嵌插在g c 富集区，而h 2 t m p y p - 4 和 c u t m p y p 则是混合键和，小沟和嵌插都存在。 1 1 3 5 其它方法 x 一射线晶体衍射法x 一射线晶体衍射是研究物质结构最直接的工具之 一，广泛应用于研究其它一些类型配合物与d n a 的相互作用，并获得结构方 面的详细信息j 。x 一射线晶体衍射能够提供直接结构信息，但需要提供药物 分子与d n a 加合物的晶体。这种技术在研究配合物与d n a 的相互作用领域中， 建立了一些令人信服的结合模型。 微量热法该法在测定过程中不会干扰生物体系的正常活动与代谢，对反 应体系的光谱性质、电学性质及溶剂性质等无任何限制条件，因此有许多独到 之处【4 5 j 。微量热法已先后用于一些抗肿瘤药物、生物染料以及金属配合物与 d n a 相互作用的研究，包括热力学性质、结合位点及键合模式的研究l 徭4 9 】。 粘度法l e r m a n l 5 0 l 认为粘度增大、沉降系数减小是小分子与d n a 发生嵌 插作用的主要标志之一。f i e l l 5 1 1 等研究了卟啉t m a p 、t 2 m p y p 、t a m p y p 及d n a 之间的相互作用。粘度数据表明，t 3 m p y p 和t 4 m p y p 以嵌插方式与d n a 发生 了作用，而t 2 m p y p 和t m p a 和d n a 以非嵌插方式作用。 此外还有核磁共振平衡渗析、原子显微镜、扫描隧道电镜、亲和色谱法等 等。总之，在研究小分子与核酸相互作用时，要采用各种方法进行全方位，多 层次的研究，获得作用的结合方式、结合位点、反应的热力学、动力学数据以 及结合的碱基、结合的角度与核酸作用的序列特异性对核酸的影响，进一步获 9 中山大学硕士学位论文 得核酸的二级三级乃至拓扑结构，为我们更好地设计有效的药物提供理论依据。 1 2 小檗碱衍生物与d n a 作用的研究进展 1 2 1 小檗碱及其衍生物的生物活性 原小檗碱类( p r o t o b e r b e r i n e ) 化合物是生物碱中的一个重要组成部分，属 异喹啉类生物碱，广泛存在于黄连的根茎、黄柏的树皮等多种植物的各种组织 中，主要以叔胺碱和季铵碱两种形式存在。原小檗碱类化合物具有共同的母体 结构，由公用一个氮原子的两个异喹啉环稠合而成。其中最有代表性的药物为 小檗碱( b e r b e r i n e ) ，又名黄连素，它的应用历史可追溯到3 0 0 0 年前。目前已 经分离或合成的这类生物碱有几百种，许多原小檗碱化合物具有广谱的生理、 药理活性，如抗菌、抗原虫、抗疟、镇痛活性，免疫作用，降糖作用，降胆固 醇作用，对神经递质、心脏和循环系统也有作用。另外，目前原小檗碱类化合 物的抗肿瘤作用更是引起了人们的兴趣。 为了更好地研究原小檗碱类化合物的构效关系，研究者们将天然原小檗碱 类化合物进行各种各样的结构改造得到了许多宝贵的构效方面的信息。 0 c h a p a l m a t i n e f i g 1 3 原小檗碱的主要化合物结构幽 1 0 第l 章前言 1 2 1 1 抗菌作用 原小檗碱类生物碱是一种广谱抗菌药物，对多种g + 菌、g 菌以及真菌、霉 菌、病毒、原虫、线虫具有抑制杀灭作用1 5 2 。其中小檗碱对痢疾杆菌和金黄色 葡萄球菌的抑菌作用最强，对大肠杆菌、伤寒杆菌等较弱，临床上已应用多年， 主要适应症是肠道感染，另外还作用于消化性溃疡及胃炎，霉菌感染，慢性胆 囊炎等疾病。袁建等【5 3 1 研究表明，小檗碱能够延缓人体的肠道排空时间，抑制 细菌在黏膜和上皮细胞表面的黏附。它还能够明显抑制寄生虫的产生和迅速改 善感染动物的血象。细胞试验结果表明，小檗碱可抑制无鞭毛寄生虫的繁殖、 呼吸和大分子的生物合成，干扰原鞭毛虫的核d n a 和抑制器官的成熟。虽然 对原小檗碱的抗菌活性及其构效关系研究较多，但其抗菌作用机制仍未完全阐 明。 1 2 1 2 降糖作用 小檗碱有较好的降糖作用，在临床上广泛应用于降血糖治疗糖尿病【5 4 】，一 般用于糖耐量异常及轻中度2 型糖尿病人。其降糖机制认为是小檗碱具有抗升 糖激素作用并促进胰岛1 3 细胞再生及功能恢复，并抑制糖原异生及促进醣酵解， 故对糖尿病疗效好，对其并发症也有一定的防治作用。 1 2 1 3 抗疟活性 v e n n e r s t r o m 等p 6 】于1 9 8 8 年首次报道了l o 个原小檗碱化合物分别在体外对 恶性疟原虫和体内伯格氏鼠疟原虫进行了抗疟活性研究。结果发现其中有些化 合物的体外抗疟活性和奎宁相当，然而在体内没有活性。这些化合物从结构上 看分别是8 位取代的二氢原小檗碱或原小檗碱盐，初步提出了抗疟的活性结构 是二氢小檗碱和原小檗碱盐。1 w a s a 纠5 7 l 发现芳环结构的季铵碱活性比无芳环 结构的活性高，这说明c 环的芳环结构是提高抗疟活性的有效结构。1 9 9 9 年 1 w a s a 等【5 8 l 进一步探讨了原小檗碱盐含氧取代基的种类和取代位置对抗疟活性 中山大学硕士学位论文 的影响。 1 2 2 小檗碱衍生物与d n a 作用的研究进展 小檗碱具有抗肿瘤活性，研究发现它对肝癌、肺癌、结肠癌、食管癌、脑 部肿瘤等多种肿瘤细胞的生长、繁殖有明显的抑制作用。d u b o i s t 5 9 l 和s h e n g 6 0 1 发现小檗碱可以抑制c o x - 2 ，从而阻断结肠癌的形成。f u k u d a 等【6 1 1 也做了类似 的研究，结果显示小檗碱可以与结肠癌细胞内的大分子蛋白结合，抑制c o x 2 基因的启动子，使c o x - 2 基因的转录受阻，减少肿瘤细胞的分裂，减少了结肠 癌的发病几率。作为新型抗肿瘤药物的作用靶点之一，d n a 的拓扑异构酶引起 了人们的兴趣和关注。p i l c h 等【6 2 1 报道了小檗碱有不同程度的抑制拓扑异构酶 ( t o p o ) i 和i i 的活性，可能是因为形成了永久性易断裂的药物酶d n a 复 合物，从而阻止了1 o p o 的d n a 断裂再连接反应，导致了d n a 的断裂，进而 影响蛋白质的形成使肿瘤细胞死亡或诱导基因的变化引起细胞凋亡。 研究小檗碱及其衍生物与d n a 的相互作用，不仅对阐明小檗碱的抗肿瘤 作用机理有重要的意义，而且还能指导人们设计出活性更好专一性更强的新型 药物。因此，国内外的研究者对对这方面进行了广泛的研究。 k r e y 等 6 3 1 在1 9 6 9 年发现小檗碱可以与d n a 发生作用。1 9 7 7 年d a v i d s o n 等【“谴过光谱法和粘度法对小檗碱与超螺旋d n a 的作用进行了研究推断出小 檗碱可能是采用部分嵌插的方式与d n a 作用。 l i 等【6 5 l 用光谱法研究小檗碱与d n a 的相互作用，结果发现小檗碱与d n a 作用后在光谱上只有轻微的减色和红移，认为它们之间是采用小沟结合的方式 作用的。p i l c h 等【删提出小檗碱与d n a 的作用是由小檗碱的c 、d 环形成的平 面结构插入到d n a 的碱基对之间，a 、b 环则伸向d n a 的小沟槽。该研究组 还报道了小檗碱与d n a 作用的构效关系，d 环上的取代基位置的不同会导致 化合物与d n a 结合能力的差异，而a 环上取代基的位置则几乎不会影响化合 物与d n a 的亲和力。 赵长春等1 ”j 用荧光光谱法研究了小檗碱与d n a 的键合作用，发现小檗碱 与d n a 结合后，原本它较弱的荧光带( xe m = 5 2 0n m ) 的强度大大提高了， 第l 章前言 在p h = 3 0 0 和p n = 7 2 2 0 时，测得小檗碱与d n a 的本征键合常数分别为3 0 0 1 0 5 和2 0 4 1 0 5 。m a z z i n i 等f 6 7 1 利用1 h n m r 、3 1 p n m r 和紫外可见吸收光谱， 研究了小檗碱与d ( c g t a c g ) z 、d ( a a g a a t t c t t h 、d ( g c g 蜃t c g c h 等一系列 短链d n a 阃的作用，发现小檗碱与d n a 的结合部位主要在a a t t 所形成的小 沟槽中，并通过分子学计算、分子动力学和n o e 效应的数据，模拟出了小檗碱 与d ( a a g a a t t c t t ) 2 的结合情况。 c h e n 等【6 s 1 用毛细管电泳的方法研究了小檗碱与两条有四个碱基对不同的 短链d n a ( d s d n a ) 的相互作用，结果表明小檗碱与d s d n a 间的相互作用比较 小，对含有a a t t 序列的d s d n a 有微弱的选择性。另外有文献报道小檗碱对三 螺旋的d n a i 叫和四螺旋的d n a l 7 0 1 的选择性比双螺旋的强，小檗碱的芳环在这 种选择性结合中起着关键的作用。w u 等【7 用毛细管区带电泳研究了中药提取 液中原小檗碱类化合物与d n a 问的作用，提出小檗碱、药根碱和巴马汀采用 相同的方式与d n a 结合，而且这三种物质与d n a 存在两种作用方式。 y a d a v 7 2 1 等人用紫外可见吸收光谱法、荧光发射光谱法、粘度法、圆二色普 及动力学方法，研究了小檗碱与单聚腺嘌呤核苷酸【s s p o l y ( r a ) 】和双聚腺嘌呤 核苷酸【d s p o l y ( r a ) 】的相互作用。小檗碱与单聚腺嘌呤核苷酸作用后紫外吸收 光谱出现明显的减色红移现象，结合能力较强，而与双聚腺嘌呤核苷酸无明显 的作用。他们还比较了小檗碱与【s s p o l y ( r a ) 】、【s s p o l y ( r c ) 】、【s s p o l y ( r u ) 】、 【d s p o l y ( r a ) 】及b 型c t d n a 等的荧光发射光谱，发现小檗碱与【s s p o l y ( r a ) 】作 用后荧光强度最大，而与【s s p o l y ( r a ) ，【s s p o l y ( r c ) 、【s s p o l y ( r u ) 、 d s p o l y ( r a ) 】 及b 型c td n a 等作用后荧光强度基本上没有变化。说明了小檗碱与 s s p o l y ( r a ) 】结合能力较强，而与其它几种聚核苷酸没有明显的作用。m a r c o 等 1 研究了天然小檗碱与富含g 的四链d n a 的相互作用及小檗碱抑制端粒酶的 能力，并用合成的哌啶小檗碱衍生物及c o r a l y n e 与之比较，结果显示：与双链 d n a 相比，这些分予对富含g 的四链d n a 有更好的选择性，分子中的芳香环 在与四链d n a 的结合中起着重要的作用。 本课题组在研究小檗碱与d n a 的相互作用中取得了较大的成果。c h e n 等 【7 4 1 用e s i m s 、荧光光谱法研究了五种原小檗碱与短序列 d n a - d ( a a g a a t t c t t ) 2 、d ( a a g g a t c c t t ) 2 和d ( a a g c a t g c t t ) 2 的结合情 1 3 中山大学硕士学位论文 况，结果发现原小檗碱对富含a t 或g c 的d n a 几乎没有选择性。p a n g 掣7 5 1 合成出了一系列c 9 位修饰的小檗碱衍生物，然后用光谱法及e b 置换实验探 索这些小檗碱衍生物与c td n a 的结合情况，实验结果表明这些化合物都与c t d n a 有较强的相互作用，尤其是含有伯氨基团的衍生物，它们可能是以嵌插模 式结合的。q m 掣7 6 】合成了含有2 7 个碳链长度的桥连小檗碱二聚体，并用荧 光滴定、e b 置换实验研究了此几种化合物与c td n a 及三种双螺旋寡聚核苷 酸- - d ( a a g a a t t c m 2 、d ( a a g c a t g c t t ) 2 、d ( t a a g t t c t t a ) 2 的相互作用。 结果发现这些二聚体与d n a 的结合能力比单小檗碱增加了近1 0 0 倍，其中含 有3 个碳链长度的小檗碱二聚体与d n a 结合最强。另外研究还发现，氢化小 檗碱与d n a 无明显的相互作用，这说明小檗碱的平面结构和季铵阳离子在与 d n a 的结合中起着不可或缺的作用。l o n g 等旧合成了6 个药根碱同聚体和小 檗碱一药根碱杂聚体，并用光谱法研究了它们与c td n a ，d ( a a g a a t t c t t ) 2 、 d ( t a a g a a t t c t t a ) 2 、d ( t t a a g a a t t c 兀a a ) 2 ，结果显示由于两个原小檗碱 母体的共同作用，这些二聚体与d n a 的结合系数要l t d , 檗碱大得多。p a n g 等 | t s l 合成出了在药根碱的c 3 位和c 9 位引入2 、4 、6 个氨基的三种衍生物，并 通过e b 置换实验和荧光滴定实验研究了这三种衍生物与小牛胸腺d n a ( c t d n a ) 的相互作用，结果发现：与巴马汀( p a l m a t i n e ) 相比，这些多氨基原小 檗碱衍生物与c t d n a 的结合能力增强了1 0 3 倍。q h ay o n g 等【7 9 】由b e r b e r i n e 、 j a t r o r r h i z i n e 、p a l m a t i n e 通过部分去甲基化反应得到b e r e r r u b i n e 、i a t r o r u b i n e 和 p a l m a t r u b i n e ，并用e b 置换实验研究了它们分别与c td n a ， p o l y ( d a - d t ) p o l y ( d a - d t ) 、p o l y ( d g - d c ) p o b ( d o d c ) 及富含a t 双链d n a 的 相互作用。结果表明，部分去甲基化反应得到的这三种产物与d n a 的结合能 力比反应静大大改善了，并且它们对富含a t 的d n a 有更好的结合能力。和 b e r b e r i n e 、j a t r o r r h i z i n e 、p a l m a t i n e 相比，b e r e r r u b i n e 、j a t r o r u b i n e 、p a l m a t r u b i n e 与d n a 结合有了一定程度的序列选择性。紫外光谱滴定实验进一步确定了这 些生物碱与d n a 很有可能是以嵌插模式结合的。 1 2 3 小檗碱与r n a 相互作用的研究进展 具有多种形态的r n a 可以作为某些特定抗滤过性病原体试剂的潜在靶点。 第1 章前言 r a n g a n a 掣8 0 1 用光谱法研究了小檗碱、溴乙啶、亚甲基蓝，放射菌素d 与r n a 的相互作用，其中小檗碱是以部分嵌插的方式与a 型r n a 结合的，两者间的 结合非常弱，溴乙啶以嵌插方式与a 型r n a 结合，而不与质子型的r n a 作用i 亚甲基蓝则和溴乙啶刚好相反，放射菌素d 既不与a 型r n a 结合也不与质子 型r n a 结合。由此