（微生物与生化药学专业论文）固定化细胞生物合成胞苷三磷酸.pdf

摘要 固定化细胞生物合成胞苷三磷酸 摘要 本论文通过以胞苷一磷酸( c m p ) 为底物，啤酒酵母细胞、酵母游 离酶系作为酶原催化合成胞苷三磷酸( c t p ) 工艺条件进行了研究，并 在此基础上进一步开展了固定化酵母细胞生物合成c t p 的研究，考察 了载体种类、c m p 浓度、初始葡萄糖浓度、磷酸盐浓度、p h 、温度、反 应时间等因素的影响，初步摸索出一条比较优化的固定化生产工艺。 分别对利用啤酒酵母细胞、酵母游离酶系合成c t p 的主要影响因 素进行正交实验，得到的最佳工艺条件基本上是一致的。包括c m p 浓 度6 0 0m m o l l ，初始葡萄糖浓度1 5 0 0m m o l l ，磷酸盐浓度2 5 0 0 m m o l g ，氯化镁8 0m m o l l ，a t p 浓度3 0m m o l l ，温度3 5 。不同 之处在于p h 值及反应时间，酵母细胞作为酶原的最佳p h 为6 0 ，反 应时间为2 0h ：酵母游离酶系作为酶原则p h 为8 0 ，反应时间为2 5h 。 前者的转化率为8 0 以上，后者则达9 0 以上。- ， 通过对固定化载体的选择及几种固定化方式的性能比较，认为k 一 卡拉胶是比较好的载体，并通过正交优化得到最佳固定化配比，即卡 拉胶浓度2 7 、细胞量2 5 、钾离子加入量0 - 3 、冷凝剂( k c l ) 浓度2 0 、冷凝时间4 0h 。 通过对固定化啤酒酵母及固定化新鲜酵母细胞通透性的研究，结 果表明：在冷冻三天以上，反复冻融三次及添加适量的表面活性剂情 况下，表观活力得到了大幅度的提高。 对固定化酵母细胞分批转化c t p 的影响因素进行正交优化实验， 采用h p l c 法分析反应过程中各工艺参数对转化率的影响。在最优化 条件下，转化率达4 5 7 。 在批次反应的基础上建立柱式连续反应系统，当稀释率为1 8 9 1 0 4 l s 时具有最佳转化率，与分批转化相比较有所提高，最高达5 7 6 固定化酵母可连续反应4 5 批次。 关键词：胞苷三磷酸，啤酒酵母，固定化 英文摘要 b i o s y n t h e s i so fc y t i d i n e t r i p h o s p h a t e ( c t p ) b yi m m o b i l i z e dy e a s tc e l l s a b s t r a c t c y t i d i n e m o n o p h o s p h a t e ( c m p ) i sc o n v e n e dt o c y t i d i n e t r i p h o s p h a t e ( c t p ) b yd i s s o c i a t i v e b e e r y e a s t s a n dc o m p o u n de n z y m e s f r o m y e a s t st h a th a sb e e ns t u d i e di nt h i sp a p e r a n db a s e do nt h e s es t u d i e s ， b i o s y t h e s i so fc t pb yi m m o b l i z i e dy e a s tc e l l sw o u l db ec a r r i e d o u t ， m e a n w h i l e ，e f f e c t so ns e v e r a lk i n d so fc a r r i e r s ，a n dt h ec o n c e n t r a t i o no f c m p ，i n i t i a lg l u c o s e ，p h o s p h a t eb u f f e ra n d p h ，t e m p e r a t u r e ，r e a c t i o nt i m e a r ea l s os t u d i e d t h e nh o p et of e e la b o u ta o p t i m a lp r o d u c t i o np r o c e s so f c t p i w ec a nf i n dt h a tt h er e s u l t sa b o u tt h eb e s t t e c h n o l o g i c a lp a r a m e t e r so n t h e s y n t h e s i so fc t pa r ec o m p a r a t i v e l ya c c o r d a n tt od i s s o c i a t i v eb e e r y e a s t sa n dc o m p o u n de n z y m e sf r o my e a s t sb yo a h o g o n a l o p t i m a lm e t h o d ， i n c l u d e d6 0 0m m o l lc m p , 1 5 0 0m m o l li n i t i a l g l u c o s e ，2 5 0 0m m o l l p h o s p h a t eb u f f e r ( s o d i u m ) ，8 0m m o l lm a g n e s i u mc h l o r i d e ，3 0m m o l l a t p , t h et e m p e r a t u r ei s35 。c t h e r ea r es o m ed i f f e r e n t si np h a n dr e a c t i o n t i m e t h eo p t i m a lp h6 0a n dr e a c t i o nt i m e2 0 hi su s e di nd i s s o c i a t i v e b e e ry e a s t s ，b u t t h e ya r ep h8 0 a n dr e a c t i o nt i m e2 5 hi n c o m p o u n d 英文摘要 e n z y m e s f r o m y e a s t s ，m e a n w h i l e ，t h ec o n v e r s i o n r a t eo ft h ef o r m e ri sa b o u t 8 0 ，l e s st h a nt h el a t t e r ，a b o u t9 0 t h r o u g hac h o i c ea b o u ti m m o b i l i z i n gc a r r i e r sa n d t h ec o m p a r ea b o u t s e v e r a lk i n d so f e n t r p p i n gm a t r i x ，i ti ss h o w nt h a tk c a r r a g e e n a ni sb e t t e r t h a no t h e rc a r r i e r s b y o r t h o g o n a le x p e r i m e n t s ，t h er e s u l t ss h o wt h a tt h e c a r r i e ri n c l u d e di n2 7 k - c a r r a g e e n a n ，2 5 c o n c e n t r a t i o no fc e l l s ，a n d a d d e dt o0 3 p o t a s s i u m i o n ，p u ti n2 o p o t a s s i u mc h l o r i d ea b o u t4 0h ， h a sg o o d i n t e n s i t yo f m e c h a n i s ma n dt h ec o n v e r s i o nr a t e c e l lm e m b r a n e p e r m e a b i l i t ya b o u tt h ei m m o b l i z e dw a s t eb e e ry e a s t s a n di m m o b i l i z e dn e wb e e r y e a s t si sa l s os t u d i e d t h er e s u l t ss h o w t h a tt h e a c t i v i t yo f c e l l si s g r e a t l yi m p r o v e da f t e rf r e e z e da b o v et h r e ed a y s ，t h r e e t i m e st ob ef r e e z e da n d t h a w w e d ，a n d a d d e dt oa p p r o p i t a t es u r f a c t a n t t h ee f f e c t so fc o n v e r s i o nc a u s e d b y s o m ec o n d i t i o n s d u r i n g s y n t h e t i c a lp r o c e s sa r er e s e a r c h e db yh p l ca n do r t h o g o n a lo p t i m i z a t i o n t e s t so ft h em o s t l yf a c t o r sa r ea l s oc a r r i e do u t u n d e rt h e o p t i m a lc o n d i t i o n s ， a b o u t4 5 7 c m pw a st r a n s f o r m e dt oc t p b a s e do nb a t c h r e a c t i o n s ，t h es y s t e mo fc o n t i n u o u sc o l u m nr e a c t i o ni s f o u n d e d w h e nt h ed i l u t e d r a t ei s1 8 9x 1 0 1 s ，t h e r e i sa o p t i m a l c o v e r s i o nr a t e a n dt h eb e s ty i e l di s5 7 6 t h ei m m o b i l i z e d c e l l sc a nb e o p e r a t e df o u ro rf i v eb a t c h e s k e yw o r d s ：c y t i d i n et r i p h o s p h a t e ，b e e ry e a s t ，i m m o b i l i z e dc e l l 2 第一章绪论 1 1c t p 的理化性质 第一章绪论 胞苷三磷酸( c y t i d i n et r i p h o s p h a t e ，c t p ) ，又称胞嘧啶核苷三磷酸、胞三 磷。分子式c g h l 6 n 3 0 1 4 p 3 ，分子量为4 8 3 2 ，是由一个胞嘧啶，一个核糖和一个三 磷酸单位组成的核苷酸，其结构如图1 1 所示。 n h ， n 少c h 。奠、奠h c 、f h 2 _ j 0 岁, 7 l i 一0h0 h 图1 1c t p 分子结构式 f i g u r e l 1t h em o l e c u l a rf o r m u l ac i p 在光谱分析中，p h = 2 时，最大吸收波长为2 8 0 h m ，摩尔吸光系数为1 28 1 0 3 ； p h = 7 1 1 时，最大吸收波长为2 7 1 r i m ，摩尔吸光系数为9 1 1 0 3 。 药用c t p 一般以含3 个结晶水的二钠盐据多( c t p n a 2 ，3 h 2 0 ) ，呈白色无定 形粉末，无臭，无味，微酸，易吸潮，溶于水，不溶于乙醇、乙醚等有机溶剂。 在碱性溶液中不稳定。c t p 的水溶液很不稳定，易发生磷酸化作用而分解成二 磷酸胞苷、一磷酸胞苷，这一点直接影响注射剂的生产与临床上的应用。 1 , 2c t p 的生理功能 胞苷三磷酸是机体细胞内的一种正常成分，它在体内参与核酸和磷脂类的生物 合成，提供能量，并具有调节神经功能，缓解血管硬化，改善脂肪代谢等功能。 主要适用于冶疗植物神经紊乱，脑震荡及其后遗症，脑神经疾患，神经官能症及 o o i 卜，o 洳叫 一0 oi卜l哪 m 第一章绪论 脂肪肝等，是一种重要的心脑血管类生物药物。同时，c t p 也是合成寡聚糖、c d p 一 胆碱、c m p n e u a c ( c m p n 乙酰神经氨酸) 及c m p 一唾液酸等多种药物的中间体 3 - 7 1 。 1 3c t p 的开发背景 c t p 在2 0 世纪8 0 年代曾红火一时，国内的生产方法主要都是通过利用酵母 体内的自身酶系对c m p 进行转化，生产工艺比较成熟。但由于存在以下几点个原 因：1 ) c m p 原料较贵，目前价格一直徘徊在2 0 0 0 元左右，按成本价算只能达到 中试要求；2 ) 酵母不能重复利用，不能连续生产；3 ) 产品有效期太短，质量不 稳定；从而导致无法进行产业化生产。现在国内虽有几家企业已经有其注射剂产 品，但都是从国外进1 ：3 原料药，再进行；n n n - ，如广东江门生物技术开发中心生化 药厂、北京三九万东药业有限责任公司等，目前还没有一家厂能正式生产c t p 。 目前c t p 原料药市场价在1 6 0 0 0 元公斤左右，由于其药用价值显著，具有广阔的 市场情景。 1 4 本课题的主要研究内容 本课题的主要研究内容是通过研究游离酵母细胞及游离酶系合成c t p 的基础 上，再利用固定化啤酒酵母细胞内的酶系统，以葡萄糖为能源经糖酵解途径偶联 a t p 再生系统，通过c t p 合成酶系将c m p 合成c t p ，并建立连续反应体系，摸 索出最佳工艺条件及控制要点，为c t p 的产业化技术提供可借鉴的前提条件。 1 4 1 利用游离废酵母细胞转化c t p 1 4 1 1 转化初条件的建立 定量称取速冻酵母于3 4 。c 水浴中溶融，加到底物溶液( 含底物、氯化镁、磷 酸缓冲液) ，混合均匀。将该混合液于3 5 3 7 水浴中保温静置发酵，约2 小时左 第一章绪论 右，将其3 0 0 0 r p m 离心，取上清液，然后置于9 0 水浴中加热1 0 m i n ，使杂蛋白 变性，3 0 0 0 r p m 下离心，留上清液，即得初产物。 1 4 1 2 单因素水平上各反应条件的优化 分别测定底物浓度、磷酸盐浓度、p h 值、m 9 2 + 浓度、葡萄糖浓度、反应温度、 反应时间、a t p 添加量及表面活性剂对转化率的影响 1 4 1 3 正交优化工艺条件的确定 选取上述各条件中的主要影响因素，进行正交实验，定出最佳转化条件。 1 4 2 游离酵母酶系转化c t p 1 4 2 1 酶液的制备 定量称取速冻酵母于3 4 。c 水浴中溶融，加到培养基溶液中。该溶液主要成分 配比：2 5 0 0n m a o l g 磷酸缓冲液、8 0m m o l l 氯化镁溶液、1 5 0 0m m o l l 葡萄糖溶 液，p h 调至7 0 。将该混合液于3 5 3 7 水浴中保温静置发酵，约2 小时左右， 将其离心，留上清液，置于4 。c 冰箱中备用。 1 4 ，2 2 酶反应条件的确立与优化 取定量的酶液，加入适量的底物溶液( 含底物、氯化镁、磷酸缓冲液) ，混合 均匀。放置在一定温度的水浴中，保温一定时间。然后再放人9 0 。c 水浴中加热 1 0 m i n ，使杂蛋白变性，3 0 0 0 r p m 下离心，留上清液，即得初产物。 1 4 2 3 单因素水平上各反应条件的优化 分别测定底物浓度、磷酸盐浓度、p h 值、m 9 2 + 浓度、葡萄糖浓度、反应温度、 反应时间及a t p 添加量对转化率的影响。 l4 2 4 正交优化工艺条件的确定 选取上述各条件中的主要影响因素，进行正交实验，定出最佳转化条件。 1 42 5 传质路径的研究 称取于上述一致的干酵母量，加适量底物溶液( 配方按上述所给定的最佳条 件) 。于水浴恒温反应一定时间，取样，比较两者所得结果，摸索其传质路径( 底 物小分子进入酵母体内反应，还是酵母中酶系释放出来与底物反应) 。 第一章绪论 1 4 3 固定化酵母细胞转化c t p 1 4 3 1 固定化细胞的制备及反应系统的建立 1 4 32 固定化方法及交联剂的选择 选取不同的载体( 明胶、卡拉胶、海藻酸钠、聚丙烯酰胺等) 及交联剂( 戊 二醛、甲醛等) 进行细胞的固定化，比较包埋率、机械强度、持水性等参数，确 定出最佳的固定化方法。 1 4 3 3 柱式反应系统的建立 拟取一带夹套的玻璃柱反应器( 长度、直径待定) ，夹套中用一定温度的恒温 水循环，根据反应时间、柱长及柱直径算得流速，并用蠕动泵来控制流速。再取 适量上述已备好的固定化酵母，装柱，备用。 1 4 3 ，4 固定化反应条件的确立与优化 1 4 3 4 1 确立反应初条件 取上述已装好的反应柱，用蠕动泵导人适量的已配制的底物溶液，控制流速。 待流出样品后，取样分析。 1 4 ，3 4 2 单因素水平上各反应条件的优化 分别测定底物浓度、磷酸盐浓度、p h 值、m 9 2 + 浓度、葡萄糖浓度、反应温度、 反应时间、a t p 添加量及表面活性剂对转化率的影响。 1 4 3 ，4 - 3 正交优化工艺条件的确定 选取上述各条件中的主要影响因素，进行正交实验，定出最佳转化条件 1 4 4 分析方法的建立 1 4 4 1 纸电泳法测定含量 1 4 4 2h l p c 法测定含量及转化率 c m p 、c d p 、c t p 含量采用高效液相色谱法( h p l c ) 测定。日本岛津l c t 0 a s 系列( s c l 一1 0 a 控制器，l c 一1 0 a s 双泵，c t o 1 0 a 柱温箱，s p d 一1 0 a 紫外检测 仪，c r 6 a 数据处理仪等) 。 第二章c t p 的研究进展 第二章c t p 的研究进展 2 1c t p 合成方法的研究进展 据有关文献报道，c t p 合成主要有化学合成法、光合磷酸法、生物合成法三 种。早在二十世纪六十年代，许多科学家就化学法对核苷单磷酸( n m p ) 合成核 苷三磷酸( n t p ) 的途径进行了研究。八十年代末，s i m o n ，e s 等 8 - 1 1 采用游离 酶对c m p 进行转化，其效果大大好于化学法；z i n c h e n k o ，a i 等 1 2 - 1 4 1 利用 s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ( 干) 作为生物催化剂，将n m p 转化为n t p 也取得了成 功；近几年，随着基因工程技术的飞速发展，已构建出可表达不同催化激酶的工 程菌，极大的推动了c t p 生物合成的研究。最近国内也有文献报道了华东理工大 学邱蔚然等【1 5 1 采用固定化细胞方法来生产c t p 。下面就目前对有关文献报道一一 进行详细说明。 2 1 1 化学法合成 早在二十世纪六十年代初，c r a m e r ，e ；s c h a l l e r ，h ；s t a a b ，h a 及h o a r d ， d e 等m 。1 8 1 就利用多种化学法从核苷单磷酸( n m p ) 合成核苷三磷酸( n t p ) ，其 中最常用的一种工艺方法是碳二咪唑法( c a r b o n y l d i i m i d a z o l em e t h o d ) ( 见图3 ) 。 表2 1 碳二咪唑法合成核苷三磷酸( n t p ) 的产量与转化率 t a b l e 2 1s c a l ea n dy i e l d sf o rn t p u s i n gt h e t hc a r b o n y l d i i m i d a z o l em e t h o d 通过碳二咪唑法可以得到较高转化率的核苷三磷酸( 见表2 1o 该法与其他 化学方法相比较具有工艺简单、应用范围广、产量高等优点，因而研究的比较多。 第二章c t p 的研究进展 | | p o h 沪，。 l li oh0h 兰 f?口0 ：。i 。3 。p n 。 h 该工艺中各阶段所用试剂：( i ) d o w e xh + ：( ) r 3 n ( r _ h 3 ( c h 2 ) 7 或c h 3 ( c h z ) 毋，m e o h e t o h ； ( ) 碳二眯唑，d m f ；( v ) c 飓( c h 2 ) d 9 口 h 4 p 2 0 7 ，d m f ；( v ) n a c i o , ，( c h ，) 2 c o 图2 i 碳二咪唑法合成n t p 的工艺路线 f i g u r e 2 1t h es y n t h e s i s o f n t p b y t h ec a r b o n y l d i i m i d a z o l e m e t h o d 到了七十年代末，s c h e i t ，k h 及f a e r b e r ，p 等1 9 1 利用核苷取代了核苷酸，先 用p o c l 3 将核苷磷酸化为核苷单磷酸，再用碳二眯唑法进行核苷三磷酸的合成， 但对于c t p 的研究并不很成功。随后，s i m o n ，e s 等对碳二咪唑法的几个细节 进行了修改。由于乙腈更容易汽化，为简化工序，用乙腈代替了二甲基甲酰胺 ( d m f ) 作为溶剂。可以通过溶化的无水焦磷酸与三正丁铵的乙腈溶液反应后经 离子交换柱就可以制备i m 左右的三正丁铵盐焦磷酸试剂，而不需要直接用昂贵的 结晶三正丁铵盐焦磷酸。他们还认为，每摩尔单核苷酸仅仅需要4 摩尔的碳二眯 唑，而不是h o a r d ，d e 所报道1 1 8 的5 摩尔，在该条件下，转化率更高。 由于化学法合成所用试剂多、工艺复杂、条件要求高、反应时间长等缺点，不 大容易实现大规模的工业化生产。到了9 0 年代，随着生物技术的快速发展，c t p 的合成从化学方法转入了酶转化研究。 2 1 2 光合磷酸化法合成 光合磷酸化的原理是在离体条件下，利用植物的叶绿体，把光能转变成化学能， e 口使c d p 变成c t p ，使化学能以高能磷酸键的形式保留下来。机理如下： 6 - 冶华 h 第二章c t p 的研究进展 肌檄酶 c m i + g t p t 引子) _ 2 c b p 2 印n 丽衽絮7 图2 2 光合磷酸化反应机理 f i g u r e 2 2t h em e c h a n i s m o f p h o t o p h o s p h o r y l a t i o n 詹谷宇等人研究了用菠菜叶绿体通过光合磷酸化反应将c m p 合成为c t p ， 其反应系统见表2 2 表2 2 光合磷酸化反应中各组分的配比 t a b l e 2 2t h er e a c t i o ns y s t e ma b o u t p h o t o p h o s p h o r y l a n o n 将该反应系统中各物质混合后放入搪瓷盘中，液层厚度l c m 左右，碘钨灯照 光，光照强度l o 万烛光，反应温度控制在1 5 2 0 并不时搅动，反应时间为1 h 。 光合成c t p 的反应情况，用反应液中无机磷的减少为指标，以全部c m p 转化为 c t p 的降磷率为1 0 0 。研究表明：在正常条件下，c t p 合成的光合降磷率平均值 为8 5 3 ，约2 8 0 9 菠菜叶可将l g c m p 合成1 3 9 c t p ，即转化率为8 5 左右。 2 1 3 生物法合成 2 1 3 1 通过从头合成途径合成c t p 在生物体内，c t p 的合成是从谷氨酰胺开始的】，整个途径见图2 3 ： 第二章c t p 的研究进展 h c o j + a 一o + d 邪。 。a r b 帅。i m p h e t s h p h a s a e t 。 c 盯b 钔o y l p h 。5 p h a t 2 ，目r 叫m 。 熹a t 心。儿“h 人c q 上- 8 叩盯t e c e rb 枷o y l t e r q s e 娘昕嚣：。娘嘶磊dih 。入n ，7 。：等。：。o 人口人c o i ；嚣：嚣：。：。 屿 0 肝 d e c 吖b o x y l a s e “。高；尹”“ 。拶一e 守影 ”i d i n 揣；尹。s 曲一 。i “潲t r i “5 灿“。7 “t r i p h 。呐“ ( e s c h e r i c h i ac o l i ) 阻圳酿酒酵母( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) 2 4 1 ，和哺乳动物 舯 脚 艘 勰 姗 凇 酵母量 c m p 浓度 初始葡萄糖浓度。最适反应条件：酵母量2 5g ，c m p 浓度6 0 0r a m o l l ，初 始葡萄糖浓度1 5 0 0m m o l l ，p h 为6 0 ，反应时间2 0h 。 通过正交优化后，得到了整个反应体系的最佳条件：在2 5g 酵母量中加入2 0 m l 底物溶液，底物溶液包括c m p6 0 0m m o l l 、葡萄糖1 5 0 0m m o l l 、磷酸盐缓 冲液( 钠盐) 2 5 0 0 m m o l j l 、氯化镁8 0 m m o l l 、p h 为6 0 ，温度3 5 、反应时 间2 0 h ，并添加3 0 m m o l l a t p 及3 滴吐温。 在该条件下，进行三次平行试验，结果见表4 9 。 表4 9 最优化条件下实验验证结果 t a b l e 4 9 廿l er a t eo f c o n v e r s i o nu n d e rt h eb e s t c o n d i t i o n s 得到的初始葡萄糖浓度及磷酸盐浓度变化过程见图4 1 1 。从图中可以看出，反 应开始的8 0m i n 内，葡萄糖急剧下降，糖酵解迅速进行，也就意味着a t p 的大最 第四章利用游离酵母细胞合成c t p 的研究 产生，磷酸盐浓度也相应的随着葡糖糖浓度的下降而降低。同样从图4 1 2 看，c t p 在这段时间内有大量的积聚，转化率持续上升。近2 0h 后，糖酵解基本结束，a t p 的再生体系无法维持，c t p 增量趋向于平衡，随着反应时间的继续增加，c t p 开 始有所降解，无机磷浓度也明显得到提高。 1 0 0 术8 0 i f - 6 0 萎4 0 2 0 0 时问m i n 图4 1 2 过程分析图 f i g u r e 4 1 2a s s a yo f t h er e a c t i o np r o c e s s 0 5 01 0 0 时间，i l n 5 0 2 0 025 0 图4 1 3 最优化条件下转化率随时间变化的关系 f i g u r e 4 1 3t h er e l a t i o nb e t w e e nt h ey i e l da n dt h e r e a c t i o nt i m eu n d e rb e s tc o n d i t i o n s 从结果看，在该条件下，各个批次的转化率都能维持在8 0 l ? a k 。这说明利 用游离的废啤酒酵母进行c m p 的转化效果良好。 第五章利用酵母游离酶系进行c t p 合成的研究 第五章利用酵母游离酶系进行c t p 合成的研究 5 1 前言 利用游离酶进行c t p 的转化已有很多相关的报道。以l r i p 为底物，可利用 c t p 合成酶进行催化；以c m p 为底物，c m p 到c d p 的途径可通过腺苷酸激酶、 胞苷磷酸激酶、尿苷酸激酶来实现，c d p 到c t p 的途径可选择的余地较大，可通 过丙酮酸激酶、乙酰磷酸激酶、核苷二磷酸激酶、多聚磷酸激酶等来实现。然而所 涉及到的这些酶及试剂都是比较的昂贵。虽然转化率较高，但从经济角度讲，并 不十分合算，不适合大规模的生产。 啤酒酵母含有1 0 0 多种酶，在复合激酶体系下，c m p 能有效的被催化合成 c t p ，这方面的已有较多的研究。通过对啤酒酵母的培养得到的酶液，其反应原理 同游离酵母催化一致，在葡萄糖存在的情况下同样可以进行e m p 途径来产生a t p 。 通过对酶液的提取，可降低底物的传递阻力，增大底物与酶的接触效率，能更好 的起到催化作用。据林元藻等报道，通过该法，c t p 的含量达8 5 ，褥率近1 0 0 ，效果显著。 5 2 实验材料与方法 5 2 1 实验材料 见第四章表4 1 ，表4 2 5 2 2 实验方法 5 2 2 1 葡萄糖的测定3 ，5 一二硝基水杨酸比色法 见4 2 2 1 4 1 第五章利用酵母游离酶系进行c t p 合成的研究 5 2 2 2 无机磷的测定磷钼酸定磷法 见4 2 22 5 2 2 3 核苷酸的测定高效液相色谱( h p l c ) 法 见4 ，2 2 3 52 2 4 反应初条件的建立 1 ) 酶液的制备取废啤酒酵母2 0g ，置于2 5 0n 1 l 的锥形瓶中，在室温下冻 融后，加入2 0 m l 培养液( 包括8 0 葡萄糖、0 4 硫酸铵、o 3 磷酸二氢钾、o 1 氯化镁) ，3 5 e 水浴培养2 0 h 。3 0 0 0r p m 离心1 0 m i n ，取上清液，即为初酶，置于 4 冰箱中，备用。 2 ) 转化条件的建立 在2 5 0 m l 锥形瓶加入2 0 m l 酶液，再加入2 0 m l 底物溶液( 不同浓度c m p 、 葡萄糖1 5 0 0m m o l l 、磷酸盐缓冲液( 钠盐) 2 5 0 0m m o l l 、氯化镁8 0m m o l l 、 p h 为7 0 ) ，温度3 5 。 5 2 2 5 传质路径的研究 各称取2 0 9 经洗净离心后的废啤酒酵母和新鲜啤酒酵母，按所得最佳反应条 件进行转化实验，与单独使用酶液所得转化率进行比较，从而确定出转化过程中 传递路径。 5 3 结果与讨论 5 3 1 单因素水平上工艺条件的优化 5 3 1 1 不同底物浓度下反应时间变化对转化率的影响 由图5 1 可知，当c m p 浓度为4 0 0m m o l l 时，各时间段的转化率普遍高于 其它浓度。反应时问达2 0h 后，转化率基本趋向于稳定，c m p 浓度越高，转化率 越低。与游离细胞相比较，c m p 浓度较低时，不会随着反应时间的进行转化率大 幅度下降。这就说明了游离细胞会利用c t p 进行自身代谢。根据这些曲线，可以 得到实验基准条件：c m p 4 0 0m m o l l 、葡萄糖1 5 0 0m m o l l 、磷酸盐缓冲液( 钠 盐) 2 5 0 ，0 m m o l l 、氯化镁8 0 m m o l l 、p h 为7 0 ，温度3 5 、反应时间2 0 h 。 4 2 第五章利用酵母游离酶系进行c t p 合成的研究 在此基础l 二进行单因素水平上的实验。 时间r a i n 图51 不同c m p 浓度下转化率与时间关系图 n g u r e 5 1t h er e l a t i o nb e t w e e nt h ey i e l d a n dr e a c t i o nt i m eu n d e rd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o no f c m p 5 3 1 2c m p 浓度对转化率的影响 1 0 07 抻8 0f 料6 0l 蓑：4 ； o 广、 0 2 04 06 08 01 0 01 2 0 c m p 浓度r e t o o l l 。 图5 ，2c m p 浓度对转化率的影响 f i g u r e 5 2e f f e c to f c m pc o n c e n t r a t i o no nt h e s y n t h e s i so f c t p 由图5 2 所知，c m p 浓度为4 0 0m m o i _ l 具有最高转化率，c m p 浓度的过高 或过低均会降低反应的c m p 转化率。此催化反应系可逆反应，在一定的浓度范围 ( 小于4 0 0m m o l l ) 下，增加c m p 的浓度能促进转化率的提高，但底物浓度过 大，反而起到抑制作用，转化率下降较为明显。 5 3 1 3 反应时j 司对转化率的影响 从图5 3 可知，随着反应时间的进行，转化率得到逐渐的提高，当反应2 0h 时，有一最佳转化率，此后转化率趋向于稳定，但也略有下降。这说明，反应初 期，酶促反应得到快速进行，转化率增大，当达到2 0h 后，酶基本上与底物处于 饱和状态，从而转化率得不到提高。又由于c t p 降解酶的存在，有一部分被降解， 因此转化率有所下降。 4 3 第五章利用酵母游离酶系进行c t p 台成的研究 ，厂 02 04 06 0 8 01 0 0 1 2 0 1 4 01 6 01 8 0 2 0 0 2 2 0 时间r a i n 图53 反应时问对转化率的影响 f i g u r e 53e f l k to f t h er e a c t i o nt i m eo n t h es y n t h e s i so f c t p 5 3 1 4 酶量对转化率的影响 1 0 2 0 酶量向1 3 0 4 05 0 图5 4 酶量对转化率的影响 f i g u r e 54e f f e c to fe n z y m e l sy i e l d o nt h es y n t h e s i so f c t p 酶量过低，酶促反应不充分，转化率也不高。从图中可知，当酶量达2 0 l l l 以上，转化率就能维持在较高水平。 5 31 5 磷酸盐浓度对转化率的影响 1 0 0 抻8 0 奔6 0 菱t o 2 0 0 01 0 02 0 03 0 0蛐0 5 0 06 0 07 0 0 磷酸盐浓度m m o l l - 1 图55 磷酸盐浓度对转化率的影响 f i g u r e 55e f f e c t o f p h o s p h a t ec o n c e n t r a t i o n o nt h es y n t h e s i so f c t p 从图5 5 可知，磷酸盐浓度过低，由于磷酸基团的供给不足导致转化率过低， 当浓度为3 0 0 0m m o l l 时，转化率达到最佳值。当浓度高于3 0 0 0i l u n o l ，l 后，转 化率虽有所下降，但降低幅度很少，这说明较高的磷酸盐浓度并没有对催化起到 4 4 鲫那 ，章革样 ，斟葚毒毒 第五章利用酵母游离酶系进行c t p 合成的研究 明显的抑制作用。 5 3 1 6p h 值对转化率的影响 4567891 0 p h 值 图5 6p h 对转化率的影响 f i g u r e 5 6e f f e c to f p ho nt h es y n t h e s i so f c t p 从图5 6 可以看出，磷酸盐缓冲液的p h