（物理化学专业论文）酶法催化制备生物柴油的研究及脂肪酶的化学修饰.pdf

摘要 摘要 生物柴油是从动植物油脂制备的脂肪酸单烷基酯。作为一种无毒、可生物降 解和可再生的替代燃料，它已受到越来越多的关注。生物柴油的合成方法有很多， 主要分为四种：液相反应、固液相反应、高温高压反应、脂肪酶催化反应。脂肪 酶法合成生物柴油有着其它合成方法不可比拟的优点。该法条件温和，醇用量小、 无污染排放。另外，用脂肪酶作为催化剂制备生物柴油，反应过程不受原料中水 和游离酸的影响。脂肪酶是一种作用于油水界面上的水解酶，其底物油脂在水中 不易分散，需借助于有机溶剂才能溶解，而酶暴露在有机溶液中容易失活。现有 二种方法可避免酶直接暴露于有机溶液中：一是采用反胶束的方法，二是酶的化 学修饰。脂肪酶的化学修饰不仅可以确定酶的功能基团，使底物和酶更容易发生 接触，从而提高反应速度，而且在提高酶的稳定性，延长酶失活的半衰期，提高 催化活性，甚至创造新的催化功能等方面都有重要意义。 本文主要利用气相色谱作为检测手段，研究生物酶催化合成生物柴油过程中 的最优化条件，探讨双底物酶催化酯交换反应的动力学机理，并对猪胰脂肪酶进 行表面活性剂修饰，研究化学修饰对酶的催化性能的影响。主要分为以下三部分： 第一部分内容是讨论醇油比、有机溶剂种类、有机溶剂体积、反应温度、酶 种类、酶用量等条件对合成生物柴油的影响，并选取一个合适的反应条件作为本 实验研究的催化生物柴油的体系。实验结果表明，当醇油比为3 2 5 ：1 ，有机溶剂 选用叔丁醇，并使其与油的体积比为0 8 ：1 ，反应温度4 0 4 5 ，使用 n o v o z y m 4 3 5 催化，并使其与油的质量百分比为2 时，测得的生物柴油的产率 最高。 第二部分内容是在适当的反应条件下，研究双底物酶催化酯交换反应动力学 性质。通过推导出来的反应速率方程，用o r i g i n 软件拟合实验曲线得到了相应 的动力学常数，并结合a r r h e n i u s 公式得到相关的热力学常数。实验结果表明， 有机相酶催化酯交换反应过程分两步进行，第一步反应是甘油三酸酯与脂肪酶形 成酰基化酶复合物，其活化能大于第二步反应，即酰基化酶与甲醇的反应。并且， 随着温度的升高反应速率随之增大，但增大的幅度逐渐减小，即温度越高，反应 速率对温度越不敏感，其主要原因是甘油三酸酯与脂肪酶形成酰基化酶复合物过 摘要 程和酰基化酶与甲醇反应过程的活化能均较小，所以提高温度对反应速率的影响 不是很大。 第三部分内容是采用吐温8 0 作为修饰剂，甲醛作为偶联剂，在不同的p h 条件 下，对猪胰脂肪酶进行化学修饰，然后改变温度条件，考察化学修饰前后的猪胰 脂肪酶对大豆油及甲醇的酯交换反应的催化效果。实验结果表明，化学修饰的最 佳p h 条件为7 0 ：经过化学修饰的猪胰脂肪酶比未修饰酶的催化效率明显提高： 当催化反应的温度为4 5 时，生物柴油的产率最高。 关键词：生物柴油；酶修饰：反应动力学 a b s t r a c t a b s t r a c t t h eb i o d i e s e li st h em o n o a l k y lf a t r ya c i de s t e rw h i c hi sm a d ef r o ma n i m a lf a to r t h e v e g e t a b l eo i l i t i sm o r ea n dm o r ec o n c e r n e da sak i n do fi n n o c u o u s ， b i o d e g r a d a b l ea n dr e n e w a b l ea l t e r n a t i v ef u e l t h e r ea r em a n y m e t h o d sf o rb i o d i e s e l s y n t h e s i z e ，m a i n l yb ed i v i d e di n t of o u rs p e c i e s ：l i q u i dp h a s er e a c t i o n , s o l i d - l i q u i d p h a s er e a c t i o n , r e a c t i o n u n d e r h i g ht e m p e r a t u r e a n d h i 曲p r e s s u r e a n d l i p a s e - e a t a l y t i cr e a c t i o n t h em e t h o do fl i p a s e - c a t a l y z e ds y n t h e s e so f b i o d i e s e lh a s m a n yi n i m i t a b l ee x c e l l e n c es u c ha sm i l dc o n d i t i o n s ，l o wd o s a g eo fa l c o h o la n dn o p o l l u t i o n i na d d i t i o n , w en e e dn o tt a k ew a t e ra n da c i dd i s s o c i a t e di ns o l u t i o ni n t o c o n s i d e r a t i o ni nl i p a s e - c a t a l y z e dw a yo fp r e p a r i n gb i o d i e s e l a st h es u b s t r a t eh a r d l y d i s s o l v e si nw a t e r , w eu s es o m eo r g a n i ci m p r e g n a n t b u tt h el i p a s e ，ak i n do f h y d r o l y t i ce n z y m ea c to nt h eo i l - w a t e ri n t e r f a c e ，m a yi n a c t i v a t e t h e r ea r e t w ow a yt o a v o i dt h el i p a s ee x p o s i n gi nt ot h eo r g a n i ci m p r e g n a n t o n em e t h o di su s i n gr e v e r s e d m i c e l l e t h eo t h e ri sm e t h o do ff 自t l z y m ec h e m i c a lm o d i f i c a t i o n t h eh e r o i c a l m o d i f i c a t i o no fl i p a s en o to n l yc a ne n s u r et h ef u n c t i o n a lg r o u p s ，b u ta l s oc a ne m u l s i f y t h es u b s t r a t ew h i c hm a k el i p a s ea n ds u b s t r a t ec o n t a c te a s i l yi no r d e rt os p e e du pt h e r e a c t i o n a tt h es a m et i m e ，i ti ss i g n i f i c a n ti ni m p r o v et h es t a b i l i t ya n dc a t a l y t i c a c t i v i t y , e x t e n dt h eh a l f - l i f ea n dc r e a t en e wc a t a l y t i cf u n c t i o n f i r s to fa l l ，t h i st e x th a sd i s c u s s e dt h em a s sr a t i oo fa l c o h o la n do i l ，c a t e g o r yo f o r g a n i ci m p r e g n a n t , v o l u m eo fo r g a n i ci m p r e g n a n t , t e m p e r a t u r e ，c a t e g o r yo fe r l z y n l e a n dd o s a g eo fe r l z y m et os e l e c tap r o p e rr e a c t i o nc o n d i t i o na st h i sc a t a l y t i cb i o d i e s e l s y s t e m i tg e t sah i g h e s ty i e l du n d e rt h ec o n d i t i o na sf o l l o w ：t h em a s sr a t i oo fa l c o h o l a n do i li s3 2 5 ：1 ，c a t e g o r yo fo r g a n i ci m p r e g n a n ti st - b u t a n o l ，t h ev o l u m er a t i oo f t - b u t a n o la n do i li so 8 ：1 ，r e a c t i o nt e m p e r a t u r ei s4 0 - - 4 5 。c ，c a t e g o r yo f e n z y m ei s n o v o z y m 4 3 5a n dt h em a s sr a t i oo f n o v o z y m 4 3 5a n do i li s2 s e c o n d l y , w em e a s u r et h ek i n e t i c so ft h eb i s u b s t r a t ea n dg e tt h ek i n e t i cc o n s t a n ta n d t h e r m o d y n a m i cc o n s t a n t a sw ec a ns e ef r o mt h er e s u l t t h e r ea r et w os t e p si nt h e l i p a s e - c a t a l y z e dt r a n s e s t e r i f i c a t i o ni no r g a n i cp h a s e f i r s t l y , t r i g l y c e r i d ea n dl i p a s e i i i a b s t r a c t f o r ma c y l a t e de n z y m ec o m p l e x e sw h o s ee n e r g yo fa c t i v a t i o ni sh i g h e rt h a nt h e s e c o n ds t e pw h i c hi st h er e a c t i o nb e t w e e na c y l a t e db 朗z y m ea n dm e t h a n 0 1 f o c u s i n go nt h ee n e r g yo fa c t i v i t y , t h ef i r s tp r o g r e s si st h er a t ed e t e r m i n gs t e p ，i t i sr e a s o n a b l ea tt h eb e g i n n i n g , b u tb e c a u s et h el o we n e r g yo fa c t i v i t yo ft h e s et w o s t e p s ，t h er e a c t i o ni sf a s t i nf a c t ，i ti sas l o wr e a c t i o n i ns p i t eo ft a k i n gt - b u t a n o la s m e d i u mt od i s s o l v em o r eg l y c e r o la n dr e d u c et h ei n f l u e n c et ot h eb 既l z y m e ，t h e e l d g l y c e r o ld e c r e a s et h ev d o c i t yo ft h er e a c t i o nr a t e a c c o r d i n g t ot h ea r r h e n i u e q u a t i o n , t h ee n e r g yo fa c t i v i t ye ai s 瓦= r t 2 d d l n _ _ _ z _ k k w ，e c 锄s e et h a t , l a g e rt h ee ai s ，缸t e r 廿1 er e a c t i 。nr a t ei s 勰l e t e m p e r a t u r er i s e ，t h a ti s ，i nh i g ht e m p e r a t u r e ，t h er a t ei sm u c hs e n s i t i v ea n du n d e rt h e c o n d i t i o no fs m a l le a ，t h er a t eb e c o m el e s ss e n s i t i v e i nt h ep r o g r e s s e so ft h e t r i g l y c e r i d er e a c t sw i t hl i p a s ea n dt h ep r o d u c t i o na c y l a t e de n z y m er e a c t sw i t h m e t h a n o l ，t h ee ab o t ha r es m a l l ，s ot h et e m p e r a t u r eh a sal i t t l ei n f e c t i o n f i n a l l y , t h i st e x tu s et w e e n - 8 0a st h em o d i f i e r , f o r m a l d e h y d ea sc o u p l i n ga g e n t i nd i f f e r e n tp hc o n d i t i o n s ，w ec h e m i c a lm o d i f yt h ep o r c i n ep a n c r e a sl i p a s ea n df i n d o u tt h a tt h eo p t i o n a lp hi s7 0 i nd i f f e r e n tt e m p e r a t u r e sw ed i s c u s s i n gt h er e s u l t so f p o r c i n ep a n c r e a sl i p a s ea n dm o d i f i e dp o r c i n ep a n c r e a sl i p a s ec a t a l y z et h es o y b e a no i l a n dt r a n s e s t e r i f i c a t i o n t h er e s u l ts h o w st h a t , c a t a l y t i c e f f i c i e n c yi sd i s t i n c t l y i m p r o v e db yt h em o d i f i e dp o r c i n ep a n c r e a sl i p a s e , t h ey i e l dc o m e st ot h em a xi n4 5 k e yw o r d s ：b i o d i e s e l ，a l z y m em o d i f y , k i n e t i c s i v 厦门大学学位论文原创性声明 本人呈交的学位论文是本人在导师指导下，独立完成的研究成 果。本人在论文写作中参考其他个人或集体已经发表的研究成果，均 在文中以适当方式明确标明，并符合法律规范和厦门大学研究生学 术活动规范( 试行) 。 另外，该学位论文为() 课题( 组) 的研究成果，获得() 课题( 组) 经费或实验室的 资助，在() 实验室完成。( 请在以上括号内填写课 题或课题组负责人或实验室名称，未有此项声明内容的，可以不作特 别声明。) 声明人( 签名) ： 年月 日 厦门大学学位论文著作权使用声明 本人同意厦门大学根据中华人民共和国学位条例暂行实施办 法等规定保留和使用此学位论文，并向主管部门或其指定机构送交 学位论文( 包括纸质版和电子版) ，允许学位论文进入厦门大学图书 馆及其数据库被查阅、借阅。本人同意厦门大学将学位论文加入全国 博士、硕士学位论文共建单位数据库进行检索，将学位论文的标题和 摘要汇编出版，采用影印、缩印或者其它方式合理复制学位论文。 本学位论文属于： () 1 经厦门大学保密委员会审查核定的保密学位论文， 于年月日解密，解密后适用上述授权。 () 2 不保密，适用上述授权。 ( 请在以上相应括号内打“或填上相应内容。保密学位论文 应是已经厦门大学保密委员会审定过的学位论文，未经厦门大学保密 委员会审定的学位论文均为公开学位论文。此声明栏不填写的，默认 为公开学位论文，均适用上述授权。) 声明人( 签名) ： 年月 日 第一章前言 第一章前言 1 1 生物柴油的概述 生物柴澍1 】的主要成分为脂肪酸甲酯1 2 3 】。虽然脂肪酸甲酯在上个世纪8 0 年代 【4 】才广泛被用作柴油机燃料，但天然油脂酯交换反应在1 9 4 5 年就已经取得了美国 专利。在1 9 4 9 年s m i t h 申请的专利中，酯交换反应的醇油摩尔比为6 ：1 至1 j 1 2 ：1 ，反 应温度2 0 - 3 5 ，催化剂n a o h 的用量为油重的0 0 0 5 - 0 3 5 ，这个反应是均相反 应。 其后的2 0 余年里，人们只是不断研制新的催化剂和方法进行酯交换反应 5 1 ， 直到1 9 8 3 年美国科学家g r a h a m q u i c k 才首次将亚麻籽油的甲酯用于柴油发动机 的燃料，使柴油发动机运行了1 0 0 0 h t 们。也因为是柴油机燃料，美国a s t m ( t h e a m e r i c a ns o c i e t yf o rt e s t i n ga n dm a t e r i a l s ) 将从可再生的液体原料( 如动植物油 脂) 制备得到的长链脂肪酸单酯定义为生物柴油( b i o d i e s e l ) 7 - w ! 。 i i 1 生物柴油的定义及性能 根据美国生物柴油协会n b b 的定义【1 1 涠，生物柴油的定义有两种：t e c h n i c a l d e f i n i t i o n ( 技术定义) 和g e n e r a ld e f i n i t i o n ( 广义定义) 。 技术定义：生物柴油b 1 0 0 是指从动植物油脂制备的脂肪酸单烷基酯，工业 应用上主要是指脂肪酸甲酯，在我国需要达到“g b t 2 0 8 2 8 2 0 0 7 柴油机燃料调 和用生物柴油( b d l 0 0 ) 标准指标。 广义定义：生物柴油是指从天然油脂制备的柴油，可以是单烷基酯，也可以 是其它柴油，比如油脂加氢制备的柴油。若是单烷基酯柴油，需达到“g b t 2 0 8 2 8 2 0 0 7 柴油机燃料调和用生物柴油( b d l 0 0 ) 一标准指标；若是烷基柴油， 需达到石化柴油相应的标准。除此以外，由油脂制备的其它燃料，若国家没有明 确的标准限制，且没有政策推广使用，则不算生物柴油，可称为生物燃料油，不 宜车用，主要应用于锅炉等领域。 众所周知，柴油主要成分是由1 5 个左右的碳链组成的。研究发现，植物油 分子则一般由1 4 - - - 1 8 个碳链组成，与柴油分子中碳数相近。按化学成分分析， 第一章前言 生物柴油燃料是一种脂肪酸甲酯，它是通过以不饱和油酸c 1 8 为主要成分的甘油 酯分解而获得的。 与常规柴油相比，生物柴油具有下述无法比拟的性能【1 6 】： 1 具有优良的环保特性。生物柴油中硫含量低，使得二氧化硫和硫化物的排 放低，可减少约3 0 ( 有催化剂时可减少7 0 ) ；生物柴油中不含对环境造成污 染的芳香族烷烃，因而产生的废气对人体损害低于柴油。检测表明，与普通柴油 相比，使用生物柴油可降低9 0 的空气毒性，降低9 4 的患癌率；由于生物柴 油含氧量高，使其燃烧时排烟少，一氧化碳的排放与柴油相比减少约1 0 ( 有 催化剂时可减少9 5 ) ；生物柴油的生物降解性高。 2 具有较好的低温发动机启动性能。无添加剂冷滤点达2 0 。 3 具有较好的润滑性能。使喷油泵、发动机缸体和连杆的磨损率低，使用 寿命长。 4 具有较好的安全性能。由于闪点高，生物柴油不属于危险品。因此，在 运输、储存、使用方面的安全性是显而易见的。 5 具有良好的燃料性能。十六烷值高，使其燃烧性好于柴油，燃烧残留物 呈微酸性，使催化剂和发动机机油的使用寿命加长。 6 具有可再生性能。作为可再生能源，与石油储量不同，其通过农业和生 物科学家的努力，可供应量不会枯竭。 7 无需改动柴油机，可直接添加使用，同时无需另添设加油设备、储存设 备及人员的特殊技术训练。 8 生物柴油以一定比例与石化柴油调和使用，可以降低油耗、提高动力性， 并降低尾气污染。 生物柴油的优良性能使得采用生物柴油的发动机废气排放指标不仅满足目 前的欧洲i i 号标准，甚至满足随后即将在欧洲颁布实施的更加严格的欧洲i 号标 准。而且由于生物柴油燃烧时排放的二氧化碳远低于该植物生长过程中所吸收的 二氧化碳，从而改善由于二氧化碳的排放而导致全球变暖这一有害于人类的重大 环境问题。因而，生物柴油是一种真正的绿色柴油。 多年来，生物柴油的高成本一直是其难以推广的主要原因。近年来，国际原 油价格的不断攀升，人们对全球原油资源枯竭的担忧以及“京都议定书 对环保 2 第一章 前言 的要求，促使各国开始重视对生物柴油的应用。目前世界上许多国家正大力开发 生物柴油技术并推进其产业化进程，大多使用2 0 生物柴油与8 0 石化柴油混 配，其可用于任何柴油发动机和直接利用现有的油品储存、输运和分销设施。 1 1 2 国际新技术 生物柴油经过多年的研究和实践，其生产技术和使用技术已经进展到一定的 深度。世界各国根据不同原料的特性研发出许多不同的技术与生产工艺，尽管名 称各不相同，但概括起来主要有四种：液相反应、固液相反应、高温高压反应、 脂肪酶催化反应。国外对生物柴油的传统催化技术已经很成熟，这里仅介绍一些 新型催化技术： 1 对传统液相催化的改进，包括共溶剂技术侬1 9 1 ( b i o x ，已工业化) 和超 声波微波技术 2 0 - 2 2 。 2 固体碱催化剂【2 3 2 4 1 ( 已工业化) ，包括有机碱催化剂，如有机胺类、。胍 类化合物圆和生物酶催化技术【2 6 2 7 】； 3 其它固体催化剂，如日本y o n e m o t o 研究组的离子交换树脂催化剂 2 引、美 国爱荷华州立大学研制的纳米球催化剂【2 9 刁1 1 、印度国家化学实验室研发的双金属 盐催化剂3 刁以及德国的氨基酸金属络合物固体催化剂3 3 1 等； 4 其它新技术，如美国第二大乙醇生产商v e r a s u n 公司开发的，从酒糟中 生产生物乙醇和生物柴油【3 4 1 、美国北卡罗林那州立大学开发的c e n t i a 技术p 5 1 、 油脂加氢裂化或精制3 6 3 7 来制取烷烃柴油技术( 芬兰纳斯特石油公司、加拿大 c e t c 、u o p 公司和埃尼公司、巴西石油公司、日本石油公司与丰田汽车公司等 等都有采用) 、无催化剂超临界技术【3 8 。4 3 】( 日本住友化学公司以甲醇与大豆油等 植物油反应，反应在2 4 0 、8 m p a 下进行。主产物为脂肪酸甲酯，副产品为甘 油，产出比为1 ：3 ，现已获得专利) 等。 1 1 3 国内技术 目前国内生物柴油各生产工艺中，已经达到工业化的生产技术有，减压蒸馏， 酸碱催化酯交换技术。酸碱法合成生物柴油有以下主要的缺点：工艺复杂、醇 必须大大过量，后续工艺必须有相应的醇回收装置，能耗高；由于脂肪中不饱和 3 第一章前言 脂肪酸在高温下容易变质，色泽深；酯化产物难于回收；对原料要求高，导致生 产成本高；生成过程有大量废液排放，对环境的污染大。 现国内正在开发并有少数企业投入生产的先进工艺有超临界技术 4 4 邯j 、酶催 化技术【蜘和固体碱技术【4 7 。4 9 1 等，这些技术都可以降低“三废的排放量，减少 对环境的污染。 1 1 4 国内现状 我国长期能源形势十分严峻，且随着我国工业化的加快，能源需求越来越大。 目前每年年耗能量达到标煤1 5 亿吨左右，而且每年以近1 5 增长。另一方面， 由于我国传统石化能源在5 0 年代后期，因储量减少而大幅减产，面临枯竭，近 年来大量依靠进口。当前，国际形势和主要石油产地中东局势使得我国石油供应 面临严重挑战和重大安全威胁，如果现在不超前加快发展替代能源，届时很可能 发生能源危机，波及我国经济和社会安全与稳定。 生物柴油在我国发展潜力巨大，将对保障我国石油安全、保护生态环境等产 生积极而重要的作用。2 0 0 2 年前后，我国仅有少数几家企业涉及生物柴油的研究、 开发和产业化，并形成了年产1 5 万吨的生产规模，中国海南正和生物能源公司、 四川古杉油脂化工公司和福建卓越新能源发展公司都己开发出拥有自主知识产 权的技术，相继建成了规模超过年产万吨的生产厂 5 0 l 。2 0 0 5 年我国开始大力发 展生物柴油，国内已公开的具有自主知识产权的技术专利有l o 种 5 1 - s 4 1 以上，涉及 技术研究的文献有3 0 余篇，内容包括生物柴油生产技术和应用研究的各个方面。 在技术研究取得进展的同时，中小型民营企业和个体蓬勃发展，最多时总量 估计近1 0 0 0 家。但由于我国生物柴油发展起步晚，技术力量薄弱，产品缺乏统一 标准，竞争力不强，所以2 0 0 6 年下半年之后各企业逐渐冷静下来，许多企业转行， 如精炼废弃油脂行业。所以我国生物柴油发展虽面临机遇，但挑战巨大。 近几年来我国政府也十分重视生物柴油市场建设，2 0 0 6 年1 月1 日，国家颁布 中华人民共和国可再生资源法，以法律的形式确立了生物柴油的合法地位， 鼓励企业和个人投资生产生物柴油，明确规定了石油销售企业将符合国家标准的 生物柴油纳入其燃料销售体系。2 0 0 7 年5 月国家出台了一个推荐性的生物柴油技 术标准，对规范市场起到一定的指导作用。但由于我国生物柴油起步较晚，强制 4 第一章前言 性的技术质量标准还没有出台，各种措施还没有落实到位，生物柴油的市场体系 还没有建立【5 5 1 。 1 2 脂肪酶的化学修饰及概述 1 2 1 脂肪酶的概述 脂肪酶( 1 i p a s ee c 3 1 1 3 ) 亦称酰基甘油水解酶( a c y l g l y c e r o lh y d r o l a s e s ) ， 广泛存在于原核生物( 如细菌【5 6 1 ) 和真核生物( 如霉菌【5 7 1 、哺乳动物【5 8 】、植物s 9 1 等) 。脂肪酶是最早被研究的酶类之一，人们对它的研究己有上百年的历史。 我国脂肪酶的研究只有4 0 多年历史，2 0 世纪6 0 年代末才有报道。1 9 6 7 年， 中国科学院微生物研究所筛选到一株解枝假丝酵母( c a n d i d al i p o l y t i c a ) a s 2 1 2 0 3 。2 0 世纪7 0 年代末我国开始碱性脂肪酶的研究，施巧琴教授于1 9 8 1 年在国内成功筛选了碱性脂肪酶产物( p e n i c i l l i u r ne x p a n s u m ) t 鲫，并且于1 9 8 4 年 首次在江苏南通投入生产。进入9 0 年代，我国科技工作者紧跟国际研究热点， 脂肪酶的研究进入快速发展时期6 1 石3 】，这些都促进和加快了我国脂肪酶领域的研 究工作。 脂肪酶的天然底物是甘油酯类，然而研究表明，脂肪酶除了能够催化甘油酯 类的水解和合成之外，还可以用于催化酯交换反应、生物表面活性剂的合成、多 肽合成、聚合物的合成和药物的合成。 脂肪酶是一种作用于油水界面上的水解酶，其底物油脂在水中不易分散，需 借助于有机溶剂才能溶解，而酶暴露在有机溶液中容易失活。现有二种方法可避 免酶直接暴露于有机溶液中：一是采用反胶束的方法 6 4 - 6 9 1 ，反胶束有巨大的油水 界面，并可提供酶的微水环境，另一方面在一定程度上还可排除底物或产物对酶 催化活性的抑制作用，但反胶束结构不稳定，且不利于酶的分离提纯。二是酶的 化学修饰 7 0 - 7 3 1 ，不仅可以确定酶的功能基团，使底物和酶更容易发生接触，从而 提高反应速度，而且在提高酶的稳定性，延长半衰期，提高催化活性，甚至创造 新的催化功能等方面都有重要意义。 ，2 2 脂肪酶的化学修饰 酶的生物学活性不仅取决于其特定的一级结构( 化学结构) ，而且还取决于 第一章前言 其特定的空间结构。从广义上讲，凡是用化学或分子生物学方法对酶分子进行改 造，通过化学基团的引入或除去，而使酶的共价结构发生改变的方法都可称为酶 的化学修饰。 酶的化学修饰已有几十年的历史，起初人们致力于小分子化合物修饰酶分子 中氨基酸侧链基团来研究一些酶的活性位点，得到了许多有价值的数据，为酶结 构与功能的关系研究以及酶催化机理研究作了许多有益的探索【7 4 】。 后来认为为了消除某些蛋白质的抗原性，用聚丙氨酸进行修饰，结果发现其 抗原性显著降低，并从中得到了很大的启示。于是，研究者们相继开发了多种酶 化学修饰方法，用以改善酶的性质，可以用来进行化学修饰的修饰剂有很多，既 包括一些小分子如甲醛和戊二醛，也有一些大分子如多肽和聚乙二醇等。 随着各个学科及相关技术的发展，特别对酶的结构与功能的深入了解、基因 工程及固定化技术的普及，酶的分子改造工程已经进入使用阶段。通常，酶经过 改造后，会产生各种各样的变化，概括起来有：l ，提高生物活性( 包括某些在 修饰后效应物反应性能的改变) ；2 ，增强在不良环境( 非生理条件) 中的稳定性； 3 ，针对异体反应，降低生物识别能力。可以说，酶化学修饰在理论上为生物大 分子结构与功能关系的研究提供了实验依据和证明，是改善酶学性质和提高其应 用价值的一种非常有效的措施。 酶的化学修饰以修饰部位划分主要是以下几方面：对酶分子的侧链基团( 尤 其是酶活性中心的必需基团7 5 8 1 】) 进行化学修饰，研究酶的结构与功能的关系； 通过对酶分子功能基团的修饰和与水不溶性大分子的结合，改造酶功能，增加酶 的稳定性；通过对酶分子内或分子间的交联，或与水不溶性载体障硼的结合制成 固定化酶，催化特定的反应；用化学方法合成新的有机催化剂；用分子生物学方 法克隆酶或修饰基因以便产生新的酶( 或突变酶) ，或设计新基因合成自然界不 存在的新酶( 抗体酶) 【弱j 。 若是通过修饰方法区分，可以分为脂包被【8 7 8 8 】、表面活性剂包被与修饰 8 0 - 0 4 、 聚合物修饰陋蚓、脱氧胆酸盐删等非共价修饰四种。 1 2 3 猪胰脂肪酶的表面活性剂修饰 猪胰脂肪酶的活性中心在以丝氨酸为主的三分子催化中心，这个中心埋藏在 6 第一章前言 一段螺旋结构的“盖子 下面。盖子的疏水基团与这个三分子的疏水区相结合。 这个盖子有许多游离的羟基、酚羟基、巯基、羧基、氨基等官能团，具有两亲性， 可以与一些小分子化合物如醛、酮、羧酸等发生烷基化、酰化、醚化等反应。尤 其是赖氨酸末端的e n h 2 具有较强的亲核性，能够与许多亲电试剂在温和的 条件下发生反应，这对在修饰过程中保持酶的活性、减少酶的活性损失是十分有 利的。所以，一n h 2 成为化学修饰的首选官能团。 据上所知，“盖子”的疏水表面与催化中心的疏水区相结合，暴露出来的另 一亲水端向外与水分子以氢键作用相结合。由于表面活性剂同样具有两亲性，它 会把亲水端朝酶，疏水端向外进行排列，把酶与外部的溶剂分开，使修饰了的脂 肪酶分配在内部的微水环境中，其疏水端可以阻止有机溶剂对酶的进一步作用而 造成酶的失活，使酶的性质更加稳定。 本文所用吐温8 0 是一种非离子表面活性剂。联接剂甲醛的醛基可以和脂肪 酶的自由氨基发生反应，生成一个半缩醛，半缩醛的羟基可以再与吐温8 0 亲水 端的羟基反应形成一个醚基，从而共价连接吐温8 0 和脂肪酶。 1 2 4 化学修饰反应条件的影响 由于许多蛋白化学修饰反应主要是由蛋白质分子的整体结构所控制，但也受 修饰的单个或一类基团的情况影响，因此这些化学反应对于所处的反应条件特别9 敏感。仔细选择反应条件是设计化学修饰反应时的关键步骤。 反应条件温和是防止蛋白质分子变性的一个必要条件。在所有影响蛋白质分 子的化学修饰反应条件中，p h 值是最重要的一个条件。酶分子上有许多酸性、 碱性氨基酸的侧链基团，它们随着p h 值的变化处于不同的解离状态，或者直接 影响与底物的结合和进一步反应，或者影响酶的空间结构，即体系p h 值的改变 将引起酶构象的改变，进而影响酶的催化能力【l o o 。因为它决定了具有潜在反应 能力的基团所处的可反应和不可反应的离子状态。温度也是一个必须要注意的条 件，因为温度可以影响到活性疏基的微环境。 总之，脂肪酶的化学修饰不仅可以确定酶的功能基团，而且在提高酶的稳定 性，延长半衰期，提高催化活性，甚至创造新的催化功能等方面都有重要意义。 7 第一章前言 1 3 酶法制备生物柴油的研究现状 研究发现，脂肪酶在催化醇与油脂的酯交换反应中是一种良好的催化剂。目 前关于酶法生产生物柴油的报道日益增岁1 0 1 - 1 0 6 l ，酶作为一种生物催化剂，具有 高的催化效率和经济性，采用酶催化剂可以解决目前化学方法生产生物柴油所用 的催化剂存在着分离困难、所需能量大等问题。但是脂肪酶在有机溶剂中存在聚 集作用，不易于分散开来，因此催化效率偏低。 为了使酶能够很好地分散于疏水的溶剂中，可以通过对酶蛋白侧链上功能基 进行共价修饰【1 0 7 1 、表面修饰1 吲、酶分子的生物印迹、酶晶体的交联0 9 、酶的 纯化方式以及预处理过程、酶的固定化以及结合定点突变的化学修饰o 】等多种 方法对于脂肪酶进行改性，使其能够分散在有机溶剂中，提高催化效掣1 1 。 目前，酶化学修饰方法已经成为改进酶的理化性质和生物活性，寻找新型生 物催化剂的一个有效工具【1 1 2 1 。诺维信公司( n o v o z y m e s ) 也已经开发出一种用 于非水系统的固定化脂肪酶的廉价方法，并已有固定化脂肪酶成品提供( 固定化 的南极假丝酵母脂肪酶，下面简称n o v o z y m 4 3 5 ) 。 用于催化合成生物柴油的脂肪酶主要有酵母脂肪酶、根霉脂肪酶、毛霉脂肪 酶、猪胰脂肪酶等。由于脂肪酶的来源不同，其催化特性也存在很大差异。 有文献报道了一些在无有机溶剂存在时能够有效地催化豆油醇解的脂肪酶。 在含水量很低的反应体系内，南极假丝酵母脂肪酶能有效地催化植物油甲酯的生 成；在一个起始含水质量分数为4 3 0 的反应系统内，来自于米根霉的胞外脂 肪酶能使催化转酯化反应发生，而在没有水存在时，该酶几乎无活性，这说明水 的少量存在有助于酶的催化；k a m i n i 掣3 】研究了来源于若干隐球菌s 2 的脂肪 酶在水中催化米糠油的醇解，最后反应液中甲酯的质量分数达n 8 0 2 ；杜伟等 【1 1 4 1 以短链脂肪酸醇作为酸基受体，用n o v o z y m 4 3 5 酶催化动植物油脂进行醇交换 反应，短链脂肪酸醇与油脂的摩尔比在3 ：1 n 2 0 ：1 ，反应数十小时得到生物柴油； o z n u r 等研究了在无溶剂的媒介中利用n o v o z y m 4 3 5 催化棉籽油的醇解，在温度为 5 0 、酶的质量为油质量的3 0 、油与醇的摩尔比为1 ：4 的条件下，反应7 h ，产 物中甲酯质量分数可达9 1 5 。 另外，文献也报道了在有机溶剂存在时脂肪酶的催化作用。如n e l s o n 1 1 习等 研究者报道，在固定脂肪酶催化的情况下，如果用正己烷作为有机溶剂，能够有 8 第一章前言 9 5 甘油三酯转化为脂肪酸甲酯。k a k u g a w a 等纯化了一种由能合成糖酯的酵母 k u r t 刁m 锄o m y c e ss p i 一1 1 产生的胞外脂肪酶。p h 范围1 1 9 7 1 2 ，p h 低于7 1 1 时，该 酶的活性很稳定，优先选择十八碳酰基；在质量分数为4 0 的各种有机溶剂中其 活性也十分稳定；王学伟等【1 1 6 】利用自制的酶柱反应器，通过改变反应液流量、 溶剂的种类、反应时间，考察了大豆油制备生物柴油的工艺条件，并用气相色谱 对产物进行了分析。结果表明，反应液流量和水含量对转化率影响比较大，转化 率随反应液流量的增加出现先增后减的趋势，采用正己烷为溶剂要优于其它溶 剂。 国内，华南理工大学和北京化工大学等也在研究用酶催化制备生物柴油的技 术，其中，华南理工大学已申请专利( 公开号：c n l 4 5 3 3 3 2 a ) 。该方法以廉价 油为原料，以脂肪酶和微生物细胞为催化剂，采用3 - 4 级固定床酶反应器进行连 续转酯化反应，可简化原料处理及产品回收工艺、降低反应温度、避免催化剂对 反应副产品甘油的污染，无污染排放。另外，清华大学针对甲醇对脂肪酶的毒性，。 问题，研究采用短链脂肪酸甲酯代替甲醇进行酯交换制备生物柴油，已申请专利 ( 公开号c n l 4 3 6 8 3 4 a 和c n l 4 7 2 2 8 0 a ) 酶法合成生物柴油具有条件温和，醇用量小、无污染排放的优点。另外，用 脂肪酶作为催化剂制备生物柴油，反应过程不受原料中水和游离酸的影响，采用 生物酶作催化剂，提高其活性和防止酶中毒是关键所在。生物酶法合成生物柴油， 即用动物油脂和低碳醇通过脂肪酶进行转酯化反应，制备相应的脂肪酸甲酯及乙 酯。用发酵法( 酶) 制造生物柴油，反应物中的游离脂肪酸和水对酶催化剂没有影 响，反应液静置后，脂肪酸甲酯即可分离。 脂肪酶固定化技术在工业规模生产中极具吸引力，因其具有稳定性高，可重 复使用，保留酶活性，并有获得超活性的可能，容易从产品中分离等的优点。但 利用酶法制备生物柴油目前存在着一些亟待解决的问题，如反应物甲醇容易导致 酶失活、副产物甘油影响酶反应活性及稳定性、酶的使用寿命过短等，因此酶法 生产生物柴油商业化的主要瓶颈就是酶的成本太高。 1 4 酶催化动力学的研究意义及其应用 化学动力学是用数学方程来定量描述化学反应过程的一种方法。通过化学动 9 第一章前言 力学的研究，可以知道如何控制反应条件，以提高主反应速率，增加生物柴油的 产量：如何抑制或减慢副反应的速度，以减少原料的消耗，减轻分离操作的负担， 并提高反应的产量。而且通过反应速率的定量研究，还可以对生物柴油的工业进 行最佳设计，为最佳控制提供理论基础。 在基础理论上，酶动力学研究是了解酶作用机理的重要途径之一。例如酶所 作用的底物与酶的哪些功能基团结合、酶蛋白中与催化作用直接有关的基团数 目、它们的性质以及底物转变为产物的过程等，都可以依据动力学的实验进行初 步的判断。从酶动力学研究中可以推导出一些颇有希望和吸引力的模型及其动力 学方程。这些模型和方程往往能比较准确地告诉我们某个反应系统中，所有的配 体是如何相互作用而影响反应速度的【1 1 7 1 。 酶反应动力学的研究对生产实践和基础理论都有广泛的应用。例如，轻工业 部门中涉及生物产品加工的酿造业、制革业、食品加工业等无不应用酶制剂，凡 是应用酶制剂的于生产的行业，为了确定最有效的反应系统、反应条件和反应器， 都要解决如何能以最少量的酶、最短的反应时间完成最大量的反应；为了建立一 个适宜的酶分析体系，以期能获得准确可靠的结果；为了筛选出理想的药物或毒 物，以期能专一而有力地达到治疗疾病和杀灭虫害的目的，这些都需要以酶反应 动力学知识为依据。此外，酶反应动力学的研究也是探讨酶反应历程、酶的作用 机制、阐明代谢过程、代谢调控的重要手段。 1 0 第二章理论部分 第二章理论部分 2 1 酯交换反应【1 1 8 】 酯交换法是指动植物油中的脂肪酸甘油三酯与低分子醇( 如甲醇) 发生酯交 换反应，使脂肪酸甘油三酯转化为脂肪酸单酯，成为生物柴油，从而达到降低其 分子量、改善其性能的目的。主要反应式可以表示为： 严卸k彳h h k 弧 e 丑 o o c l k + 3 r o f ! 帚= 毒吐p l i _ o h + r 2 c o o r l l i c 。e , - - o o c r , c h , 田hr ，c o o r 也有人认为它的反应是由连续三个可逆反应组成，就是认为每一步的反应都 会生成一种酯。 p 珈凡c 1 卜明 s h - d 0 0 c i t 2 + r o t i 搴= ；皇车嗣| _ 0 0 c r l + r lc o o r i l c 屿i ) o c i l |c h 2 - 0 0 c 飓 亍如枷h严川h f 肛0 0 吨佣耐f 肌叩嗍 c 一0 0 c r ，