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具有识另i jd n a 功能及催化水解活性的 过渡金属配合物的研究 摘要 桥联多核结构广泛存在于生物体中金属蛋白和金属酶的活性部位，它们对生 物体的生理和催化作用有着至关重要的影响。设计、合成结构新颖的具有抗肿瘤 活性和高效催化活性的功能配合物是配位化学和药物化学领域最富有挑战性的 课题之一。本论文从设计、合成具有抗肿瘤活性和高效催化活性的功能配合物出 发，围绕草酰胺桥联的多核配合物的合成、结构以及它们与d n a 之间的相互作 用、抗肿瘤作用、催化b n p p 水解等进行了比较深入的研究。本论文主要包括以 下三个方面的工作： ( 一) 合成了两种新的不对称双取代草酰胺配体( h 2 d m h e o x 、h 3 d m o x b a ) ， 并以它们和对称的草酰胺单核配体c u ( o x e n ) 、c u ( o x p n ) 为主要的构筑单元，辅以 其它的端基配体，通过改变抗衡阴离子、溶剂、p h 等条件定向合成了 c u ( b p y ) 2 ( c h 3 0 h ) 】。( p i c h( 1 ) 、 【c u ( m e 2 b p y ) 2 ( h 2 0 ) 。( p i e ) 2 ( 2 ) c u 2 ( o x p n ) ( r i i e ) 2 ( c h 3 0 h ) 2 】0 ) 、【c u 2 ( o x p n ) ( b p y ) ( p i c ) ( h 2 0 ) ( p i c )( 4 ) 、 c u 2 ( o x p n ) ( m e 2 b p y ) ( p i c ) ( p i c )( 5 ) 、【c u 4 ( d m o x b a ) 2 ( b p y ) 2 。( c 1 0 4 ) 2( 6 ) 、 c u 4 ( d m o x b a ) 2 ( p h e n ) e 。( n 0 3 h ( c h 3 0 h ) 2 ( 7 ) 、【c u 4 ( d m o x b a ) 2 ( m e 2 b p y ) 2 。( c 1 0 4 ) 2 ( 8 ) 、 c u ( h 2 0 x e n ) c u ( o x e n ) n n c l 0 4 ( 9 ) 和 c u e ( d m e o x ) r t l ，1 - n 3 n ( 1 0 ) 十个配合物，通过元 素分析、红外光谱、紫外光谱对配体和配合物的组成进行了分析和表征。并通过 x r a y 解析了以上十个配合物的晶体结构。 ( 二) 对所合成的配合物采用滤纸片法和液体培养基稀释法研究了它们对 几种常见菌的杀菌活性。初步研究表明，一些多核配合物表现出较强的杀菌活性， 为发掘和利用多核配合物的新功能提供了有用的信息，也为进一步探讨此类体系 的杀菌机理提供了丰富的素材。运用s r b 法配合物应用s m m c 7 7 2 1 和a 5 4 9 进行 体外抗肿瘤毒性试验，其中配合物( 9 ) 具有一定的抑制细胞增殖的作用。利用荧 光法、紫外光谱法、电化学方法和粘度法研究了自由配体、单核配合物配体以及 以上合成的配合物与d n a 之间的相互作用方式，实验结果表明：双核配合物、 四核配合物以及单核配合物与d n a 存在插入结合方式，而自由配体、单核配合 物配体以及配位聚合物与d n a 之间的相互作用为沟槽作用或者静电作用，为抗 癌抑瘤药物先导物的设计、合成提供了有一定的理论指导。 ( 三) 本论文以具有确定结构的含有配位水的配位聚合物为基础，以它们作 为模拟水解酶的模拟酶模型化合物，研究了它们对磷酸二酯( b n p p ) 水解反应得 催化作用，取得了一定的成果。分别从温度、溶液p h 值、底物( b n p p ) 浓度三个 方面考察了它们催化磷酸二酯b n p p 水解的表观速率常数的变化，结果表明三个 配合物均对催化水解b n p p 具有良好的效果( 恕达到了1 0 4 ) ，其中锰配合物对温度 最敏感，在同样的条件下，锰配合物水解b n p p 的表观速率常数最大。而且在我 们研究的p h 值范围内，配位聚合物催化磷酸二酯水解时相邻的金属离子产生协 同作用的，初步建立了配位聚合物催化b n p p 水解的模型。 关键词：草酰胺；桥联多核配合物；晶体结构；模拟水解酶；b 胛p ；d n a 相互 作用；抗肿瘤活性 s t u d i e so nt r a n s i t i o nm e t a lc o m p l e x e sw i t hf u n c t i o n a l r e c o g n i t i o nd n a a n dc a t a l y t i ca c t i v i t y a b s t r a c t b r i d g e dp o l y n u c l e a r s t r u c t u r ee x i s t sw i d e l yi nt h ea c t i v es i t e so ft h e m e t a l l o p r o t e i na n dm e t a u o e n z y m ei no r g a n i s m st h a tm a k e sag r e a ti m p a c to nt h e i r p h y s i o l o g ya n dc a t a l y s i s t h ed e s i g na n ds y n t h e s i so fn o v e lf u n c t i o n a lc o o r d i n a t i o n c o m p o u n d sw i t ha n t i t u m o ra c t i v i t y o rh i 曲c a t a l y t i ca c t i v i t yr e m a i na ne l u s i v e s c i e n t i f i cc h a l l e n g ei nt h ef i e l d so fc o o r d i n a t i o nc h e m i s t r ya n dm e d i c i n a lc h e m i s t r y i nt h i sd i s s e r t a t i o n , t h es y n t h e s i s ，c r y s t a ls t r u c t u r e ，d n ab i n d i n ga c t i v i t i e s ，a n t i t u m o r a c t i v i t i e sa n dc a t a l y t i ca c t i v i t i e so fo x a m i d o - b r i d g e dp o l y n u c l e a rc o m p l e x e sh a v e b e e ns t u d i e di n - d e p t h l y t h i sd i s s e r t a t i o nc o n s i s t so ft h r e es e c t i o n sa sf o l l o w s ： 1 ，t w on o v e ld i s s y m m e t r i c a lo x a m i d el i g a n d s ，h 2 d m h e o xa n dh 3 d m o x b a , h a v e b e e ns y n t h e s i z e da n dc h a r a c t e r i z e db ye l e m e n t a la n a l y s i s ，i r , 1 hn m r t e nm e t a l c o m p l e x e s ：【c u ( b p y ) 2 ( c h 3 0 h ) 】( p i c h ( 1 ) ， c u ( m e 2 b p y ) 2 ( h 2 0 ) 。( p i c ) 2 ( 2 ) ， c u 2 ( o x p n ) ( p i c h ( c h 3 0 h ) 2 】 【c u 2 ( o x p n ) ( m e 2 b p y ) ( p i c ) ( p i c ) 【c u e ( o x p n ) ( b p y ) ( p i c ) ( h 2 0 ) ( p i c ) c u 4 ( d m o x b a ) 2 ( b p y ) 2 。( c 1 0 4 ) 2 ( 4 ) ， ( d ， c u 4 ( d m o x b a ) 2 ( p h e n ) 2 。( n 0 3 h 。( c h 3 0 h ) 2 ( 7 ) ， c u 4 ( d m o x b a ) 2 ( m e 2 b p y ) 2 。( c 1 0 4 ) 2 ( 8 ) ， 【c u ( h 2 0 x e n ) c u ( o x e n ) n n c l 0 4 ( 9 ) a n d c u 2 ( d m e o x ) l x l ，l - n 3 n ( 1 0 ) ，h a v e b e e n s y n t h e s i z e da n dc h a r a c t e r i z e db yx r a ys i n g l ec r y s t a ld i f f r a c t i o n ，e l e m e n t a la n a l y s i s ， i rs p e c t r aa n du v - v i ss p e c t r a 2 ，m o s to fc o m p l e x e sd i s p l a ys i g n i f i c a n ta n t i b a c t e r i a la c t i v i t i e sa g a i n s tb a c i l l u s s u b t i l i s ，e sc h e r i c h i ac o l ia n ds t a ph y l o c o c c u sai g f e u s m e a n w h i l e ，c o m p a r a t i v e a n t i t u m o u ra c t i v i t i e so fc o m p l e x e sw e r et e s t e db ys r bm e t h o d s t h er e s u l t ss h o w t h a tt h ei n h i b i t o r yr a t i o so fc o m p l e x ( 9 ) a g a i n s tt h et e s t e ds m m c - 7 7 2 1a n da 5 4 9 t u m o rc e l l sw e r eh i g h e rt h a no t h e r s f u r t h e r m o r e ，w ei n v e s t i g a t et h ei n t e r a c t i o n so f c o m p l e x e sw i t hh e r r i n gs p e r md n a ( h s - d n a ) t h e i n t e r a c t i o n sb e t w e e nc o m p l e x e s w i t hh s - d n ah a v eb e e ns t u d i e db yu va b s o r p t i o nt i t r a t i o n ，f l u o r e s c e n c et i t r a t i o n ， e l e c t r o c h e m i c a lt e c h n i q u e sa n dv i s c o s i t ym e a s u r e m e n t s t h er e s u l t ss h o wt h a tm o s to f t h ec o m p l e x e sb i n dt oh s - d n av i ai n t e r c a l a t i v em o d e 3 ，c o o r d i n a t i o np o l y m e r s 、i t hc o o r d i n a t e dw a t e rm o l e c u l e su s e da st h em i m i c so f h y d r o l a s eh a v eb e e ns t u d i e dr e s p e c t i v e l y i nc a t a l y z i n gt h ep h o s p h a t i cd i e s t e r h y d r o l y s i s t h er e s u l t ss h o wt h a tt h eb n p ph y d r o l y s i sc a t a l y z e db yt h ec o o r d i n a t i o n p o l y m e ro b e yt h em e c h a n i s mo ft h em e t a l - i o nc o o r d i n a t i o ne f f e c t f u r t h e r m o r e ，t h e m o d e lo fc o o r d i n a t i o np o l y m e rc a t a l y z i n gb n p pw a sb u i l tp r i m a r i l y k e y w o r d s ：o x a m i d o - b r i d g e ，b r i d g e dp o l y n u e l e a rc o m p l e x ，c r y s t a ls t r u c t u r e , m i m i cp h o s p h o e s t e r a s e ，b n p p , d n ai n t e r a c t i o n ，a n t i t u m o ra c t i v i t y 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得 洼! 垫塑直墓丝噩噩堑别直盟的：奎拦亘窒2 或其他教育机构的学位或证书使 用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：苏嚷a 兰签字日期：钟多月厂日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人 授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用 影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同时授权中国科学技术信息 研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库，并通过网络向社会公 众提供信息服务。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名： 7 莱砂兰 签字日期：z 晚穆年多月厂e t 导师签字： 签字日期：缔月j 日 中国海洋大学博士学位论文 第一章前言 核酸是生物体的重要组成物质，它包含了遗传信息，并参与这些信息在细胞内的 表达，从而促进新陈代谢过程并控制这一过程。由于核酸介入生物的生长、发育和繁 荣等正常活动，并与致癌等生命异常情况也密切相关，因此研究核酸，尤其是d n a 的结构和功能的关系，将有助于人们从分子水平上理解生命现象的本质。人们为了能 够从基因水平上理解某些疾病的发病机理，并通过分子设计来寻求有效的治疗药物， 常常将d n a 作为药物设计很重要的作用靶之一。人们通过研究金属配合物与d n a 的 反应，探讨金属配合物与d n a 作用的反应机理，探索d n a 的结构和构象，进而弄清 金属配合物的分子结构和与d n a 反应机理之间的关系，以期为设计合成出具有应用 前景的低毒、高效的抗肿瘤药物提供可靠的理论依据。 随着对生命复杂体系及生命过程本质认识的不断深入，人们发现桥联多核配合物 广泛存在于金属蛋白和金属酶的活性部位，很多金属蛋白和金属酶中金属离子不仅参 与了金属的储存与转移、载氧及酶催化等重要的生命活动，而且这些顺磁离子由于电 子传递而产生的磁相互作用对生物体的生理和催化作用有重要的影响【l 。5 】。例如：大 量研究已证实血蓝蛋白m 锄o c y a l l j l l ) 和酪氨酸酶( t y r o s i n a s e ) 的活性部位均含有反铁磁 偶合的双核铜单元f 5 期；氧载体蚯蚓血红蛋白( h r ) 、r n a 还原酶、甲烷单氧合酶中均存 在双核铁偶合单元【7 d 1 】；而且随着人们对生物体内部活性部位认识的不断加深，还发 现细胞色素氧化酶( c y t o c h r o m eo x i d a s e ) 的活性部位包含反铁磁偶合的c u l l f e 儿1 ( 高自 旋) 异双金属中心【1 2 】；超氧化物歧化酶中( s u p e r o x i d ed i s m u t a s e ) 含有c u ( i i ) , z n ( 1 i ) 的配位 结构【1 3 1 ；在含锰过氧化氢酶( c a t a l a s e ) 【1 4 15 1 、含锰核糖核苷酸还原酶( r i b o n u c l e o t i d e r e d u c t a s e ) 等活性部位存在着多核锰的配位结构【1 6 】。图1 1 为氧络血蓝蛋白的活性中心 结构，图1 2 为超氧化物歧化酶中的c u 2 、z n 2 s o d 活性部位。 所谓酶的活性中心是指酶分子中结合底物并催化底物转变为产物的区域，是进行 电子转移、键合外来分子的位点。同时大量酶的活性部位也可以看成是以金属元素为 中心，有机物作为骨架使金属置于必需构象的位置。它的成键方式、配位环境和空间 结构与配位化合物极为类似，因此应用配位化学的基本理论，通过研究这些体系中偶 合中心的磁性和光谱特性来认识生物体内偶合中心的相互作用、催化机理以及磁一结 具有识另j d n a 功能及催化水解活性的过渡金属配合物的研究 构相关性等，不仅对于揭示生命过程的本质有重要的理论意义，而且对人工模拟以及 分子生物工程的实施、药物研究和生物功能材料的研制具有广阔的应用前景。围绕这 一研究方向，美、法、日本等一批国外优秀学者在这方面做出了许多有价值与开创性 的工作 2 - 7 , 1 7 。近年来，这方面的研究越来越引起人们的广泛关注。从1 9 8 6 年开始每 年召开一次“金属在生物体内 的国际会议。其中最引人注目的是1 9 9 5 年9 月在德国 召开的第七次生物无机化学国际会议上各国科学家专门就关于双核金属酶活性的结 构、性质、功能等展开了深入的研究与讨论【l 引。然而，由于生物体的庞大以及对金属 离子间的磁相互作用的影响比较复杂，目前对于生物体本身，甚至模型化合物的磁性 机理的解释仍有相当的难度【1 9 】。因此，设计、合成金属酶和金属蛋白的模型化合物仍 然是极富挑战性的前沿课题【2 0 l 。 h 2 0 i - h 2 0 图1 1 1 脱氧核糖核酸( a n a ) 图1 2 d n a 是由大量脱氧核糖核苷酸组成的大分子，其中的戊糖和磷酸基起着结构的 作用，而碱基则起着携带遗传信息的作用。图1 3 显示组成d n a 的四种核糖核苷酸单 体。它们分别是：5 腺嘌呤脱氧核糖核苷酸( d a m p ) 、5 鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸 ( d g m p ) 、5 。胞嘧啶脱氧核糖核苷酸( d c m p ) 和5 胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸( d t m p ) 。其 中腺嘧啶与胸腺嘧啶( 或尿嘧啶) 成对，而鸟嘌呤与胞嘧啶成对。这种专一的碱基配对 方式被称为w a s t s o n c r i c k 碱基配对( 即碱基互补原则) ，以纪念1 9 5 3 年英国剑桥大学的 j a m e sw a t s o n 和f r a n c i sc r i c k 对它的发现。还有一种另外的配位方式称为h o o g s t e e n 配 对，其他形式的配对则统称为t e w a t s o n c r i c k 碱基配对【2 。w a s t s o n c r i c k 碱基配对具 有极重要的生物学意义。d n a 复制、转录、反转录等的分子基础都是此原则。 2 中国海洋大学博士学位论文 o 5 一腺嘌呤脱氧核糖核苷酸 5 l 鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸 5 - _ 胞嘧啶脱氧核糖核苷酸5 一胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸 图1 3 组成d n a 的四种脱氧核糖核苷酸 n h 2 核酸的结构可分为一级结构和空间结构。一级结构是指核酸的各核苷酸之间的连 接情况及核苷酸的顺序，而空间结构则多指核苷酸链内或链与链之间通过氢键折叠而 成的结构。空间结构又可分为二级结构和三级结构。 d n a 的一级结构( 图1 _ 4 ) 是指各核苷酸之间通过3 5 磷酸二酯键相连构成的骨架。 核苷酸的排列顺序对每一种d n a 来说都是独特的。因此d n a 的一级结构是d n a 的生 物学功能的基础，并且具有种属特异性。d n a 的链是有极性的。链的一端是一个 5 - o h ，另一端是一个未与其它核苷酸相连的3 o h 。按照惯例，碱基顺序是沿着5 - 3 方向书写的。 w a t s o n 矛l ：l c r i c k 两人在1 9 5 3 年提出的d n a 分子双螺旋结构模型在分子生物学发展 上具有划时代的贡献，为生物学和分子遗传学的发展奠定了基础。由于当时还不可能 获得d n a 分子结晶，w a t s o n 和c r i c k 所用的资料仅来自在相对湿度为9 2 时所得到的 d n a 钠盐纤维。这种d n a 称为b 型d n a ( b d n a ) 。根据w a t s o n 和c r i c k 所提出的模型( 图 1 5 ) ，b d n a 具有以下特性： 具有识另j d n a 功能及催化水解活性的过渡金属配合物的研究 h 罱 菩冉 。哼硒q o 节曲碍 h 蠢三 0 a 。、 彻 p a p e p t p g 1 屯- c - - t g r e ) 。 ( a ) - d n a 核苷酸链的一个小片段；c o ) 一为线条式缩写：( c ) 一为文字式缩写 图i - 4d n a 中核苷酸链的一小片段及缩写符号 ， 磺醇盛锌- i 的 鞋羹哞的c 和n n l p 小沟 图1 5b 型d n a 分子双螺旋结构模型( a ) 及其图解( b ) ( a ) 两条反向平行的多核苷酸围绕同一中心轴相互缠绕； ( b ) 嘌呤与嘧啶碱位于双螺旋的内侧。磷酸与核糖在外侧，彼此通过3 5 一磷酸二 4 爹，一 磐”黟瓿t叫鹾。_：。一嘛。 磐。、”_l； 中国海洋大学博士学位论文 酯键相连接，形成d n a 分子的骨架。碱基平面与纵轴垂直，糖环的平面则与纵轴平 行。多核苷酸链的方向取决于核苷酸间磷酸二酯键之间的走向。习惯上以3 _ 5 为正 向。两条链均为右手螺旋。双螺旋结构上有二条螺形凹沟，一条较深，一条较浅。较 深的沟称为大沟( m a j o rg r o o v e ) ，较浅的称为小沟( m i n o rg r o o v e ) 。大沟和小沟中各官能 团的分布有利于蛋白酶、金属离子以及具有生物功能的金属配合物与d n a 的作用。 ( c ) 两条核苷酸链依靠彼此碱基之间形成的氢键相联系而结合在一起。根据分子 模型的计算，一条链上的嘌呤碱必须与另一条链上的嘧啶碱相匹配，其距离才正好与 双螺旋的直径相吻合。碱基之间形成的氢键，根据对碱基构象研究的结果，a 只能与 t 相配对，形成两个氢键；g 与c 相配对，形成三个氢键。所以g c 之间的连接较为稳 定。根据碱基互补原则，当一条多核苷酸的序列被确定以后，即可推知另一条互补链 的序列。 维持d n a 双螺旋结构的主要作用力是碱基堆积力( b a s es t a c k i n gf o r c e s ) 。它是由芳 香族碱基的7 c 电子相互作用引起的。d n a 分子中碱基层层堆积，在分子内部形成了一 个疏水环境，从而促使互补碱基之间形成氢键。第二种力是互补碱基对之间的氢键， 虽然它在使碱基形成特异配对这一特点上十分重要，但氢键的能量不大。第三种力是 磷酸残基上的负电荷与介质中的k + 、n a + 、m n 2 + 等阳离子之间形成的离子键。由于生 理p h 条件下，d n a 带有大量负电荷，如果没有阳离子与它成键，由于自身不同部位 的负电荷的斥力作用，将使d n a 不稳定【2 引。 众所周知，w a t s o n 和c r i c k 提出的d n a 双螺旋二级结构给分子生物学带来希望之 光，但是，他们提出的d n a 主链形成右手螺旋的假设即b d n a 一直没有得到有力地 证明，为此也曾在国际上存在过一系列争论。1 9 7 9 年美国麻省理工学院a r i c k 人工合 成的d n a d 、片段的晶体时，出乎意料的发现d ( c g c g c g ) 2 的d n a 链是左手螺旋结构 的，并进一步提出自然界的核酸也存在左手螺旋的假设。由于左手螺旋d n a 中磷原 子的联结成锯齿形，故起名z - d n a 。后来人们从鼠、兔血中证实了确有z - d n a 存在， 才使人们普遍接受生物体中绝大部分d n a 为b d n a ，也有少部分以z - d n a 存在， b d n a 和z - d n a 之间存在平衡状态。目前，从天然及合成的核酸x 射线衍射分析中还 发现有a d n a 、h - d n a 、c - d n a 、d d n a 等构象。尽管它们都为双螺旋，但它们的 结构却有明显的不同。a d n a 也是w a t s o n 和c r i c k 碱基配对双螺旋，不过比召一d n a 短 而粗。z o d n a 的这种双螺旋结构中，两条含有六个核苷酸分子的链以反方向的形式排 具有识别d n a 功能及催化水解活性的过渡金属配合物的研究 列着，其间互补的g c 碱基对以氢键相连接，相邻碱基对互相平行，这些性质基本上 与右旋d n a 的结构性质一样，所不同的是双链的旋转方向相反，而且磷原子之间的 联结线成锯齿形。其次还存在十字形d n a ( 如图1 6 所示) 。 a - d n ab - d n az - d n a 十字形 图1 石d n a 的几种类型 z - d n a 的发现能解释许多特征生命现象，立即引起世界各国科学家的高度重视。 由于b - d n a 的碱基位于螺旋的内侧，是疏水性的，而由磷酸二酯键形成的多聚核苷酸 主链位于外侧，是亲水性的，而与它不同的是，z - d n a 中碱基g ( 鸟嘌呤) 的c - 8 和n 7 暴露在双螺旋的外侧，受保护程度小，容易受化学致癌剂的攻击而引起化学反应，因 此，z - d n a 可能与突变、基因表达以及调控有关。 n o r d h e i m 等报道产生于肝癌的黄曲霉素b 1 有强烈的阻碍形成b - d n a 的作用。还 有报道说2 乙酰基荧光素能与碱基a ( 腺嘌呤) 的8 位上的碳结合，使d n a 从b 构型变为z 构型。最近又有报道证明一些致癌物( c a r c i n o g e n ) 能从嘌呤的n - 7 或胞嘧啶的c 5 位甲基 化而破坏了岳d n a 与z - d n a 之间的平衡，导致转录异常发生细胞癌变。由此人们开 始把某些癌症等病因归结为二级结构转型。目前，国内外的学者普遍接受二级结构的 转型主要是由一级结构中核苷酸顺序决定的。一级结构的测定目前已有较可靠的方 法。 6 中国海洋大学博士学位论文 2 金属配合物与d n a 2 _ 问的相互作用 8 0 年代初，美国的b a r t o n 在研究金属配合物与d n a 作用时发现，某些r u 2 + 和c 0 3 + 的八面体手性配合物具有识另i j d n a - - 级结构的能力，从而发展了一种能识别b 型和z 型d n a 的手性配合物探针，为生物无机开辟了一个新的研究领域【2 3 3 阳。近年来，金 属配合物与d n a 键合的研究正引起人们的重视。小分子与d n a 键合常会诱发许多生 物效应，如阿霉素和柔红霉素分子的芳基部分嵌入d n a 碱基对之间，水合顺铂和d n a 链上的鸟嘌呤基配位而使它们具有抗癌作用。所以，研究金属配合物与d n a 的相互 作用，了解金属配合物与d n a 作用的模式，在此基础上，通过研究金属配合物的抗 肿瘤活性和其与d n a 作用模式之间的关系，来寻求一种通过化学方法对抗肿瘤药物 进行初步筛选的方法。 2 1 配合物与d n a 结合的三种主要方式 一般来说，配合物与d n a 的结合按照化学键来划分主要有共价键和非共价键两 种，其中非共价键对了解金属配合物的抗肿瘤活性和其与d n a 作用模式之间的关系 起着非常重要的作用，它主要包括以下三种方式( 如图1 7 所示) ： ( a ) 静电作用( e x t e r n a le l e c t r o s t a t i c ) 核酸是一种带负电荷的多聚阴离子，通常以钠盐形式存在。金属离子及许多配合 物带有正电荷，因此它们可以与核酸在外层通过静电发生作用； ( b ) 沟槽作用( g r o o v e ) 配合物结合在d n a 的沟面，主要靠碱基疏水起稳定作用； ( c ) 插入作用( i n t e r c a l a t i o n ) 静电作用沟面作用插入作用 图1 7 配合物与d n a t 共价键结合的三种方式 7 墓墨碧客匡謦 具有识别d n a 功能及催化水解活性的过渡金属配合物的研究 配合物以含有平面芳香杂环的配体插入d n a ，并且与d n a 中的碱基对互相重叠， 通过7 【_ 兀堆积作用相互结合。图1 8 所示为平面分子以插入方式与d n a 链作用后所导 致的d n a 分子的畸变。 ( a )m ) c = 3 d n a 碱薹 - 插入警囱分子 ( a ) 双螺旋d n a 的正常华生一克立克( w a t s o n - c r i c k ) 结构；( b ) 配合物中平面分子 ( b ) 插入d n a 双螺旋链的碱基之间后导致的d n a 的畸变 图1 8 正常d n a 与畸变d n a 示意图 由于已经发现的某些抗癌药的抗癌作用与插入结合有关，而且在d n a 介导的电 子转移研究中插入结合也是一个必不可少的因素，因此在配合物与d n a 结合的三种 方式中插入结合方式最引人注目，并已成为新型药物设计及一些癌症和病毒化疗的理 论基础【3 9 1 。所以研究金属配合物与d n a 的插入作用方式具有很大的现实意义。 值得指出的是，相同的药物与不同构型的d n a 会采取不同的键合方式，例如：口 型的d n a 与配合物结合易于发生插入作用，融型的d n a 与配合物结合则易发生沟面 作用 3 9 - 4 4 。 2 2 配合物与d n a 相互作用的研究方法 配合物与d n a 作用的位点( 大沟或小沟) ，作用的方式( 插入，沟面或静电作用) ， 有无构型选择或碱基序列选择等，需用多种方法加以确定。目前研究这类配合物与 d n a 作用机理的报道很多，大多采用光谱学方法、电化学方法、流体力学方法、热 力学方法等。而对有关配合物插入d n a 的几何构型及位点结合特异性的研究，以上 手段稍显不足，于是一种新型的实验方法1 hn m r 法被应用于此，它揭开了小分子配 合物键合d n a 的新阶段。下面就这些研究方法加以介绍。 8 中国海洋大学博士学位论文 2 2 1 光谱学方法 包括紫外光谱、荧光光谱、圆二色谱( c d ) 、线二色谱( l d ) $ 1 1c a - 色谱( e d ) 等方法。 2 2 1 1 紫外光谱法 电子吸收光谱法是研究配合物与d n a 相互作用的比较直接的一种方法。配合物 与d n a 结合后，其配体所处的环境会发生改变，因此配合物吸收光谱的波长和强度 会发生一系列的变化。一般认为，若配合物与d n a 之间的相互作用为静电或沟槽作 用时，它们的紫外光谱没有明显的变化。当配合物与d n a 以插入作用方式结合时， 通常配合物的紫外吸收峰会发生减色效应，并伴有一定程度的红移p 5 4 9 1 。这是由于插 入配体与d n a 碱基对可发生兀电子堆积，插入配体的死木空轨道与d n a 碱基的兀电子轨 道发生偶合使能级下降，导致胂兀木跃迁能量减少，从而产生红移现象；同时偶合后 的兀掌轨道因部分填充电子，使7 c 一矿跃迁几率减小，产生减色效应，而且减色效应的 程度通常与配合物和d n a 作用的强弱有关。例如配合物 r u c o p y ) 2 p h e n 2 + 、 r u ( b p y ) 2 i p 2 + r u ( b p y ) 2 p i p 2 + 与c t d n a 作用时它们在相同条件下的荷移跃迁峰的 减色率分别为1 2 、1 5 5 和2 1 9 【4 9 】，表明由于配体p i p ( 2 苯基咪唑并【4 ，5 f 】l ，1 0 邻菲罗啉) 插入d n a 的碱基对与碱基g - g 堆积的面积要大于i p ( 4 ，5 - f 1 ，1 0 邻菲罗啉) ，而 i p x 大于p h e n ( 1 ，1 0 - 邻菲罗啉) ，因此以p i p 为配体的 r u ( b p ”2 p i p “配合物的紫外吸收 峰的减色率大于另外两种配合物，也可以说b 韭j r u ( b p y ) e p i p 2 + 配合物与d n a 的插入结 合力最强。 2 212 荧光光谱法 2 2 1 2 1d n 埘配合物发光强度的影响 配合物与d n a 结合后，特别是以插入方式结合后，由于疏水性的大分子d n a 对 配合物的保护作用，可以使得配合物的发光增强【5 m 5 2 1 。比较邻菲咯啉( p h e n ) 、联吡啶 ( b p y ) 与c o ( 1 1 1 ) 形成的配合物的相对发光强度( i i o ，i o 为未加入d n a 时配合物溶液的发 光强度) 随d n a 溶液浓度的变化，可失n p h e n 与c o ( i i i ) 形成的配合物的荧光强度随着 d n a 浓度的增加，先是增大，而后不再随着d n a 浓度的变化而变化。而b p y 与c o ( i i i ) 形成的配合物的荧光强度几乎不随d n a 浓度的增大而改变。显然p h e n 与c o ( i i i ) 形成的 配合物与d n a 插入结合的能力强于b p y 与c o ( 1 1 1 ) 形成的配合物。比较二者的分子平面 9 具有识别d n a 功能及催化水解活性的过渡金属配合物的研究 性、平面面积、疏水性、7 【电子扩展程度等，p h e n 均大于b p y ，故导致t p h e n 对d n a 的插入能力大于b p y 对d n a 的插入能力。由b p y 与c o ( i i i ) 形成的配合物的荧光强度几乎 不随d n a 浓度的增加而变化这一事实，可以认为b p y 几乎没有对d n a 碱基对的插入作 用。 2 2 1 2 2 以溴化乙锭皿b ) 为荧光探针研究配合物d n a - e b 复合体系荧光光谱的影响 溴化乙锭( 如图1 - 9 所示) 是一种具有平面分子结构的能与d n a 双链发生专一插入 作用的荧光染料，具有灵敏度高、选择性好等特点。e b 本身仅有极弱的荧光，与d n a 作用后其生色团可以嵌插入d n a 碱基对中，而导致荧光强度大大增强，依据此现象 e b 可作为研究小分子物质与d n a 作用的荧光探针【5 3 。5 6 】。e b 与d n a 的插入作用方式与 抗癌抗生素如放线菌素d ，博莱梅素的作用方式相同，药物插入d n a 后使d n a 原来的 紧密螺旋松弛，阻碍了d n a 的进一步复制。如果所合成的化合物能与d n a 发生类似 于e b 与d n a 的插入作用，药物就会同e b 竞争与d n a 结合的位点，使d n a e b 复合体 系的荧光减弱，发射峰波长紫移( e b i 由疏水环境进入到水溶液中) ，产生新的荧光峰( 形 成新的d n a 配合物复合体系) 和等电势点，这些变化都是插入结合的特征，反之亦然。 根据d n a e b 复合体系荧光光谱的变化，可初步判断化合物是否与d n a 发生了类似于 e b 的插入作用，据此有可能对其是否具有抗肿瘤活性进行判别，从而实现药物初步 筛选的目的【5 7 巧钔。 图1 - 9 溴化乙锭的结构图 2 2 1 3 线二色谱( l d ) 和d a - - 色谱( e d ) n b r 采用与固定光轴方向( 在流动梯度体系中旋转和外加电场，使d n a 螺旋轴取向固 定) 平行或垂直的平面偏振光，测量键合d n a 后配合物对垂直和平行- 于d n a 轴向线偏 l o 中国海洋大学博士学位论文 振光的不同吸收，计算出配合物与d n a 的相对取向，从而为配合物键合d n a 时提供 键合方向等结构方面的信息【5 9 石2 1 。 2 214 圆二色谱( c d ) 圆二色谱可以检测有无旋光性物质的存在，而且通过测定配合物与双螺旋d n a 作用后的透析液的c d 光谱，可以判断配合物是否与d n a 之间存在着立体选择性的结 合【2 3 1 。用外消旋的配合物与d n a 透析时，和人光学异构体对d n a 的结合能力是不同 的。与d n a 结合能力强的对映体在透析带内，同d n a 立体选择性的结合，从而使得 在透析液中表现出与d n a 结合能力弱的对映体含量逐渐增加，这样透析液就具有了 c d 光学活- 眭 6 3 , 6 4 】。配合物与c t - d n a 和h s - d n a 发生相互作用并透析后，从它们的透 析液的c d 光谱可以看出配合物与d n a 的作用是否具有立体选择性。 2 2 1 5 拉曼光谱 在固体压片的条件下某些配合物具有较强的荧光干扰，导致无法得到配合物的拉 曼光谱。因此一般采用银胶作载体测其拉曼光谱( s e r s ) 。配合物银溶胶体系中加入 d n a 溶液后会出现两种情况【6 5 ，6 6 1 ： ( a ) 如果配合物与d n a 不发生作用，由于s e r s 信号的产生源于配合物与银表面的吸 附，配合物与d n a 存在竞争性吸附，其现象为配合物s e r s 信号大为减弱或仅观察到 d n a 荧光信号。 ( b ) 如果配合物与d n a 发生作用，除了配合物与银溶胶仍存在的吸附现象，在该体系 中配合物存在的作用是：可以抑制d n a 的荧光发射；通过形成配合物d n a 复合 协同吸附，因复合物的形成改变了配合物的分子结构，配合物的s e r s 将发生明显改 变，主要表现为峰位置的较大移动和或出现谱峰强度的明显变化，一些新的散射峰 信号峰也可能会产生。但由于“深埋式”插入的化合物在图谱中呈现类特征，因而在 判断配合物是否与d n a 发生作用时，必须结合配合物的结构及荧光光谱研究的结果 加以证明。 2 2 2 电化学方法 循环伏安法：该法是研究药物与d n a 作用方式的有力工具之一，当配合物分子 具有识另j j d n a 功能及催化水解活性的过渡金属配合物的研究 中存在插入基团，且以插入方式与d n a 结合时，由于配合物的扩散系数大幅度下降， 导致其还原峰电流下降，峰电位的移动也表明，配合物与d n a 分子中带负电荷的磷 酸基团可能存在静电结合。 2 2 3 流体力学方法 在确定小分子化合物与d n a 作用模式方面，流体力学方法( 如测量d n a 的粘度， 沉降速度以及在凝胶中的泳动速度等) 有其独特的应用，该方法被最终用来验证小分 子化合物是否以插入方式与d n a 作用【6 7 ，6 引。 2 2 3 1 粘度测定 在缺少晶体结构数据的情况下，粘度测定被认为是检验配合物与d n a 是否以插 入方式结合的最有效的方法之一。其结果有时比光谱数据更具说服力【6 9 7 3 】，当d n a 溶液中加入配合物分子时d n a 溶液的粘度有以下三种变化： ( a ) 当含有平面芳香环系的小分子化合物( 如e b 等) ，以插入方式进, 入d n a 碱基对时， 配体的插入导致d n a 相邻键的距离变大，因此插入作用会导致d n a 双螺旋链增长， 从而使其d n a 溶液粘度增大： ( b ) 当配合物分子以部分插入方式进入d n a 碱基对时，常会产生d n a 双链的扭结导致 d n a 溶液粘度下降； ( c ) 而当配合物以沟面或静电方式与d n a 作用时，配合物对d n a 链的影响较小，因此 d n a 溶液的粘度变化不大。 据此可判断配合物与d n a 之间不同的键合方式。 2 2 3 2 根据d n a 在凝胶中的不同的泳动速度判断配合物与d n a 的作用方式 超螺旋环状d n a 与配合物作用时，d n a 链的解旋度也常用来判断d n a 与配合物 作用的方式【7 4 彤】。在拓扑异构酶存在下，超螺旋环状d n a 与配合物作用时，由于平 面芳香环的插入导致超螺旋进行解旋，因此不同解旋度的d n a 在凝胶中泳动速度也 不相同，解旋度越大，则泳动速度越小。而以沟面或静电作用结合的化合物，一般不 会导致超螺旋的解旋。 1 2 中国海洋大学博士学位论文 2 2 4n m r 方法 除了单晶x 射线