色谱柱分类与选择-内部培训资料.ppt

一、色谱起源,1906年俄国植物学家Tsweet发现色谱分离现象,2,高效液相色谱仪的分析原理,高效液相色谱仪的结构色谱柱在高效液相色谱仪中的作用和峰形产生原理,高压泵,进样器,检测器,色谱工作站,色谱柱,1Basicprincipleofchromatographicseparation1.1色谱分离基本原理,PartitioncoefficientK分配系数,硅胶颗粒基质合成步骤：1.合成硅胶基质2.键合配体(键合相)3.端基封尾end-capped,以传统方式制造硅胶色谱填料的过程:起始原料为矿物硅酸盐（如泡花碱），即A类硅胶,90年代以后方式：organosilicapolymer有机单晶硅聚合的硅胶，即B类硅胶,填料的端基封尾封口残余硅羟基减少不可逆吸附或拖尾增加碳含量（0.1%-1%）,C18键合并端基封尾后还能看见什么？硅羟基!即使进行高密度键合，硅胶表面仍将残留约50%硅羟基(SiOH)!,单、双、三官能团键合,三官能团键合,二官能团键合,单官能团键合,键合,常用封尾end-capped：三甲基硅氧烷,极性封尾，增加极性保留,HypersilODS即没有封尾HypersilODS-2有封尾,由于空间位阻的存在，键合反应最多只能覆盖50%的硅羟基，超过一半硅羟基是活性硅羟基，与碱性基团会发生离子交换作用，增加了保留，导致峰形拖尾，用短链氯硅烷（如三甲基氯硅烷）键合活性的硅羟基，可以减小这种影响，这种操作被称为封尾，封端，封口。,封尾,封尾,空间位阻：异丙基硅氧烷，异丁基硅氧烷,空间位阻,极性嵌入polarembedded,问题：下列色谱柱如何选择？,amidohexadecylsilylsilicagelColumn:size:l=0.25m,=4.6mm;stationaryphase:diisopropylcyanopropylsilylsilicagelforchromatographyR(5m)withaspecificsurfaceareaof180m2/gandaporesizeof8nm;stationaryphase:sphericaloctadecylsilylsilicagelforchromatographyR(5m)withaspecificsurfaceareaof170m2/gandaporesizeof12nm.stationaryphase:aminopropylsilylsilicagelforchromatographyR(5m),stationaryphase:end-cappedoctadecylsilylsilicagelforchromatographyR(5m),stationaryphase:base-deactivatedoctadecylsilylsilicagelforchromatographyR(3m).stationaryphase:octylsilylbase-deactivatedsilicagelforchromatographyR(4m)withaporesizeof6nm,stationaryphase:end-cappedpolar-embeddedoctadecylsilylamorphousorganosilicapolymerR(5m);MobilephaseMix35volumesofacetonitrileRand65volumesofa5.23g/lsolutionofdipotassiumhydrogenphosphateRpreviouslyadjustedtopH7.0withphosphoricacidR.,（答案见备注信息）,以传统方式制造硅胶（A类硅胶）色谱填料的过程:起始原料为矿物硅酸盐（如泡花碱）,Na2SiO3(矿物)+2H+,Si(OH)4(silicicacid)+2Na+,硅胶颗粒(含金属杂质!),C18/C8bonding+endcapping,C18/C8ReversedPhases(最终仍带金属杂质!),与键合相的疏水性作用,双重保留机理:1).与键合相的的疏水性作用;2).与残余硅醇基间的离子交换作用,O-,Si,O-,Si,O,-,O-,Si,O-,Si,O,-,O-,Si,O,-,O-,Si,O-,Si,O-,Si,O,-,O-,Si,O-,Si,O-,Si,O-,Si,OH,O-,Si,O-,Si,OH,O-,Si,OH,O-,Si,O-,Si,O-,Si,OH,O-,Si,O-,Si,当流动相pH值小于3时,硅醇基呈中性(未解离),Base,Base,对碱性化合物的保留及严重拖尾,两实验使用相同的传统C8硅胶柱,离子交换作用,碱性分析物在硅胶柱上的拖尾机理,当流动相为pH6-8时,硅醇基带负电性(大部解离),既然pHmethanolethanolpropanolacetonitrileacetone,三聚氰胺和三聚氰酸同时检测,FDA推荐Zic-HILIC,突破高纯硅胶柱局限性的必要性,硅胶柱pH适用极限,0,10,20,30,40,0,1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,k,pH,硅醇基解离,带负电荷,硅醇基未解离,碱性化合物具良好峰形但保留不足,对碱性化合物的保留增强,但需严格控制流动相pH值。封端不佳的反相柱会面临峰拖尾的问题。,硅醇基完全解离,硅胶基体逐步溶解！,碱性化合物呈中性，保留强,峰性佳。,需要全新的柱技术,宽pH值色谱柱突破硅胶柱应用禁区的有力手段,优点,缺点,无机基质(C18硅胶),机械强度高柱效高保留稳定,有限的pH应用范围对碱性分析物拖尾化学不稳定性,有机基质(高聚物),很宽的pH应用范围无离子型作用化学稳定性好,机械强度不佳柱效低保留行为难以预测,宽pH值色谱柱,宽pH值色谱柱的几种类型,双齿键合，Agilent,四乙氧基硅烷(TEOS),硅甲基嵌入型聚乙氧基硅烷(MPEOS),甲基三乙氧基硅烷(MTEOS),Waters专利技术荣获2000年全球R60%BInjectionvolume:10LTemperature:30oCDetection:UV230nmInstrument:AllianceTM2690,996PDA,1.p-Toluamide2.Lidocaine3.Ibuprofen,Grumbach,Diehl,Column:XTerraRP184.6x100mm,5mMobilePhaseA:20mMAmmoniumAcetate(pH5.0to5.8)or20mMAmmoniumBicarbonate(pH6.8to7.0)MobilePhaseB:ACNFlowRate:0.5mL/minIsocraticMobilePhaseComposition:40%A;60%BInjectionvolume:10LTemperature:30oCDetection:UV230nmInstrument:AllianceTM2690,996PDA,分析方法对pH敏感度的测试-糟糕的结果,分析方法对pH敏感度的测试-优异的结果,杂化颗粒柱对创建稳定可靠的HPLC分析方法的独特价值,Note:ColumnParticle,Temperatureand%OrganicHeldConstant,0.1,1,10,100,0,2,4,6,8,10,12,14,pH,k,Acetaminophen,Ibuprofen,Nortriptyline,Lidocaine,Doxepin,Imipramine,p-Toluamide,MobilePhase:35%MeCN,65%20mMBuffer,硅胶柱,Xterra4.6x50mm3.5m.柱温：30C.流速:2.0mL/min.检测:254nm.进样体积:20l.运行时间:20min.流动相:A:100mM甲酸铵pH3.64.B:水;C:甲醇样品浓度:20g/mL,Time(min)%A%B%C010900110504031046441010464411109001510900,TriamtereneChlorthalidoneAlthiazideFurosamideBenzthiazideProbenecidEthacrynicacidBumetanideCanrenoicacid,Wagrowski,Tran,利尿剂分离,样品复杂：样品中含有9种化合物基于起始梯度实验的结果，优化了色谱柱类型，有机相比例及pH平梯度获得最终满意分离结果,pH9.0条件下的溶剂选择性：等度分离条件探索,Wagrowski,Tran,3,5,利尿剂：pH9条件下最终的等度分离条件,流动相:A:乙腈;B:甲醇;C:水;D:100mM甲酸铵,pH9.0等度条件:A:13%(乙腈);B:4%(甲醇);C:73%(水);D:10%(甲酸铵),XTerraMSC184.6x50mm,3.5m,AU,0.00,0.02,0.04,Minutes,0.0,2.0,4.0,6.0,8.0,10.0,12.0,14.0,16.0,1,4,2,3,6,5,9,8,7,1.Triamterene2.Chlorthalidone3.Althiazide4.Furosemide5.Benzthiazide6.Probenecid7.Ethacrynicacid8.Bumetanide9.Canrenoicacid,等度分离利尿剂,碱性pH条件下的峰间隔较小(色谱峰紧密排列)的洗脱状况，使得等度分离成为可能通过溶剂选择性进行微调，最终实现完全分离使用小颗粒短柱(5cm,3.5m)，在pH9可实现色谱峰的完全分离,重要的方法开发为何要从新色谱柱开始？,随使用条件和样品洁净度的不同，多数色谱柱在使用过程中可发生化学污染、表面状态改变、基体材料部分溶解等等潜在变化。此类改变可导致柱内填料的活化或钝化，使其对某些化合物的分离选择性加强或变劣。此类特殊分离选择性常常是无法重复的。在此类旧色谱柱建立起来的方法将无法在新柱和其他旧色谱柱上得以重现，造成未来可能需要重新开发方法或进行大量针对仪器系统、色谱柱和流动相的不必要的诊断工作。,反相色谱柱的选择小结:(1),常规应用现代高纯硅胶色谱柱：优点：峰形好，重现性高，寿命长限制：pH2-8流动相中含有大量水溶液采用AQ技术：优点：在含有大量水溶液（100水溶液）流动相中性能稳定：峰形好,需要使用宽pH值或高温条件如生物碱分离宽pH值色谱柱：pH1-12优点：pH范围宽，高温条件下填料稳定性好，色谱峰形好，寿命长采用质谱检测器:窄内径/小颗粒/短柱,反相色谱柱的选择小结:(2),结语,现代液相