SDS-PAGE操作方法要点.doc

SDS-PAGE教程1 SDS-PAGE原理SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基硫酸钠）， SDS会与变性的多肽，并使蛋白带负电荷，由于多肽结合SDS的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关，因此SDS多肽复合物在丙稀酰胺凝胶电泳中的迁移率只与多肽的大小有关，在达到饱和的状态下，每克多肽可与1.4 g去污剂结合。当分子量在15 KDa到200 KDa之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：log MW = K bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。SDS-PAGE Laemmli法这种方法帖出来，大家是不是感觉非常的陌生呢？其实这种发方法很普遍，现在大部分的实验室都是用Laemmli法跑电泳的。如今实验室中用的最多的蛋白电泳是源于Laemmli于1970年发表在nature上的一篇文章中的方法，这篇文章很特别,不仅被引用的次数较多，而且该篇并不是专门阐述蛋白电泳方法上的提出和改进问题，而是对噬菌体头部包装过程中的蛋白进行分析过程中用到电泳分析方法而已，所以阐述如何操作的文字只有那么一小段（但相当经典），这是SDS-PAGE（不连续系统）的首次成功应用。现在我们在实验室进行的SDS-PAGE试剂的配方仍然是沿用了它的数据,许多论文在描述其SDS-PAGE时引用Laemmli方法，目前常用的具有浓缩胶和分离胶的不连续SDS-PAGE的基础的确来自Laemmli方法，但也略有差别例如一些缓冲液的具体组成。你也许会恍然大悟：原来我们用的就是Laemmli！SDS-PAGE各试剂配制方法30%聚丙烯酰胺溶液-30%（w/v）Acrylamide 【组分浓度】各种组分名称体积(mL)或质量(g)备注30%Acr-Bis(29:1)100 mL实验室配制时用量(100 mL)29% Acrylamide(丙烯酰胺)29 g29.2 g1% BIS(N,N-亚甲丙烯酰胺)1 g0.8 g【配制方法】将29克丙烯酰胺和1克N,N-亚甲丙烯酰胺溶于总体积为60ml温热（37左右）的去离子水中，充分搅拌溶解，补加水至终体积为100ml。0.45m微孔滤膜过滤除菌和杂质，储于棕色瓶，4避光（用铝箔纸包扎起来）保存。严格核实pH不得超过7.0，因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化的。使用期不得超过两个月，隔几个月须重新配制。如有沉淀，可以过滤。【保存条件】4避光（用铝箔纸包扎起来）保存【注意事项】丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可通过皮肤吸收，其作用具有累积性。称量丙烯酰胺和N,N-亚甲丙烯酰胺时应戴手套和面具。可认为聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作，因为它还可能含有少量未聚合材料。1 M Tris-HCl（pH6.8）(浓缩胶buffer)【组分浓度】1 M Tris-HCl名称用量备注Tris12.1g去离子水80ml浓盐酸9ml(36%的浓盐酸)预实验已确定去离子水加入去离子水定容至100ml后，室温保存【配制方法】称量12.1 g Tris碱溶于80 mL的去离子水，充分搅拌溶解，加约9 mL的浓HCl调节至所需要的pH值，将溶液定容至100 mL，高温高压灭菌后，室温保存。应使溶液冷却至室温后再调定pH值，因为Tris溶液的pH值随温度的变化差异很大，温度每升高1，溶液的pH值大约降低0.03个单位。【保存条件】室温保存。【注意事项】对人体有刺激性，请注意适当防护。1.5 M Tris-HCl（pH 8.8）(分离胶buffer)【组分浓度】1.5 M Tris-HCl名称用量备注Tris18.17 g去离子水80 mL浓盐酸3 mL(36%的浓盐酸)预实验已确定去离子水加入去离子水定容至100 mL后，室温保存【配制方法】100 mL称量18.17 g Tris碱溶于80 mL的去离子水中，充分搅拌溶解，加约3 mL浓HCl调节至所需要的pH值，将溶液定容至100 mL，高温高压灭菌后，室温保存。【保存条件】室温保存【注意事项】应使溶液冷却至室温后再调定pH值，因为Tris溶液的pH值随温度的变化差异很大，温度每升高1，溶液的pH值大约降低0.03个单位。10% 十二烷基硫酸钠SDS溶液-10%(w/v)SDS 【组分浓度】10% (w/v) SDS名称用量备注SDS1 g去离子水8 mL加入去离子水定容至10 ml后，室温保存【配制方法】称取2 g高纯度的SDS置于100200 mL烧杯中，加入约16 mL的去离子水，于68 加热溶解，滴加浓盐酸调节pH至7.2，定容至20mL后，室温保存。【保存条件】室温保存【注意事项】保存条件：4保存。注意事项：易燃，有腐蚀性，请注意防护。易挥发，使用后请盖紧瓶盖。为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。保存条件：4保存。注意事项：易燃，有腐蚀性，请注意防护。易挥发，使用后请盖紧瓶盖。为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套对人体有害，请注意防护。10% 过硫酸铵溶液-10% (w/v) APS【组分浓度】10% (w/v) 过硫酸铵(APS)名称用量备注过硫酸铵0.1 g去离子水1 mL现配现用【配制方法】称取0.1 g过硫酸铵置于1.5 mL离心管，加1 mL去离子水吹打溶解，亦可以加倍，即称取1 g过硫酸铵，加入10 mL的去离子水后搅拌溶解。4 保存。【保存条件】4保存【注意事项】10%过硫酸铵溶液在4保存时，可使用2周左右，超过期限会失去催化作用。5Tris-甘氨酸电泳缓冲液-5Tris-Glycine buffer （SDS-PAGE电泳缓冲液）【组分浓度】各种组分名称配制不同体积所需各成分的体积(mL)或质量(g)1000ml500ml0.125M Tris15.1g1.25M glycine(甘氨酸)94.0g0.5%(W/V)SDS5.0g【配制方法】称取15.1 g Tris，94.0g甘氨酸（glycine），5.0gSDS，用800mL蒸馏水或去离子水溶解，充分搅拌溶解，定容至1000 mL，室温保存。得0.125 mol/L Tris-1.25 mol/L甘氨酸电极缓冲液。临用前稀释5倍。【保存条件】室温保存，两年有效。【注意事项】配制好的电泳液使用时间不宜超过两周。电泳缓冲液可以回收，回收后可再使用1-2次，但为了取得最佳的电泳效果，应使用新电泳液。 5SDS-PAGE加样缓冲液-5SDS-PAGE Loading Buffer 【组分浓度】0.25 M Tris-HCl (pH 6.8)；10% (W/V)SDS；0.5% (W/V) BPB(溴酚蓝)；50% (V/V) 甘油；5% (W/V) -巯基乙醇(2-ME)或0.5 M DTT(二硫苏糖醇)各种组分名称配制用量备注总体积10 mL1 M Tris-HCl (pH 6.8)2.5 mLSDS1 gBPB(溴酚蓝)50 mg甘油5 mL（0.5 mL/份）分装，室温保存，使用前加25 L 2-ME/小份，保存一个月左右。-巯基乙醇(2-ME) 0.5 mL【配制方法】量取1.25 mL 1 M Tris-HCl（pH 6.8），0.5 g SDS，25 mg BPB，2.5 mL甘油，置于10 mL塑料离心管中，加去离子水溶解后，定容至5 mL，小份（0.5 mL/份）分装，于室温保存。使用前将25 L的2-ME加入到每小份中。加入2-ME的Loading Buffer可在室温下保存一个月左右。【保存条件】-20保存，至少一年有效。 【注意事项】SDS-PAGE蛋白上样缓冲液(5X)中含少量DTT或-巯基乙醇，有轻微刺激性气味，必须完全溶解后再使用。二者作用相似，但DTT 的刺激性和毒性都低于-巯基乙醇，且粉末的稳定性也高于-巯基乙醇。DTT的最佳工作pH范围为7.1-8.0，但DTT价格略高一些。蛋白巯基还原实验DTT的常用工作浓度是1-10 mM。摘自Takara 商品目录-实验室常规试剂配制方法 TEMED原液直接使用考马斯亮蓝R-250染色液 【组分浓度】0.1%(w/v)考马斯亮蓝R-250，25%(v/v)异丙醇，10%(v/v)冰醋酸各种组分名称配制不同体积所需各成分的体积(mL)或质量(g)1000 ml备注考马斯亮蓝R-2501.0 g可以多加点，最好在摇床上摇摇，多溶解些。异丙醇250 mL搅拌溶解，可用甲醇或乙醇替代。甲醇固定效果好，但甲醇难闻且对身体有害。乙醇浓度太大会使胶皱缩。冰醋酸100 mL搅拌均匀去离子水650 mL搅拌均匀，滤纸快速过滤除去颗粒物，室温保存考马斯亮蓝R250染色，染色时间控制在0.5-1h。（注意：（1）保存考马斯亮蓝R250可回收使用，可保存很长时间，但一般不超过6个月；（2）染色时间过长难以脱色，过短染色效果不佳；）考马斯亮蓝染色脱色液【组分浓度】10%(v/v)醋酸，5%(v/v)乙醇名称用量备注冰醋酸100 mL乙醇250 mL一般加的量与染色液相同，只是不加R-250去离子水650 mL充分混匀后使用脱色（三个小时后应换次脱色液，再重新加入脱色液且约需脱色24小时，直到背景清晰为止）（1）蒸馏水中冲洗2-3次（2）7冰乙酸固定（3）7冰乙酸 10乙醇83ml蒸馏水脱色（4）7冰乙酸保存（要检测脱色后的胶，则需保存于7冰乙酸中）蒸馏水冲洗7冰乙酸（关键步骤），10乙醇脱色脱色液：7冰乙酸 ，10乙醇，83ml蒸馏水7冰乙酸保存（蒸馏水冲洗后用7冰乙酸保存且约二四天后再照胶，条带更为清晰）。银氨染色用凝胶固定液（质谱用）【组分浓度】 50% (V/V) 甲醇，10% (V/V) 醋酸名称用量备注甲醇500 mL醋酸100 mL去离子水400 mL充分混匀后室温保存银氨染色用凝胶处理液【组分浓度】50% (v/v) 甲醇，10% (v/v) 戊二醛名称用量备注甲醇50 mL戊二醛10 mL去离子水40 mL充分混匀后室温保存银氨染色用凝胶染色液【组分浓度】0.4% (w/v) AgNO3，1% (v/v) 浓NH3H2O，0.04% (w/v) NaOH名称用量备注20% AgNO32 mL浓NH3H2O1 mL4% NaOH1 mL去离子水96 mL充分混匀后室温保存【配制方法】取上述试剂加入100 200 mL的试剂瓶中，均匀混合。该溶液应为无色透明状。如果氨水浓度过低时溶液会呈混浊状，此时应补加浓氨水直至透明。本染色液应现用现配，不宜保存。银氨染色用显影液【组分浓度】0.005% (w/v) 柠檬酸，0.02% (v/v) 甲醛名称用量备注柠檬酸50 mg甲醛0.2 mL去离子水定容至1 L后充分混匀，室温保存SDS-PAGE凝胶配方1) 根据目的蛋白的分子量大小选择合适的凝胶浓度，再按照下面的表格配制SDS-PAGE的分离胶(即下层胶)：丙烯酰胺在凝胶中的百分比分离胶最佳分离范围5%60-212 kDa7.5%30-120 kDa10%18-75 kDa12%12-60 kDa15%15-45 kDa来源于蛋白质技术手册汪家政每种浓度的变性胶的分离范围不是指能跑出哪个范围分子量的蛋白质，而是指在这个区间内，蛋白质迁移率基本和分子量成正比，也就是线性关系，为了数据的可靠性，大家尽量根据这个来选择自己配胶的浓度。成分配制不同体积SDS-PAGE分离胶所需各成分的体积（毫升）6%胶510152025304050蒸馏水2.65.37.910.613.215.921.226.530%Acr-Bis(29:1)1.02.03.04.05.06.08.010.01.5 M Tris,pH8.81.32.53.85.06.37.510.012.510%SDS0.050.10.150.20.250.30.40.510%过硫酸铵0.050.10.150.20.250.30.40.5TEMED0.0040.0080.0120.0160.020.0240.0320.04成分配制不同体积SDS-PAGE分离胶所需各成分的体积（毫升）8%胶510152025304050蒸馏水2.34.66.99.311.513.916.523.230%Acr-Bis(29:1)1.32.74.05.36.78.010.713.31.5 M Tris,pH8.81.32.53.85.06.37.51012.510%SDS0.050.10.150.20.250.30.40.510%过硫酸铵0.050.10.150.20.250.30.40.5TEMED0.0030.0060.0090.0120.0150.0180.0240.03成分配制不同体积SDS-PAGE分离胶所需各成分的体积（毫升）10%胶510152025304050蒸馏水1.94.05.97.99.911.915.919.830%Acr-Bis(29:1)1.73.35.06.78.310.013.316.71.5 M Tris,pH8.81.32.53.85.06.37.510.012.510%SDS0.050.10.150.20.250.30.40.510%过硫酸铵0.050.10.150.20.250.30.40.5TEMED0.0020.0040.0060.0080.010.0120.0160.02成分配制不同体积SDS-PAGE分离胶所需各成分的体积（毫升）12%胶510152025304050蒸馏水1.63.34.96.68.29.913.216.530%Acr-Bis(29:1)2.04.06.08.010.012.016.020.01.5 M Tris,pH8.81.32.53.85.06.37.510.012.510%SDS0.050.010.150.20.250.30.40.510%过硫酸铵0.050.010.150.20.250.30.40.5TEMED0.0020.0040.0060.0080.010.0120.0160.02成分配制不同体积SDS-PAGE分离胶所需各成分的体积（毫升）15%胶510152025304050蒸馏水1.12.33.44.65.76.99.211.530%Acr-Bis(29:1)2.55.07.510.012.515.020.025.01.5 M Tris,pH8.81.32.53.85.06.37.510.012.510%SDS0.050.10.150.20.250.30.40.510%过硫酸铵0.050.10.150.20.250.30.40.5TEMED0.0020.0040.0060.0080.010.0120.0160.02注：如果配制非变性胶，参考上述配方，不加10%SDS即可配制成非变性PAGE胶。1) 按照如下表格配制SDS-PAGE的浓缩胶(也称堆积胶、积层胶或上层胶)：成分配制不同体积SDS-PAGE浓缩胶所需各成分的体积（毫升）5%浓缩胶123456810蒸馏水0.681.42.12.73.44.15.56.830%Acr-Bis(29:1)0.170.330.50.670.831.01.31.71 M Tris,pH8.80.130.250.380.50.630.751.01.2510%SDS0.010.020.030.040.050.060.080.110%过硫酸铵0.010.020.030.040.050.060.080.1TEMED0.0010.0020.0030.0040.0050.0060.0080.01TBST 缓冲液每2L体积中含：1M TrisHCL(pH7.5)100mLNacl16gKCL0.4g吐温1mlWestern blot用的缓冲溶液。1) 抗体去除液每50mL抗体去除液中含：0.5M TrisHCL（pH6.8）6.25mL10%SDS10mLBeta-ME0.175mL水33.75mLSDS-PAGE操作方法1、20uL 收集液，加入 5样品缓冲液 5ul，在 80水浴锅中煮 5min。按照上面配方制 SDS-PAGE 凝胶，安装好电泳仪，在槽中加入电极缓冲液。3、按一定顺序在加样孔中加入样品，根据 SDS-PAGE 电泳玻璃板间隙厚度不同，选择加入样品量，一般 0.75mm 间隙 15 孔的上样量10uL/孔,1mm 间隙 10 孔的上样量20ul/孔。上样量根据实际经验自己掌握。4、打开电源将电压调到 80v（一般 15min 左右），待样品跑过压缩胶后将电压调到 120v 至样品电泳到胶底部为止。5、将凝胶小心取下放入容器中，加入染色液，用摇床摇 23h6、待条带清晰后倒出染色液，加入脱色液过夜7、将脱色液倒掉，可以用 Quality One，或者相应的成像系统拍照、分析、估算蛋白浓度。SDS-PAGE胶的凝结速度受温度影响很大，随着温度的升高，凝结速度越来越快，温度降低则反之。所以，夏天时胶凝结的比较快，而冬天胶的凝结速度则变慢，甚至不能凝结，解决此类问题较可行的方法是：冬天在原配方的基础上加倍过硫酸铵和TEMED的使用量，可很好的解决胶凝结速度过慢的问题。借鉴Tricine-SDS-PAGE中添加甘油或者尿素来提高分辨率的成功经验，在普通的SDS-PAGE中加入约13%的甘油，同样可以提高分辨率，有效防止小分子量蛋白的弥散。只要把原来配方中的水换成60%的甘油，就可以了。在分离胶中加尿素和甘油都可以，加上尿素和甘油改变胶的孔径！特别是对分离糖蛋白的时候很有用处！一方面可以把条带压窄，减少拖尾现象的产生,另一方面对分离小分子量的蛋白有好处!一般加的量在0.53g尿素/12ml分离胶！自己可以跑来实验一下你跑9KD分子量的蛋白，建议用tricine-sds-page电泳来跑！也可以在分离胶中加尿素！以我经验来看，加尿素会好于甘油！电泳在二液槽中安放铂金丝电极；正极在下，负极在上。接通电源进行电泳，电场强度10伏/厘米左右，视室温高低而定。室温较高时宜用较低的电压以免发热过度影响分离。蛋白质向正极移动。待染料前沿移动至管底近处，停止电流。电泳时间为1-2小时。加入染色液后，先放入微波炉里加热5-10秒，使染色液微热即可（千万不要加热太久，否则冰醋酸就挥发了）。然后放水平摇床上摇20分钟，最多半小时就染好了。脱色也很简单，不用脱色液，直接用去离子水，放微波炉里煮沸5分钟左右，然后将水倒掉，再换上新的去离子水煮，这样反复几次，就可以了。效果可能比正常的脱色稍差一点点，不如那样清楚，只要电泳时比平时多上1/5的样品就可以了，关键是这样省时省材料（用不着含甲醇和冰醋酸的脱色液）。方便快捷！放心，反复煮胶不会把胶煮坏的。拍胶时的“黑十字”聚焦法！很多人用相机的微距聚焦都无法使识别框变绿，其实你只需要在胶所在的平面划一个黑十字就可以很好的聚焦，尤其是western blot的图，直接在膜的边上划就可以聚焦SDSPAGE的话可以找个颜色深东西放在胶的边上就可以了，把镜头对准它。SDS-PAGE注意事项1、胶凝的快慢不在于TEMED多少，在于APS的量，APS提供自由基，TEMED帮助自由基作用，是催化剂，对凝固速度影响不是太大，可以试试加大APS的量。2、下层也就是阳极缓冲液的作用当然是导电，用普通TRIS缓冲液做阳极缓冲液，一样跑得好，阴极就不一样了，需要提供离子强度和SDS环境，而在电泳过程中，阴极缓冲液的一些离子损失，而且与样品接触，不适合再次使用。至于有些时候跑太大浓度的胶，因为药品，BUFFER配制过程的一些问题，导致会出现蛋白带无法电泳到分离胶的最下方，胶跑得难看情况比较多，一般来说，15%的胶已经能够跑出大约15 KDa左右的蛋白，对于普通SDS-PAGE已经几乎到了极限，还跑不出来的MARK带，就不必去追究商品的问题了。3、做SDS-PAGE的时候，除了蛋白量上样一致，最好体积也一致，这样跑出来的胶各个泳道之间的band能做到一样宽，方便后面的比较，特别是WB。做法就是拿1X的上样缓冲液补全要加的样做到体积一致，否则跑出来会有的宽有的窄，特别是上样体积相差较大的。SDS-PAGE问题汇总Q：蛋白质条带为什么走到下面逐渐变宽发散？回答：多数情况是因为小分子在胶里的运动不规律，这种情况常发生在高浓度胶或凝固不一致的胶里，你可以加大阴极的缓冲液浓度，可能会有点改善。Q：在做蛋白表达的时候，包涵体的出现常常令大家头疼不已， 现在给大家推荐盐离子染SDS-PAGE的方法，这种方法简单快速还干净，适合于切胶免疫的同学，具体操作就是把配好的0.5M的氯化钾放在冰箱预冷，然后加在胶上慢慢晃动，大约5分钟就可以看见你的蛋白条带，切胶回收后直接乳化免疫，不会有什么影响。如果无法识别，还可以再用实验室传统的方法染色！Q：配胶缓冲液系统对电泳的影响？A：在SDSPAGE不连续电泳中，制胶缓冲液使用的是TrisHCl缓冲系统，浓缩胶是pH6.7，分离胶pH8.9；而电泳缓冲液使用的Tris甘氨酸缓冲系统。在浓缩胶中，其pH环境呈弱酸性，因此甘氨酸解离很少，其在电场的作用下，泳动效率低；而Cl离子却很高，两者之间形成导电性较低的区带，蛋白分子就介于二者之间泳动。由于导电性与电场强度成反比，这一区带便形成了 较高的电压剃度，压着蛋白质分子聚集到一起，浓缩为一狭窄的区带。当样品进入分离胶后，由于胶中pH的增加，呈碱性，甘氨酸大量解离，泳动速率增加，直接紧随氯离子之后，同时由于分离胶孔径的缩小，在电场的作用下，蛋白分子根据其固有的带电性和分子大小进行分离。所以，pH对整个反应体系的影响是至关重要的，实验中在排除其他因素之后仍不能很好解决问题的情况，应首要考虑该因素。Q：样品如何处理？A：根据样品分离目的不同，主要有三种处理方法：还原SDS处理、非还原SDS处理、带有烷基化作用的还原SDS处理。1、还原SDS处理：在上样buffer中加入SDS和DTT（或-巯基乙醇）后，蛋白质构象被解离，电荷被中和，形成SDS与蛋白相结合的分子，在电泳中，只根据分子量来分离。一般电泳均按这种方式处理，样品稀释适当浓度，加入上样Buffer，离心，沸水煮5min，再离心加样。2、带有烷基化作用的还原SDS处理：碘乙酸胺的烷基化作用可以很好的并经久牢固的保护SH基团，得到较窄的谱带；另碘乙酸胺可捕集过量的DTT，而防止银染时的纹理现象。100ul样品缓冲液中10ul 20的碘乙酸胺，并在室温保温30min。3、非还原SDS处理：生理体液、血清、尿素等样品，一般只用1SDS沸水中煮3min，未加还原剂，因而蛋白折叠未被破坏，不可作为测定分子量来使用。Q：SDS-PAGE电泳凝胶中各主要成分的作用？A：聚丙烯酰胺的作用：丙烯酰胺与为蛋白质电泳提供载体，其凝固的好坏直接关系到电泳成功与否，与促凝剂及环境密切相关；制胶缓冲液：浓缩胶选择pH6.7，分离胶选择pH8.9，选择trisHCl系统，具体作用后面介绍；TEMED与APS：促凝作用，加速聚丙烯酰胺的凝固；十二烷基硫酸钠（SDS）：阴离子去污剂，作用有四：去蛋白质电荷、解离蛋白质之间的氢键、取消蛋白分子内的疏水作用、去多肽折叠。Q：提高SDS-PAGE电泳分辨率的途径？A：1、聚丙烯酰胺的充分聚合，可提高凝胶的分辨率。建议做法：待凝胶在室温凝固后，可在室温下放置一段时间使用。忌即配即用或4 冰箱放置，前者易导致凝固不充分，后者可导致SDS结晶。一般凝胶可在室温下保存4天，SDS可水解聚丙烯酰胺。2、一般常用的有氨基黑、考马斯亮蓝、银染色三种染料，不同染料又各自不同的染色方法，具体可参照郭尧君编著的蛋白质电泳技术手册P82-103。Q：“微笑”（两边翘起中间凹下）形带原因？A：主要是由于凝胶的中间部分凝固不均匀所致，多出现于较厚的凝胶中。处理办法：待其充分凝固再作后续实验。Q：“皱眉”（两边向下中间鼓起）形带原因？A：主要出现在蛋白质垂直电泳槽中，一般是两板之间的底部间隙气泡未排除干净。处理办法：可在两板间加入适量缓冲液，以排除气泡。Q：为什么带出现拖尾现象？A：主要是样品融解效果不佳