大肠杆菌PCR检测方法.doc

ICS11.220B41DB21辽宁省地方标准DB 21/ XXXXXXXXX大肠杆菌PCR检测方法Method of PCR for the detection of Escherichia coli点击此处添加与国际标准一致性程度的标识XXXX - XX - XX发布XXXX - XX - XX实施辽宁省质量技术监督局发布DBXX/ XXXXXXXXX前言 本标准按照GB/T 1.12009给出的规则起草。 本标准由辽宁省动物疫病预防控制中心提出。 本标准由辽宁省畜牧兽医局归口。 本标准起草单位：辽宁省动物疫病预防控制中心、辽宁省动物医学研究院。 本标准主要起草人：赵凤菊，关淼，关乃鹏，李清竹，陈瑶5大肠杆菌PCR检测方法1 范围本标准规定了大肠杆菌PCR检测方法的技术要求。 本标准适用于大肠杆菌的诊断、监测及流行病学调查，适用于猪粪便、脏器及纯培养物中大肠杆菌的检测。本标准中的试验操作应在生物安全级（BSL-2）以上的实验室进行。2 规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。中华人民共和国农业部公告第302号 兽医实验室生物安全技术管理规范3 缩略语下列缩略语适用于本标准。E.coli：大肠杆菌（Escherichia coli）DNA：脱氧核糖核酸（Diethylpyrocarbonate）bp：碱基对（base pair）PCR：聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸（Deoxy-ribonucleoside triphosphate）Taq酶：Ex Taq DNA聚合酶（Taq DNA polymerase）TAE：三羟甲基氨基甲烷-乙酸电泳缓冲液（Tris acetate-EDTA buffer）4 原理 根据E.coli保守基因序列设计一对引物，在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以引物为延伸起点，通过变性、退火和延伸，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA。5 仪器和器材 本技术规范中需应用下列仪器和器材：高速台式冷冻离心机（最大离心力12 000g以上）、冰箱、PCR扩增仪、电泳仪、凝胶成像系统、微波炉、分析天平、1.5mL离心管和0.2mL离心管、微量移液器和吸头等。6 试剂和材料6.1 DNAzol Reagent：DNA抽提试剂，外观为淡绿色，于48保存。6.2 无水乙醇：-20预冷。6.3 75%乙醇：用无水乙醇和灭菌双蒸水配制，-20预冷。6.4 DNA聚合酶：Ex Taq DNA聚合酶（5 U/L）。6.5 dNTP(2.5 mmol/L)。6.6 引物：引物浓度为20mol/L；上游引物序列为5- GCCTCGCCTGGAGAATGA-3， 下游引物序列为5-CCTGAGACTGCGGTGGAA-3。6.7 阴性对照：灭菌双蒸水6.8 阳性对照：E.coli ATCC25922。6.9 无菌生理盐水。6.10 TAE：Tris-乙酸电泳缓冲液，6.11 溴化乙锭。6.12 DL2000 DNA Marker。注：本技术规范中使用的试剂，除另有说明外，所用试剂均为分析纯；所有试剂均用无菌的容器分装。7 操作步骤7.1 样品的采集、前处理、存放与运输7.1.1 采样注意事项 采样及样品前处理过程中应戴一次性手套，样本间不得交叉污染。7.1.2 采样工具药匙、15 mL离心管和1.5 mL离心管经121（士2）均高压灭菌20 min；剪刀、镊子经160 干热灭菌2 h。7.1.3 内脏样品的采集与前处理采取病死或剖杀猪主要脏器（肝脏、脾脏、肺脏）装入灭菌15mL离心管中，编号，送实验室。称取1 g 病料进行研磨，然后加入1mL无菌生理盐水，混匀，3000 rpm离心20 min，取上清液转入1.5 mL离心管中编号备用。7.1.4 内容物的采集与前处理采取病死或剖杀猪的小肠内容物，装入15 mL灭菌离心管中，按1：5倍体积加入无菌生理盐水，混匀，3000 rpm离心20min，取上清液转入1.5 mL离心管中编号备用。7.1.5 粪便的采集与前处理用药匙无菌采取发病猪新鲜粪便，装入15 mL灭菌离心管中，按1：5倍体积加入无菌生理盐水，混匀，3000 rpm离心20 min，取上清液转入1.5 mL离心管中编号备用。7.1.6 血液无菌采集心血，按1：1倍体积加入无菌生理盐水，混匀，转入1.5 mL灭菌离心管中编号备用。7.1.7 大肠杆菌纯培养物挑取37 1824h培养的典型菌落，用1mL无菌生理盐水制备成一定浓度的菌悬液。然后转入1.5 mL灭菌离心管中编号备用，待检。7.1.8 保存与运输 采集或处理的样品在28条件下保存应不超过24 h；若需长期保存，应放置-70冰箱，但应避免反复冻融(冻融不超过3次)。采集的样品密封后，采用保温壶或保温桶加冰密封，在68 h之内运送到实验室。按照兽医实验室生物安全技术管理规范进行样品的生物安全标识。7.2 PCR检测7.2.1 DNA提取7.2.1.1 取n个灭菌的1.5 mL离心管，其中n为待检样品数+阳性对照管数+阴性对照管数，对每个离心管进行编号。7.2.1.2 每管加入800L DNAzol，分别加入被检样品、阳性对照和阴性对照各200 L，颠倒混匀后，4 12000 g离心10 min。7.2.1.3 取与7.2.1.1中相同数量灭菌的1.5 mL离心管，吸取900 L上清液转移至相应的管中，加入500L无水乙醇混匀后。7.2.1.4 4 12000 g离心5min，弃上清，倒置于吸水纸上，沾干液体，加入1mL 75%乙醇，洗涤。7.2.1.5 4 12000 g离心5 min，弃上清，倒置于吸水纸上，沾干液体。如此洗2次。7.2.1.6 4000 g离心10 s，用微量加样器小心将残余液体吸干，室温干燥310 min。7.2.1.7 加入20 L经高压处理的水，轻柔混匀，溶解管壁上的DNA，冰上保存备用；若需长期保存应放置-70 冰箱。7.2.2 PCR7.2.2.1 PCR反应体系建立25L反应体系，按下列组分加入PCR专用离心管中： 灭菌蒸馏水 17.375L 10PCR Buffer 2.5L 2.5mM dNTP 2L Ex Taq DNA聚合酶 0.125L 上游特异性PCR引物 0.5L 下游特异性PCR引物 0.5L DNA 2L7.2.2.2 PCR反应条件94 预变性5 min；94 变性45 s，56 退火45 s，72 延伸50 s，35个循环；72 终延伸10 min7.2.2.3 电泳将PCR扩增产物6L与1L上样缓冲液混合，点样于1 %琼脂糖凝胶（含0.5g/mL溴化乙锭）孔中，琼脂糖凝胶板一侧点样孔加入DL2000 DNA Marker（分子质量标准物），缓冲液为1TAE，以5 V/cm电压电泳25min。8 结果判定紫外凝胶成像仪下观察结果，当阳性对照出现在272 bp扩增条带，阴性对照未出现目的条带时，实验结果可作为判定依据。被检样品出现272 bp扩增条带为E.coli 核酸阳性，未出现272bp扩增条带的样品判为E.coli 核酸阴性。AA附录A （规范性附录）试剂配制A.1 电泳缓冲液（50倍）A.1.1 0.5mol/L乙二铵四乙酸二钠（EDTA）溶液（pH8.0） 二水乙二铵四乙酸二钠（分析纯） 18.61 g 灭菌双蒸水 80 mL 氢氧化钠 调pH至8.0 灭菌双蒸水 加至100 mLA.1.2 TAE(三羟甲基氨基甲烷一乙酸)电泳缓冲液(50倍) 羟基甲基氨基甲烷(Tris