姜黄素对人结肠癌Lovo细胞VEGF表达的影响.doc

姜黄素对人结肠癌Lovo细胞VEGF表达的影响 袁琦张征胡小宣 湖南省人民医院肝病内科，湖南长沙410005 摘要目的研究姜黄素体外对人结肠癌Lovo细胞血管内皮生长因子VEGF表达的影响。方法不同浓度（0mol/L、5mol/L、10mol/L、20mol/L、40mol/L）姜黄素处理xx年8月xx年2月中南大学提供的人结肠癌细胞株Lovo24h后，用Real-timePCR检测姜黄素对人结肠癌细胞株血管内皮生长因子VEGFmRNA表达的变化，用Westernblot法检测姜黄素对人结肠癌细胞株VEGF蛋白表达的变化。结果人结肠癌Lovo细胞经过姜黄素处理24h后，5mol/L、10mol/L、20mol/L、40mol/L姜黄素组VEGFmRNA及蛋白的表达均明显下降，与对照组比较差异有统计学意义（P0.05）。结论姜黄素能下调人结肠癌Lovo细胞VEGF的表达，并呈剂量依赖，这可能是姜黄素抑制结肠癌Lovo细胞增殖及侵袭性的机制之一。 关键词姜黄素；结肠癌；血管内皮生长因子 R587.1A1674-074（4）12（b）035-03 作者简介袁琦（1983.1-），女，湖南邵东人，医学硕士，医师，研究方向：消化道肿瘤。 姜黄素是从姜科姜黄属植物姜黄、莪术、郁金等的根茎中提取的一种天然有效成分，具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化等多种药理作用，且毒性低，具有良好的临床应用潜力，尤其是其抗肿瘤作用受到国内外广泛关注。结肠癌是常见的恶性肿瘤之一，虽然近年来以手术、化疗、放疗、免疫等的综合治疗手段取得了一定的进展，但其死亡率仍居高不下，毒性作用依然限制着化疗药物和免疫制剂等的应用和疗效。有研究表明，姜黄素能显著抑制结肠癌HCT-116细胞的生长1，姜黄素能显著抑制人结肠癌Lovo细胞的增殖并促进其凋亡2，研究证实在肿瘤的侵袭、转移过程中，血管内皮生长因子（VEGF）起到了极其重要的作用3。该实验以xx年8月xx年2月中南大学提供的结肠癌Lovo细胞作为研究对象，观察了不同浓度姜黄素对结肠癌Lovo细胞VEGF表达的影响，以求从多角度对姜黄素对结肠癌细胞的作用进行研究，对结肠癌临床治疗提供有益的理论依据，现报道如下。 1资料与方法 1.1一般资料 人结肠癌Lovo细胞由中南大学肿瘤研究所提供；姜黄素购自Sigma公司，称取3.684mg的原料药充分溶解于1mLDMSO中，得到终浓度为10mmol/L的母液，临用时用完全细胞培养液稀释到所需浓度。Trizol、逆转录试剂盒购自大连宝生物公司，引物由大连宝生物公司合成。蛋白提取液及ECL发光试剂盒购自Pierce公司，兔抗人VEGF多克隆抗体及羊抗兔二抗lgG购自SantaCruz公司。 1.2细胞的培养及处理 人结肠癌Lovo细胞接种于含10%胎牛血清1640培养基，置于37、5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养，隔天换液，待细胞长至对数生长期时，用0.25%胰蛋白酶消化传代。取对数生长期的Lovo细胞，实验分组为对照组（姜黄素0mol/L，加入等量DMSO），姜黄素5mol/L，10mol/L，20mol/L，40mol/L组，处理后再置于37、5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养24h。 1.3Real-timePCR 采用Trizo1试剂一步法提取细胞总RNA，紫外分光光度计测定总RNA浓度，计算OD260/280，比值在1.82.0的RNA标本用于反转录。总RNA按说明书进行逆转录反应合成cDNA，逆转录产物cDNA用于Real-time-PCR扩增。VEGF引物：5端：5-GGGGGATCCGCCTCCGAA-ACCATGAACTT-3及3端：5-CCCGAATTCTCCTGGTGAGAGA-TCTGGTT-3，变性、退火温度为94与72，40个循环。利用标准曲线，根据样品CT值计算出样品中所含的模板量。 1.4WesternBlot 用蛋白提取液提取细胞蛋白，BCA测总蛋白质浓度。蛋白样品用10%SDS聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，上样量为20g。5%脱脂奶粉TBS缓冲液封闭，4过夜，加兔抗人VEGF多克隆抗体（1：500）室温2h，洗膜30min，加入羊抗兔二抗（1：1000）室温结合1h，ECL显色，内参采用-actin。采用Image-ProPlus6.0图像分析软件对蛋白条带进行灰度分析。以VEGF条带与内参-actin条带的灰度比值代表VEGF蛋白的表达水平。 1.5统计方法 实验所得计量数据以（xs）表示，采用SPSS13.0软件进行方差分析和t检验，以P0.05为差异有统计学意义。 2结果 2.1不同剂量姜黄素对人结肠癌Lovo细胞VEGFmRNA表达的影响 利用Primer3.0软件分别设计出扩增人VEGF和GAPDHmRNA的引物，Real-timePCR检测VEGFmRNA的表达，见表1，并用EXCEL做出各组VEGFmRNA相对表达量柱状图表达，见图1，姜黄素5mol/L、10mol/L、20mol/L、40mol/L组与对照组相比，VEGFmRNA的表达均明显降低，差异有统计学意义（P0.05），且呈剂量依赖性。 2.2不同剂量姜黄素对人结肠癌Lovo细胞VEGF蛋白表达的影响 不同剂量姜黄素处理Lovo细胞，收集细胞总蛋白，用WesternBlot检测VEGF蛋白的表达（结果见图2），并用Image-ProPlus6.0对图像进行灰度分析（结果见表1，图3），姜黄素5mol/L、10mol/L、20mol/L、40mol/L组与对照组相比VEGF蛋白表达均明显降低，差异有统计学意义（P0.05），且呈剂量依赖性。 3讨论 血管内皮生长因子VEGF随着肿瘤增殖、侵袭和转移而表达明显升高4。VEGF信号还与肿瘤细胞的淋巴管、淋巴结侵袭及远端转移密切相关5。梁启廉等研究发现VEGF表达水平与大肠癌组织学分化程度、浸润深度、TNM分期、淋巴结转移有关6。且临床观察发现大肠癌患者术前血清VEGF水平与大肠癌的浸润、转移密切相关7。有研究者利用同源重组将结肠肠癌细胞系中VEGF-A敲除后发现，当细胞缺失了VEGF信号后，细胞的生长受到了明显的抑制，且细胞对化疗药物5-氟尿嘧啶的敏感性增强8，而在临床上仅仅通过阻断细胞表面的VEGF受体来治疗结直肠癌效果是有限的。 目前研究发现，姜黄素能够对消化系肿瘤有很好的抑制作用，其药理活性主要表现在能够下调核转录因子（NF-kB）的活性，诱导细胞周期停滞和细胞凋亡，抑制血管生成9。在人结肠癌HCT116细胞中，姜黄素可有效抑制结肠腺癌细胞集落生长和侵袭能力10。不同浓度姜黄素作用人结肠癌SW620细胞24h，增殖抑制显著11。 该研究用4种不同浓度的姜黄素分别作用Lovo细胞24h后，利用Real-timePCR及WesternBlot方法检测VEGF的mRNA及蛋白的表达，发现各姜黄素组（5mol/L、10mol/L、20mol/L、40mol/L）与对照组比较，VEGF的mRNA及蛋白的表达明显下降，差异有统计学意义（P0.05），且姜黄素的作用浓度越高，VEGF的表达量越低，该作用呈剂量依赖，提示姜黄素能通过抑制人结肠癌细胞Lovo中VEGF的表达来抗结肠癌血管形成，抑制结肠癌细胞的生长和转移。此结果与贾佳等的观点一致，他们发现姜黄素能够下调结肠癌细胞HT-29中-catenin、VEGF的表达12。在多个结肠癌细胞系中，均有研究证实姜黄素能下调VEGF的表达，进一步可利用建立的结肠癌裸鼠移植瘤模型，从体内水平研究姜黄素能否下调瘤组织VEGF的表达，且姜黄素是否通过NF-KB信通路来下调人结肠癌细胞VEGF的表达，该机制也有待进一步研究。VEGF是抗癌药物治疗的新靶点，姜黄素作用后的人结肠癌Lovo细胞VEGF水平下降，提示姜黄素可能通过下调VEGF的表达抑制了VEGF促进肿瘤新生血管的作用，从而抑制了结肠癌的增殖和转移。该研究为姜黄素的临床应用提供新的理论依据。 参考文献 1王倩，赵刚.姜黄素对结肠癌HCT-116细胞生长的抑制作用J.湖北中医药大学学报，xx，14（1）：18-20. 2郭立达，焦振霞，宋瑛，等.姜黄素诱导结肠癌LoVo细胞凋亡的作用及机制研究J.中国中药杂志，xx，38（13）：2191-2196. 3NFerraraHPG，LeCouterJ.ThebiologyofVEGFanditsreceptorsJ.NatMed，xx，9（6）：669-676. 4尤程程，黄利鸣.VEGF及其调控因素的研究进展J.临床与实验病理学杂志，xx，27（12）：1344-1346. 5刘桂君，陈国江，黎燕，等.血管内皮生长因子在肿瘤生长转移中的作用机制研究进展J.国际药学研究杂志，xx，39（5）：391-395. 6梁启廉，陈小东，王三明，等.VEGF和metastin在大肠癌组织中的表达J.南方医科大学学报，xx，27（10）：1584-1587. 7李德川，冯海洋，徐笑红.大肠癌患者血清VEGF水平的临床研究J.癌症，xx，20（3）：314-316. 8SamuelS，FanF，DangLH，etal.IntracrinevascularendothelialgrowthfactorsignalinginsurvivalandchemoresistanceofhumancolorectalcancercellsJ.Oncogene，xx，30（10）：1205-12. 9赵鹏，蔡辉.姜黄素药理作用研究进展J.中医药临床杂志，xx，24（4）：380-382. 10范钰，张尤历，许则丰.姜黄素抑制