细胞工程与食品产业.ppt

第六章 细胞工程与食品产业,主要内容,细胞工程的概念、研究范畴 植物细胞培养 动物细胞培养 细胞融合技术 细胞拆合技术,第一节、概述,利用细胞生物学和分子生物学技术，应用工程学的方法，在细胞水平上研究改造生物遗传特性和生物学特性，从而获得特定的细胞、细胞产品或新生物品种的一门综合性科学技术。,概念,1 细胞工程的概念及研究范畴,研究范畴,动物细胞与组织培养 植物细胞与组织培养 细胞融合 细胞核移植（细胞拆合） 染色体工程 胚胎工程 干细胞与组织工程 细胞生物反应器,1）植物细胞和组织培养技术,2）动物细胞和组织培养技术,3）细胞融合技术（体细胞杂交技术）,4） 细胞拆合核移植技术,5）染色体工程技术,染色体工程是按人们的需要来添加、削减或替换生物的染色体从而定向改变遗传特性和选育新品种的一种技术。主要分为动物染色体工程和植物染色体工程,6）胚胎工程技术,7）干细胞和组织工程,8）细胞培养生物反应器,2、植物细胞工程的应用,紫杉醇(taxol)是从红豆杉属(Taxus L.)植物中分离出的一个具有独特抗肿瘤活性的二萜类化合物，现已应用于临床治疗卵巢癌和乳腺癌。,三、动物细胞工程的应用,1.在疫苗生产上的应用 。 将乙型肝炎表面抗原基因插入哺乳动物细胞内进行高效表达，已生产出乙型肝炎疫苗。,2. 生产单克隆抗体 单克隆抗体可以检测出多种病毒中非常细微的株间差异，鉴定细菌的种型和亚种。 3.繁育优良品种。 目前，人工受精、胚胎移植等技术已广泛应用于畜牧业生产。 4. 在干扰素生产上的应用,是指动物、植物和微生物细胞在体外无菌条件下的生长、分裂和繁殖，并在培养过程中不再形成组织的一项技术。,细胞培养,第二节、植物细胞培养技术,一、 植物细胞工程的发展,细胞学说的创立：18381839年间由德国的植物学家施莱登（Schleiden）和动物学家施旺（Schwann）所提出,直到1858年才较完善。,理论基础和探索,1902年，德国著名植物生理学家Haberlandt, 提出细胞全能性学说，并首次进行高等植物的细胞培养实验，但细胞未能发生细胞分裂和增殖。,1756年，Moncean首先发现植物在受伤愈合的组织皮层能产生芽，因而预言这一途径可以成为一种繁殖方式,培养技术建立,植物细胞培养技术应用发展,20世纪40年代：J.Bonner 银胶菊组织培养生产橡胶。 20世纪70年代：植物细胞培养生产药用成份。 20世纪80年代：400多种植物，600多种代谢产物。40多种植物次生代谢产物达到或超过植株产量。 20世纪90年代：1000多种植物。,1.首先，要取材和除菌。用一定的化学试剂对材料进行严格的表面清洗、消毒。有时还要借助某些特定的酶，对材料进行预处理，以期得到分散生长的细胞。 常用的消毒灭菌剂:效果较好的有几种化学试剂，如次氯酸钙、次氯酸钠和氯化汞等。,二、细胞培养一般步骤,2.其次，根据各类细胞的特点，配制细胞培养基，对培养基进行灭菌或除菌。采用无菌操作技术，将生物材料接种于培养基中。,3. 最后，将接种后的培养基放入培养室或培养箱中，提供各类细胞生长所需的最佳培养条件。当细胞达到一定生物量时应及时收获或传代。,三.植物细胞培养基,植物细胞的培养基:通常包括无机盐、碳源、维生素、生长调节素、有机添加剂等。,用于植物细胞培养的基础培养基营养成分基本上与整个植物的要求一样，但是用于培养细胞、组织和器官的培养基要满足各自特殊的要求,无机盐：有不少盐可用来提供“大量元素”和“微量元素”，表中给出了常用培养基中无机盐的含量。,培养中的细胞对蔗糖和葡萄糖都能利用，果糖的利用效果较差。培养基中的蔗糖可迅速分解成葡萄糖和果糖，葡萄糖首先被利用，然后再利用果糖。也可采用其它糖作能源，但效果不佳。,碳源和能源,培养中的植物细胞都需要硫胺素，加入烟酸、泛酸、生物素和叶酸，效果更好。原生质体培养通常需要大多数必需维生素。,维生素,虽然植物细胞在培养过程中一般都能合成所需的氨基酸，但加入L-谷氨酰胺或其他氨基酸混合物是很有好处的。此外，还使用蛋白酶解产物，如酪蛋白或酪蛋白水解氨基酸。其它有机添加剂还有如乳蛋白水解物，酵母提取物等,氨基酸,激素分为两类，生长素和分裂素。生长素促进细胞生长，最有效和最常用的是吲哚乙酸和萘乙酸；分裂素促进细胞分裂，常用的是腺嘌呤衍生物。使用最多的是6-苄氨基嘌呤和玉米素，对芽的诱导具有重要作用。分裂素和生长素通常一起使用，来促进细胞的分裂、生长。,植物生长激素,四.愈伤组织和悬浮细胞培养技术,愈伤组织：是指外植体组织增生的细胞产生的一团不定型的疏散的排列的薄壁细胞，是分化的，而且还未形成组织的结构。,外植体：是指植物组织培养中用来进行离体培养的植物材料。,愈伤组织的诱导,选择适宜的外植体：幼胚、下胚轴、子叶 选择适宜的培养基：MS，B5，N6 较高激素浓度 丰富的有机附加物。 培养基中有较高含量的无机氮源 较低的蔗糖浓度 适当缩短继代培养的间隔时间有利于疏松易碎愈伤组织的形成。,要求：松散性好、增殖快、再生能力强。其外观一般是色泽呈鲜艳的乳白或淡黄色，呈细小颗粒状，疏松易碎,适宜悬浮培养,适宜再生植株,悬浮系的建立与培养,callus,150250ml flask,centrifuge isolation,subculture,1g/10ml medium,100120 rmp culture transfer 1 time/3d,80 rpm,高表达细胞系的筛选建立,一是悬浮培养物分散性好，外观疏松、色泽鲜艳 二是均一性好 三是生长速度快、次生代谢产物合成能力强,五.单细胞培养技术,机械法,将叶肉组织研碎，经过滤和离心，收集和净化细胞。 优点：不受酶的伤害，有利于细胞生理和生化研究。缺点：手工操作难度大，获得完整的细胞数量少。,1、单细胞分离方法,酶法,利用果胶酶、纤维素酶处理植物叶片或其他外植物体，使细胞分离。 加渗透压保护剂如甘露醇以防酶对细胞的损伤。 加硫酸葡聚糖钾盐可提高游离细胞的产量。,化学法,利用利用化学药剂使细胞分离的方法。 草酸钙处理胡萝卜悬浮细胞培养物时，可获得分散细胞。 秋水仙碱、2，4D或LH。,看护培养,2、单细胞培养方法,用一块活跃生长的愈伤组织来促进培养细胞持续分裂和增殖的方法。,优点： 简便易行，效果好。 缺点： 不能在显微镜下追踪细胞分裂、生长过程。,将悬浮单细胞与融化的琼脂培养基均匀混合后平铺一薄层在培养皿底上的培养法。,平板培养,平板培养,平板培养植板率,优点： 单细胞在培养基中分布均匀，便于在显镜下对细胞进行定点观察。筛选效率高、筛选量大、操作简便。 缺点： 通气状况不好，排泄物质易积累造成 毒害或影响组织吸收。,微室培养,在人工制造的无菌小室中，将一滴悬浮细胞液培养在少量培养基上，使其分裂增殖成细胞团的方法。,置培养皿中2628 恒温培养,优点： 可对培养细胞连续进行显微观察，了解一个细胞的生长、分裂、分化等过程。 缺点： 培养基少，营养和水分难以保持，pH变动幅度大，培养细胞仅能短期分裂。,六.提高植物细胞次级代谢产物含量的方法,加入前体物或诱导物,前体物：次生代谢合成途径中的某一中间化合物或是合成的起始物。 诱导物：一类能引起植物细胞代谢强度变化或代谢途径改变的物质。,毛状根培养,毛状根(hairy roots)是发根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)感染植物后，其Ri质粒上的TDNA片断整合进植物细胞核基因组中诱导产生的一种特殊表现型。,冠瘿瘤培养,植物细胞大规模培养在食品工业中的应用,（1）利用植物细胞工程生产香料 （2）生产食品添加剂 （3）生产天然食品,七、植物细胞大规模培养,植物细胞大规模培养的特点,植物细胞对剪切力敏感。 植物细胞培养通常形成细胞团。 植物细胞生长速度慢，操作周期长 多泡沫。 植物细胞在高浓度培养时为假塑性流体。 植物细胞的需氧量要比微生物要低的多。 大多数植物细胞培养需要光照。,几种流体特征,1-宾汉型 2-假塑性 3-牛顿型 4-涨塑性 1-涨塑性 2-牛顿型 3-假塑性,1.植物细胞悬浮细胞培养,悬浮细胞培养技术,悬浮培养优势,把离体的植物细胞悬浮在液体培养基中进行增殖培养,1）培养细胞与培养基质接触面大，传质效果好。 2）可带走有害的代谢产物，避免了有害产物局部浓度过高的问题。 3）能充分保证氧的供给。,2.植物细胞固定化培养,植物细胞固定化是将植物细胞包裹于一些多糖或多聚化合物上进行培养，并生产有用代谢物的技术。,固定化培养技术,（1）有利于次生物质的合成、积累； （2）减弱剪切力损伤； （3）有利于连续培养和产物的收集；,固定化培养优势,1）悬浮培养生物反应器,植物细胞大规模培养的初期（20世纪70年代），主要采用微生物培养用的机械搅拌反应器。,1972年，Kato首先用机械搅拌反应器培养烟草细胞以获取烟碱。Fujita利用这种反应器生产紫草宁。,3.植物细胞培养生物反应器,机械搅拌反应器,机械搅拌植物细胞反应器,机械搅拌反应器的优点及存在的问题,优点：机械搅拌生物反应器最大的优点就是获得高的溶氧系数 (KLa 100h-1)，植物细胞培养一般只需要KLa在5-20 h-1之间就够了；再是反应器的温度、pH值、溶氧及营养物质的浓度较易控制。,存在的问题：主要问题是剪切力问题；对只需较低kLa的植物细胞培养，促进氧传递的机械搅拌，每单位体积消耗的功率比气体搅拌要大；机械搅拌需搅拌轴，由此又带来了无菌密封问题。,非机械搅拌反应器,通常为气体搅拌反应器，是一种利用通入的空气作通气和搅拌的生物反应器，主要有鼓泡式反应器和气升式反应器，气升式反应器又可分为外循环和内循环式。,我国的刘大陆、查丽杭等发明了“气升内错流式”植物细胞培养反应器用于培养紫草，紫草宁含量达到了干细胞重的10%，是天然植株的2-8倍。,气体搅拌反应器的优点及存在的问题,优点：剪切力小，对植物细胞损伤小；因没有搅拌轴而更易保持无菌；操作费用低。,不足：因气体搅拌强度低，高密度培养时混合不够均匀。靠大量的通气输入动量和能量，以保证反应器内培养液的良好传质、传热。但过量的通气易排除培养液中的二氧化碳和乙烯，对于细胞生长有阻碍作用。再是过高的溶氧对植物细胞合成次级代谢产物不利。,2)固定化细胞生物反应器,固定化细胞：将一定生理功能的生物体用物理或化学方法使其与适当载体相结合，作为固体催化剂利用。,优点：单位体积细胞多，受剪切力小。 缺点：由于其混合效果低，对必要的氧传递，pH值、温度控制和气体产物(如C02)的排除造成了困难。再者支持物颗粒破碎易堵塞填充床。,填充床反应器,Jones 在填充床反应器中进行了固定化胡萝卜的培养，Kargi 采用这种反应器培养长春花,流化床反应器,优点：良好的传质特性。 缺点：剪切力和颗粒碰撞会损坏固定化细胞，同时，流体动力学的复杂性使之难以放大。,典型的流化床反应器是利用液体或气体的流动使支持物颗粒处于悬浮状态。,Hamilton 用之培养胡萝卜细胞，研究了转化酶活性。,膜反应器,优点：可以重复使用。另外，流体易控制，易放大，而且能提供更均匀的环境条件。膜具有选择性，有利于产品分离。 缺点是构建膜反应器的成本较高。,第三节、动物细胞培养技术,19世纪30年代，Muller, Schwann, Virchow等相继在肺结核、天花、水痘、麻疹等病理组织中观察到多核细胞现象。 1849年Lobing在骨髓中也发现了多核现象的存在，1855年1858年，科学家们在肺组织和各种正常组织及发尖和坏死部位都发现了多核细胞。,1融合现象的发现,一、动物物细胞工程的发展,1859年，A. Barli在研究黏虫的生活史时发现，某些黏虫存在着由单个核细胞融合形成多核的原生质团的情况。据此，他认为多核细胞是由单个细胞彼此融合而形成的。,2. 动物组织细胞培养技术的建立,1907年，R. Harrison将蛙的胚神经管区的一片组织移植到蛙的淋巴液凝块中，这片组织存活了若干星期，而且还长出了轴突(神经纤维)细胞。 Carrel (1911)发现了鸡胚浸出液对于某些细胞的生长具有很强的促进效应，把无菌技术引到了组织培养技术中。,1914年，Thomson创立了器官培养法，以后被Strangeways和Fell所发展。 1940年，Earle建立了小鼠的结缔组织细胞系L系。1951年，Gay建立了第一个人体细胞系.,3. 细胞融合技术的建立和杂交瘤技术的诞生,1958年, Okada发现紫外灭活的仙台病毒可引起艾氏腹水瘤细胞彼此融合。 Harris(1965)诱导不同的动物体细胞融合获得成功。,Lifflefield(1964)根据亲本细胞的酶缺陷型，利用选择性培养基筛选异型融合细胞，并能不断地增殖。 1975年，免疫学家Kohler和Milstein利用小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，选择到能分泌单一抗体的杂种细胞。,4. 动物克隆技术的建立,1891，Heape等人首次报道了家兔胚胎移植成功的结果。 20世纪30年代以后，先后在羊、猪、牛等动物的胚胎移植上获得成功。,1962年，英国学者Grudon把非洲爪蟾小肠上皮细胞的核注入同种或异种非洲爪蟾未受精卵(经紫外线照射杀死卵细胞核)中，约有1的重组卵发育成为成熟蛙。 1997年2月，英国科学家Wilmut等报道了世界第一只克隆羊的诞生。,1.过程,二、动物细胞培养,2.几个概念：,动物细胞培养就是从动物机体中取出相关的组织,将它分散成单个细胞,然后,放在适宜的培养基中,让这些细胞生长和增殖,并维持结构和功能的一门技术。,动物细胞培养,将动物组织消化后的初次培养称为原代培养。,原代培养和传代培养,用胰蛋白酶将出现接触抑制的贴壁细胞从培养瓶壁上脱离下来，制成细胞悬液，分装到多个培养瓶中继续培养，这个过程叫传代培养。,细胞系和细胞株,初次培养的细胞经第一次传代成功后，即称之为细胞系。,从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或通过筛选方法，由单细胞增殖形成的细胞群，称细胞株。,有限细胞系和无限细胞系,大多数细胞系在有限的代数内增殖，当超过有限世代后，它们可能有两种情况，一是衰老死亡，二是发育成无限细胞系或称连续细胞系。 有限细胞系转换成永久细胞系的过度期称为转换期，其转换过程在动物细胞培养中称为体外转化。,接触抑制,密度抑制,3.动物细胞培养生长的特点,贴附生长,贴附生长,粘附型细胞:附着在某一固相支持物表面才能生长的细胞。 悬浮型细胞:不必附着于固相支持物表面，而在悬浮状态下即可生长的细胞。 绝大多数有机体细胞属粘附型细胞，只有少数细胞类型如某些肿瘤细胞和白细胞可在悬浮状态下生长。,细胞接触抑制,细胞在贴壁生长过程中，细胞间相互接触，细胞分裂和生长停止的现象。,密度抑制,细胞培养过程中，细胞密度增大，培养液中营养成分减少，代谢产物增多，细胞因营养的枯竭和代谢物的影响而导致的细胞分裂和生长停止。,体内：粘附是全方位，外形具有复杂的立体特征 体外：多数情况，细胞只有一个附着平面，外形一般与体内时明显不同,细胞在体内、外的粘附方式存在差异,上皮细胞型 成纤维细胞型 游走细胞型 多型性细胞型,4、培养动物细胞形态,类似体内的上皮细胞，扁平，不规则多角形，中有圆形核。彼此紧密相连成铺石状薄层；生长时呈膜状移动；很少脱离细胞群而单个活动,上皮细胞型,胞体梭形或不规则三角形；胞质向外伸出23个长短不等的细胞突起；中有卵圆形核。排列成放射状，漩涡状，不连成片。,成纤维细胞型,游走细胞型,外形不规则且不断变化，细胞内容易出现暗的吞噬性颗粒。生长位置不固定，分散，呈活跃的的游走和变形运动。,多型性细胞型,外形不规则，细胞由略呈多角形的胞体和细长的、类似伪足的胞突两部分组成，胞内容易出现暗的吞噬性颗粒,血清：如Hela细胞系在高血清成纤维细胞样；低血清上皮样细胞 pH：如Hela细胞系，太酸或太碱成纤维细胞样；标准pH上皮样细胞 细胞密度：3T3，低密度成纤维细胞样；高密度上皮样细胞 生长状态改变：悬浮圆形悬浮；贴附成纤维或上皮样 转化与否 ：未转化成纤维样；转化后可成上皮样,培养细胞形态变化,三、培养细胞的生长和增殖过程,1.培养细胞生命期,所谓培养细胞生命期，是指细胞在培养中持续增殖和生长的时间。包括原代培养期、传代培养期及衰退期。,正常培养的细胞周期,2.体外培养细胞一代生存期-生长曲线,潜伏期 指数增长期 平衡期 衰退期,所谓细胞的“一代”是指从细胞接种到分离再培养的一段时间。,四、动物细胞培养的基本技术,1. 无菌、无毒的环境,添加一定量的抗生素，定期更换培养液。,2. 温度和pH,温度 pH,与体内相近 35-37,7.27.4,3. 气体环境,O2 CO2,细胞代谢所必需,维持pH,CO2培养箱（95% 空气5% CO2 ）,5 .平衡盐溶液BSS,人工合成培养基的基础用液，用来洗涤细胞。 Hanks液、Earle液和PBS液等,4. 营养物质,糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素、激素以及动物或人血清等。,RPMI-1640 细胞培养基成分 （配制时添加碳酸氢钠2000mg/L）,五、动物细胞大规模培养,培养方式分为： 分批式 流加式 半连续式 连续式,1.动物细胞大规模培养工艺方式,分批式培养,分批式培养：指先将细胞和培养液一次性装入反应器内进行培养，细胞不断生长，产物不断形成，经一段时间后，终止培养。,特点： 分批式培养过程的环境随时间变化很大 细胞的生长阶段可分为延滞期、对数生长期、减速期、平稳期和衰退期。,流加式培养,特点： 可避免某种营养成分的初始浓度过高； 能防止营养成分在培养过程中被耗尽； 整个过程反应体积是变化的。,流加式培养是指先将终体积1/31/2的培养液装入反应器，接种细胞，进行培养，在培养过程中，随着细胞对营养物质的不断消耗，新的营养成分又不断补充至反应器内，使细胞持续生长代谢，到反应终止时取出整个反应系。,半连续式培养,指在分批式培养的基础上，将分批培养的培养液部分取出，并补充加入等量的新鲜培养基，使反应器内培养液的总体积保持不变。半连续培养能够重复获得大量均一的培养细胞供进一步利用。,特点：操作简便、生产效率高，可长期生产，细胞密度和产品产量一直保持在较高水平。,连续式培养,连续式培养：指在培养过程中，以不断抽取悬浮培养物并注入等量新鲜培养基，使培养物不断得到养分补充，保持反应条件处于一种恒定状态。 特点： （1）反应器培养状态恒定，保持细胞在优化状态下生长； （2）适于大规模工业化生产； (3)操作复杂、增加污染机会、细胞变异、设备仪器要求高,2、动物细胞大规模培养技术,悬浮培养 贴壁培养 固定化培养 微载体培养技术 大载体培养技术 多孔载体培养 微囊化培养技术 中空纤维细胞培养技术,第三节 细胞融合技术,是指在外力的作用下，两个以上的异源（种、属）细胞或原生质体互相接触，不经过有性过程而发生膜融合、胞质融合和核融合并形成一个杂合细胞的现象。,细胞融合（体细胞杂交）,白菜,甘蓝,白菜甘蓝,植物体细胞融合应用示例,杂交的两个细胞,再生细胞壁,杂种细胞,脱分化,再分化,（植物体细胞融合完成的标志）,植物细胞融合,植物组织培养,细胞在促融因子的作用下，出现凝集现象，然后，细胞之间的质膜发生粘连，细胞开始细胞质融合，然后在培养过程中，进而发生核融合，形成杂种细胞。,细胞融合的过程,细胞融合,一.诱导细胞融合的方法,1、病毒诱导细胞融合,病毒是最早采用的融合剂。常用于诱导动物细胞融合的病毒有仙台病毒、新城鸡瘟病毒、疱疹病毒等，其中仙台病毒最常用。 用作融合剂的病毒必须事先用紫外线或-丙内酯灭活，使病毒的感染活性丧失而保留病毒的融合活性。,两个原生质体或细胞在病毒黏结作用下彼此靠近，使两个细胞膜、胞质间互相渗透 、细胞核互相融合，进入正常的细胞分裂途径，形成杂种细胞。,机制,优点：融合率较高，适宜各种动物细胞，且仙台病毒能在鸡胚中大量繁殖，容易培养； 缺点：仙台病毒不稳定，在保存过程中融合活性会降低，并且制备过程比较烦琐。此外，病毒引进细胞后，可能会对细胞的生命活动产生干扰。,病毒诱导融合优缺点,常用的病毒：（Sendal virus), 又称日本血凝病毒 （Hemagglutinating virus of Japan,HVJ） 属于副粘液病毒科，RNA病毒，圆球形， 1962年，日本仙台东北大学学者冈田发现仙台病毒可诱导细胞融合。,仙台病毒,利用化学融合剂，促使原生质体相互靠近、粘连融合的方法。,2、化学融合剂法,机制：PEG是乙二醇的多聚物, 存在不同分子量的多聚体,它可改变各类细胞的膜结构, 使两细胞相互接触部位的膜脂双层中脂类分子发生疏散和重组,此时相互接触的两细胞的胞质沟通成为可能,从而造成细胞之间发生融合.。 优缺点:聚乙二醇是化学试剂，使用起来很方便，诱导细胞融合的频率比较高，但是它有一定毒性，对有些细胞(如卵细胞)不适用。,聚乙二醇（PEG）诱导融合,机制：一般认为是Na+造成了膜电位的改变。 存在的缺陷：就是融合频率低，而且对于来源于叶肉的高度液泡化的原生质体有害。 由NaNO3诱导的可重复、可控制的离体原生质体融合是由Power等（1970）报道的。利用这一融合剂，Carlson等（1972）在植物中获得了第一个体细胞杂种，,NaNO3处理诱发融合,高Ca2+高pH诱发融合的机制尚不很清楚，一般认为是改变了膜位及膜的物理结构。 烟草叶肉原生质体在高Ca2+（0.05M CaCl2）和高pH（10.5）条件下能很快诱发融合（37），但融合频率不很高，高pH也影响原生质体的存活率，且易诱发多个原生质体融合。,高pH高浓度钙离子处理,1981年，Scheurich和Zimmermann发明了电诱导细胞融合。 采用直流电脉冲的诱导，可改变原生质体质膜表面的电荷，使异种原生质体粘合，并使原生质膜瞬间破裂，相邻的原生质体连接、闭合、产生融合体。,3、电诱导细胞融合法,细胞电融合原理：,悬于大小不同的两平行电极间的低导电率溶液中的细胞，在交流电场中（1100MHz和1001000V/cm ），会向小电极移动，并极化成偶极子，并沿电场方向排列成串，此时再加上适当强度和持续时间的高压电脉冲，即可使相邻细胞膜的接触区产生可逆电降解，从而触发细胞融合。,+,-,+,-,+,-,+,-,-,+,偶极子,电诱导法原理,+,-,-,+,电泳：在电极的作用下，原生质体泳到一起，建立一个膜接触状态，形成念珠链。 融合：由于膜的可逆性电激穿，使原生质体发生融合。,电融合包括两个步骤：,原生质体电融合过程,1）在高频电流电场下的相互接触。 2）脉冲刺激后30s 3)50秒后 4）1.5分钟后 5）6分钟后 6）15分钟后，原生质体融合完成。,优点：融合率高，达7080，甚至100 可在显微镜下定向诱导细胞融合 可直接挑选杂种细胞 重复性强、对原生质体伤害小；装置精巧、方便简单；免去PEG诱导后的洗涤过程、诱导过程可控制性强等。,缺点：必须购置专用的细胞电融合设备。,电融合仪,激光诱导细胞融合,光镊的原理,光镊牵拉单细胞运动,光镊辅助细胞融合,离子束诱导细胞融合,在离子束与生物体相互作用中，粒子的植入、动量的传递和电荷交换可导致细胞表面被刻蚀，引起细胞膜透性和跨膜电场的改变，据此原理，发展了离子束诱导的细胞融合,二、植物细胞融合,原生质体,原生质体是指用特殊方法去除细胞壁后而形成的祼露的、有生活力的原生质团。,原生质体,植物原生质体的制备流程,原生质体的分离,原生质体的纯化,鉴定,取材与消毒,洗涤,活力测定,1、取材与消毒,可以用各种组织和器官，但多应用叶片、愈伤组织及悬浮培养细胞。以及茎尖、根尖、子叶和胚性组织。,肥皂水70%酒精3%次氯酸钠无菌水,先将细胞放在高渗糖溶液中预处理，待细胞发生轻微质壁分离，原生质体收缩成球形后，再用机械法磨碎组织，从伤口处可释放出完整的原生质体。,缺点：获得完整的原生质体的数量比较少，能够用此法产生原生质体的植物种类受到限制。优点：该方法可避免酶制剂对原生质体的破坏作用。,2、原生质体的分离,机械分离法,指将材料放入能降解细胞壁的混合等渗酶液中保温一定时间，在酶液的作用下，细胞壁被降解，从而获得大量有活力的原生质体的方法。,酶解分离法,优点：获得量大，适用广泛。 缺点：商品酶制剂均含有核酸酶、蛋白、过氧化物酶以及酚类物质。会影响所获原生质体的活力。,常用的酶种类,纤维素酶类（纤维素酶、半纤维素酶、崩溃酶Driselase）、果胶酶类（果胶酶和离析酶Macerozyme）、蜗牛酶和胼胝质酶。,3、原生质体的纯化,采用比原生质体密度大的高渗溶液（蔗糖、Percoll、Ficoll）， 使原生质体漂浮在液体表层的纯化方法。,优点：可以避免分离的原生质体因震荡被组织碎片撞击而破损；所用药品简单，成本低。 缺点：对离心力要求比较严格，掌握不好，原生质体则不易漂浮。,飘浮法,沉降法（过滤离心法）,利用比重原理，在具有一定渗透压的溶液中，先进行过滤然后低速离心，使纯净完整的原生质体沉积于试管底部。 优缺点： 纯化原生质体比较简单。 由于原生质体沉积于试管底部，造成相互挤压，常引起原生质体的破碎。,不连续梯度法,又称界面法，采用两种密度不同的溶液形成不连续梯度，通过离心使原生质体与破损细胞分别处于不同液相中，从而纯化原生质体的方法。 优点：可以收集到数量较大的纯净原生质体，同时避免收集过程中原生质体因相互挤压而破碎。,4、原生质体活力测定形态识别,形态完整、富含细胞质、颜色新鲜的正常球形，放入低渗溶液中，可正常膨大。,形态识别,荧光显微镜识别(FDA法),FDA (fluorescein diacetate) 不发荧光也不具有极性，能自由穿过细胞质膜。活细胞内FDA可以被内酯酶水解为不能自由穿越质膜的荧光素，在完整的活细胞内积累。 使用浓度：0.01%,酚藏花红染色法,酚藏花红（0.1%) 能使无活力的原生质体染成红色，有活力的原生质体不着色。,有活力但受损伤的细胞和死细胞能够摄取伊凡蓝(Evans blue)(0.025%)这种染料，活细胞不摄取。,伊凡蓝染色法,5、植物细胞融合,PEG法和电融合法比较合适,6、融合子的鉴别,根据两亲本