RT-qPCR技术的原理及应用.ppt

实时荧光定量PCR技术的原理及应用 (Real time Quantitative PCR),实时荧光定量PCR定义,实时荧光定量PCR定义,在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法,实时荧光定量PCR 原理 应用,绝对定量(Absolute Quantification，AQ) 病原体检测 转基因食品检测 基因表达研究 相对定量(Relative Quantification，RQ) 高通量基因检测方法的验证 药物疗效考核 耐药性研究,实时荧光定量PCR 原理 应用,中国人终末期肝病组织中乙肝病毒转录体的检测 摘要目的: 探讨肝组织中HBV DNA 和病毒转录体与终 末期肝病的关系. 方法: 用TRIzol 从肝组织中提取组织核酸, PCR 及RTPCR 扩增HBV XDNA, XRNA, fRNA 和trRNA, 琼脂糖凝胶电泳显示产物, Southernblot 杂交验证PCR 扩增的可靠性. 结果: 27 例HBsAg ( + ) 肝组织, 19 例HBx DNA/ RNA 检测均为阳性, 其中HBeAg ( + ) 者fRNA 检出率较HBeAg( - ) 者高; 22 例HBsAg ( - ) 肝组织, 有16 例可检测到HBx DNA 或RNA,HBsAg( - ) 的隐匿性感染在中国人终末期肝病中有较高的检出率72. 7%; HBV 病毒转录体trRNA 在肝癌及肝硬化组织中的检出率明显高于其他肝脏疾病( P 0. 05) . 结论: HBV隐匿性感染与中国人终末期肝病的发生密切相关, 肝组织中HBV trRNA 也与终末期肝病关系密切.,实时荧光定量PCR 原理 应用,实时荧光定量PCR 原理 应用,实时荧光定量PCR 原理 实时原理,常 规 PCR技术： 对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析 无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测,实时定量PCR技术： 利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析,实时荧光定量PCR 原理 -Ct值的重现性,Ct值的特点： 相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定； Ct值则极具重现性,实时荧光定量PCR 原理 - 定量原理,理想的PCR反应： X=X0*2n 非理想的PCR反应： X=X0 (1+Ex)n n：扩增反应的循环次数 X：第n次循环后的产物量 X0：初始模板量 Ex：扩增效率,非特异性荧光标记： 1、 SYBR Green 特异性荧光标记： 2、TaqMan,实时荧光定量PCR 原理 - DNA 产物的荧光标记,实时荧光定量PCR 方法 1 -SYBR Green 法,SYBR Green,SYBR Green 法 工作机理,SYBR Green 能结合到双链DNA的小沟部位,SYBR Green 只有和双链DNA结合后才发荧光 变性时，DNA双链分开，无荧光 复性和延伸时，形成双链DNA， SYBR Green 发荧光，在此阶段采集荧光信号。,SYBR Green,实时荧光定量PCR原理 SYBR Green I 工作原理,SYBR Green 法 融解曲线分析,SYBR Green 法 -PCR反应的建立,反应体系的建立及优化: SYBR Green 使用浓度:太高抑制Taq酶活性，太低，荧光信号太弱，不易检测 Primer：引物的特异性高，否则扩增有杂带，定量不准 MgCl2的浓度:可以降低到1.5mM,以减少非特异性产物 反应Buffer 体系的优化 反应温度和时间参数:由酶和引物决定 其他与常规PCR相同,SYBR Green 法 应用范围,起始模板的测定 基因型的分析 融解曲线分析：可以优化PCR反应的条件，对常规PCR有指导意义，如对primer的评价；可以区分单一引物、引物二聚体、变异产物、多种产物。,实时荧光定量PCR法 标准样品,相对定量中的内标 内标通常是-actin、GAPDH、18S