GB-T18090-2000猪繁殖和呼吸综合症诊断方法.pdf

G B / r 1 8 0 9 0 -2 0 0 0前言 猪繁殖和呼吸综合症( 简称P R R S ) 是由P R R S 病毒引起的一种接触传染性疾病。各种年龄的猪均易感染。妊娠母猪感染后可引起流产、 死胎、 木乃伊胎及弱胎， 仔猪可发生呼吸障碍和高病死率， 其他猪常呈隐性感染或仅出现轻度的呼吸道症状。 P R R S 病毒有欧洲型和美洲型两种主要抗原型， 分别以I N和V R - 2 3 3 2 为代表株， 型间具有明显的抗原交叉反应性。 据现有资料， 我国流行的毒株为美洲型 本病几乎发生于世界各养猪国家， 并于九十年代中期传入我国。由于其对养猪业的严重威胁性， 国际兽疫局( 1 9 9 6 ) 已 将本病列为B 类传染病。 大连动植物检疫局在国内率先开展了P R R S的研究工作， 建立了具有与国际同等水平的病毒分离鉴定、 间接免疫荧光试验和血清中和试验等诊断方法。 其他单位也相继建立了多种酶联免疫吸附试验等 本标准是在综合我国科研成果的基础上， 参照国际兽疫局( O I E ) 编写的 哺乳动物、 禽和蜜蜂A和B类疾病诊断试验和疫苗标准手册 ( 第三版， 1 9 9 6 ) 编写的。其技术内容与O I E所推荐的基本一致。 本标准的附录A、 附录B和附录C都是标准的附录。 本标准由农业部提出。 本标准起草单位: 中华人民共和国大连动植物检疫局。 本标准起草人: 孙颖杰、 苏永生、 潘凤城、 孙延峰、 简中友。免费标准下载网( w w w . f r e e b z . n e t )免费标准下载网( w w w . f r e e b z . n e t ) 无需注册 即可下载中华 人 民 共 和 国 国 家 标 准猪繁殖和呼吸综合症诊断方法D i a g n o s t i c m e t h o d s o f p o r c i n e r e p r o d u c t i v e a n d r e s p i r a t o r y s y n d r o meG B / T 1 8 0 9 0 -2 0 0 01 范围 本标准规定了猪繁殖和呼吸综合症( P R R S ) 的诊断方法。 本标准适用于猪繁殖和呼吸综合症的诊断。2 诊断方法的种类和选用 P R R S 的诊断方法有多种。依据临床症状和病理变化只可 作出初步诊断， 确诊必须依靠实验室检查。目 前已建立和应用的实验室诊断技术有病毒的分离与鉴定、 免疫过氧化物酶单层试验U P MA ) 、 间接免疫荧光试验( I F A) 、 间接酶联免疫吸附试验( 间接E L I S A) 和血清中和试验( S N) 等。病毒的分离与鉴定多用于急性病例的确诊和新疫区的确定。 其余4 种方法主要用于检测P R R S 病毒抗体 I P MA , I F A和间 接E L I S A三者特异性相似， 但以间 接E L I S A的敏感性最高。 应用这三种方法一般不易区别病毒的抗原类型， 故多适用于确定病性。 S N反应具有明显的抗原型别差异， 因此， 它既适用于确定病性， 也适用于鉴定病毒的抗原类型。中和抗体出现最晚， 不适合于早期诊断 本标准指定上述五种实验室诊断技术为我国进出境和国内生猪P R R S的诊断方法， 保证了我国对P R R S 的诊断与国外的一致性。在实际应用时， 可根据需要和条件， 从中选用1 .2 种方法即可。3 病毒的分离与鉴定3 门材料准备3 . 1 . 1 器材: 9 6 孔细胞培养板、 微量移液器、 恒温水浴箱、 二氧化碳( C O Q ) 恒温箱、 普通冰箱及低温冰箱、 离心机及离心管、 组织研磨器、 孔径。 . 2 h e m的微孔滤膜、 普通光学显微镜。3 . 1 . 2 试剂: R P M1 1 6 4 0 营养液、 犊牛血清、 青霉素( 1 0 I U / m l ) 与链霉素( 1 0 0 p g / m L ) 溶液, 7 . 5 %碳酸氢钠溶液等。3 . 1 . 3 细胞培养物: 猪原代肺泡巨噬细胞培养物( P A M) 或MA R C-1 4 5 或H S 2 H细胞。 P A M 由无P R R S 猪获取， 并经批次检验合格， 制备和检验方法见附录 B . MA R C - 1 4 5 或H S 2 H细胞由国家指定单位提供3 门. 4 样品3 . 1 . 4 . 1 样品的采取和送检: 在发病早期， 无菌地采取病猪的血清或腹水 对病死猪( 如流产的死胎) 和扑杀猪( 如弱胎猪) ， 应立即采取肺、 扁桃体和脾等组织数小块， 置冰瓶内立即送检。不能立即检查者， 应放一2 5 C 一一 3 0 C 冰箱中， 或加5 0 % 甘油生理盐水, 4 保存送检3 . 1 . 4 . 2 样品的处理: 血清和腹水可直接使用。 肺、 脾和扁桃体等组织可单独使用， 也可混合后使用。 各组织剪碎后研磨成糊状， 加入R P M 1 1 6 4 0 营养液， 制成1 0 % 悬液， 3 0 0 0 X g 离心1 5 m i n ， 吸取上 清液， 加入 青霉素5 0 0 I U / m l 、 链霉素5 0 0 v g / m l国家质t技术监督局2 0 0 0 一 0 4 一 2 6 批准、 庆大霉素5 0 0 p g / m l和两性霉素B 2 0 0 p g / m 1 。 怀疑有细菌 2 0 0 0 一 1 0 一 0 1 实施免费标准下载网( w w w . f r e e b z . n e t )免费标准下载网( w w w . f r e e b z . n e t ) 无需注册 即可下载G B / r 1 8 0 9 0 -2 0 0 0污染的样品， 也可用0 . 2 p m微孔滤膜过滤处理3 . 2 操作方法3 . 2， 稀释样品: 取 9 6 孔细胞培养板每孔加入细胞培养液R P M1 1 6 4 0含犊牛血清 l o 0 o , 青霉素1 0 0 I U / m I 、 链霉素1 0 0 p g / m L 、 庆大霉素5 0 p g / m I 、 两性霉素B 1 0 p g / m L , p H =7 . 2 ) 9 0 p .L ， 在A l 和C 1 孔内加人同一 份已处理的样品各1 0 p L ( 样品l o x 稀释) 。 将板轻轻摇动后， 从A l 和C 1 排孔各取1 0 L L 分别移入B I 和D l 排孔内( 样品l o o x 稀释) 。 除第6 和第1 2 列留作正常细胞对照外， 其他各孔的样品稀释方法同上。振动稀释板后加盖， 置4 C 冰箱内保存备用。3 . 2 . 2 制备细胞板: 已建立的某些猴肾细胞系不能支持所有分离物特别是欧洲型病毒株的良 好生长，因此病毒分离应首选 P A M 细胞， 先将P A M细胞泥用细胞培养液 R P M1 1 6 4 0稀释， 使细胞终浓度为1 X 1 0 细胞/ m L 。 或将MA R C - 1 4 5 或H S , H细胞用ME M细胞营养液稀释， 细胞终浓度为5 X1 0 细胞/m l 。然后， 在另一块9 6 孔细胞培养板上每孔加入上述细胞悬液1 0 0 V L , 按照土述操作， 每板可检测2 0 份样品， 每份样品重复2 个滴度第6 和第1 2 列留作正常细胞对照( 不接种样品)3 . 2 - 3 接种样品: 由样品稀释板每孔内各吸取稀释的样品液5 0 p L ， 接种于已形成细胞单 层的细胞板相应的孔内( 第一代) 。 细胞板加盖后， 放入3 7 0C 5 % 二氧化碳保湿恒温箱中 培养， 每天观察致细胞病变作用( C P E ) ， 连续观察2 d -5 d , C P E通常在接种后1 d - - 4 d 内出现， 主要呈现细胞圆 缩、 聚集、 固缩， 最后溶解脱落3 . 2 . 4 培养物盲传: 根据第一代培养物C P E出现的情况( 通常在接种后的第2 d - - 3 d ) 安排盲传。 盲传时， 不论C P E有无， 一律各取孔内 混悬液2 5 P L ， 移入新细胞板相应的孔内。 再于3 7 0C 5 环 二氧化碳保湿恒温箱中培养2 d -5 d ， 每夭观察C P E .13 结果的判断和解释 在第二代培养结束时， 不论是否出现C P E ， 对所有的孔必须采用免疫过氧化物酶单层试验Q P MA )或间 接免疫荧光试验Q F A ) 进行终判; 只 要对P R R S 病毒阳 性血清呈现阳 性反应， 则被认定为P R R S 病毒分离阳性。4 免疫过氧化物酶单层试验( I P MA )41 材料准备4 门门器材 微量移液器、 倒置显微镜等。4 - 1 . 2 试剂4 . 1 - 2 . 1 I P MA诊断板的制备: 见附录B o4 . 1 . 2 . 2 标准阳性血清、 标准阴性血清和兔抗猪过氧化物酶结合物均由国家指定单位提供。使用前按说明书规定用血清稀释液稀释至工作浓度4 . 1 . 2 . 3 洗涤液、 血清稀释液和显色/ 底物溶液依照附录A自 行配制4 . 1 . 3 样品: 采集被检猪血液 分离血清， 血清必须新鲜透明不溶血无污染， 密装于灭菌小瓶内， 4 C 或一 3 0 C 冰箱保存或立即送检。试验前将被检血清统一编号， 并用血清稀释液作2 0 倍稀释4 . 2 操作方法 参照图 I免费标准下载网( w w w . f r e e b z . n e t )免费标准下载网( w w w . f r e e b z . n e t ) 无需注册 即可下载G B / T 1 8 0 9 0 - - 2 0 0 0庆门 厂 歹压， s ss s玉 翻 一 巨 口 巨二 巨二巨 一【 下 门 厂 P 1巨 井S 71飞 三 压 刃 巨 巨习 巨 口 二巨 二巨 一I 吓门 巨 二 二 厂 二 二 巨 巨二 巨 卫巨 二 l 一压二 区二 巨二 二 二 二 巨 ; 巨 口【 二 二 二巨口S 2巨 石 S 2仁二 二仁口 【 二 口 巨 口 口巨 二巨匡习3区二 【 二一 巨二 巨二 匡 巨 二 匡 二巨二 巨习匹 刃 巨 夏 匡 三 二 二巨 卫 巨 匕二 三仁 二巨 二巨卫巨5S 5 一匹至 二仁 L 二 二 一巨口二匕 仁 二仁 二ABCDEFGHV , V w V V w V V V V V , V V - -感染P R R S 病毒的细胞列戊一 未感染P R R S 病毒的细胞列; C 一空白 对照孔出一标准阳性血清对照孔; N 一 标准阴 性血清对照孔; S 1 , S 2 , S 3 等一被检血清编号 图1 I P MA和I F A诊断板加样示意图4 . 2 . 1 取已 作2 0 倍稀释的被检血清加入I P MA诊断板同一排相邻的2 个病毒感染细胞孔( V ) 及其后的1 个未感染细胞孔( V - ) 内( 参照图1 ) ， 每孔5 0 P L ， 同时设立标准阳性血清、 标准阴 性血清和空白对照， 以血清稀释液代替血清设立空白 对照. 封板并于4 条件下过夜。4 . 2 . 2 弃去板中液体， 用洗涤液洗板 3 次， 每孔 1 0 0 p L ， 每次1 m i n -3 m i n ， 最后在吸水纸上轻轻拍干。4 . 2 . 3 每孔加人工作浓度的兔抗猪过氧化物酶结合物5 0 p L ， 封板后放在保湿盒内于3 7 C 恒温箱中感作6 0 m i n .4 . 2 . 4 弃去板中液体， 洗涤三次， 方法同4 . 2 . 2 ,4 . 2 - 5 每孔加入显色/ 底物溶液5 0 I L ， 封板于室温( 1 8 C -2 4 C ) 下感作3 0 m i n ,4 . 2 . 6 弃去板中液体， 洗涤 1 次， 方法同4 . 2 . 2 ， 再用三馏水洗涤2 次， 最后在吸水纸上轻轻拍干， 待检。4 . 3 结果判定与解释 将I P MA诊断板置于倒置显微镜下判读。在对照标本都成立的前提下， 即空白对照感染细胞孔( P V, ) 和未感染细胞孔( P V- ) 均应为阴性反应; 标准阳性血清对照感染细胞孔( P V ) 应呈典型阳性反应， 未感染细胞孔( P V - ) 应为阴性反应; 标准阴性血清对照感染细胞孔( N V ) 和未感染细胞孔( N V - ) 均应呈阴性反应; 被检血清未感染细胞孔( V - ) 不应出现阳性反应。被检血清标本的细胞浆( 可能仅见于部分细胞) 出现弥漫状或团 块状棕红色着染者， 判读为免疫过氧化物酶单层试验阳 性， 记作I P MA( +) ; 无棕红色着染者， 判读为免疫过氧化物酶单层试验阴 性， 记作I P MA ( 一) 。 I P M A( +) 者表明被检猪的血清中含有P R R S 病毒的抗体。5 间接免疫荧光试验( I F A )5 . 1 材料准备5 门门器材: 荧光显微镜、 恒温箱、 保湿盒、 微量移液器等5 . 1 . 2 试剂5 . 1 - 2 . 1 I F A诊断板的制备: 见附录B .5 . 1 . 2 . 2 兔抗猪异硫氰酸荧光黄( F I T C ) 结合物、 标准阳性血清和标准阴性血清， 由国家指定单位提供5 . 1 . 3 样品: 采集被检猪血液， 分离血清， 血清必须新鲜、 透明、 不溶血、 无污染， 密装于灭菌小瓶内, 4 C或一3 0 冰箱保存或立即送检。 试验前将被检血清统一编号， 并用P B S 液作2 。 倍稀释5 . 2 操作方法5 . 2 - 1 取I F A诊断板， 编号， 弃去板中的乙醇溶液， 置超净工作台中风干， 每孔加1 0 0 FA- P B S 液洗-次， 弃去P B S 液并在吸水纸上轻轻拍干。免费标准下载网( w w w . f r e e b z . n e t )免费标准下载网( w w w . f r e e b z . n e t ) 无需注册 即可下载G B / T 1 8 0 9 0 -2 0 0 05 . 2 . 2 在编号对应的孔内加入2 0 倍稀释的被检血清: 同一排相邻的感染细胞孔 2 个及其后无感染细胞孔 1 个， 每孔1 0 0 川 ， 同时做标准阴、 阳性血清及空白对照， 空白对照是用P B S 液代替血清。置3 7 C恒温箱中感作4 5 m i n ,5 - 2 . 3 弃去 板中 血清， 用P B S 液洗板4 次， 每孔1 0 0 t L ， 每次3 m i n ， 最后在吸水纸上轻轻拍干。5 . 2 . 4 每孔加入工作浓度的兔抗猪F I T C结合物5 0 P I ， 在3 7 C 恒温箱中感作4 5 m i n5 . 2 . 5 弃去板中结合物， 同5 . 2 . 3 方法洗涤 3 次后， 最后在吸水纸上 轻轻拍干5 . 3 荧光显微镜检查及判定与解释 荧光显微镜采用蓝紫光( 激发滤板通常用B G , 2 ， 吸收滤板用O G , 或G G g ) ， 在5 倍一1 0 倍目 镜下检查 标准阳性血清对照中感染细胞孔( P V 十 ) 应出现典型的特异性荧光， 而未感染细胞孔( P- V - ) 不应出现特异性荧光; 标准阴性血清对照、 空白对照中感染细胞孔( N- V ) 和未感染细胞孔( N- V- ) 均不应出现特异性荧光; 被检血清对照中未感染细胞孔( C V - ) 不应出现特异性荧光。被检血清样品感染细胞孔( N- V ) 出现特异性胞浆亮绿荧光的判为阳性; 否则， 判为阴性6 间接酶联免疫吸附试验( 间接E L I S A )6 门材料准备6 . 1 . 1 器材: 9 6 孔平底微量反应板、 微量移液器、 酶标测定仪、 恒温箱、 保湿盒等。6 . 1 . 2 试剂6 . 1 . 2 . 1 P R R S 病毒抗原和正常细胞对照抗原， 由国家指定单位提供。 使用前， 按说明书规定用抗原稀释液稀释至工作浓度6 . 1 . 2 . 2 免抗猪坛 G辣根过氧化物酶结合物( 简称酶标抗体) 由国家指定单位提供。 使用前按说明书规定用血清稀释液稀释至工作浓度。6 . 1 . 2 . 3 P R R S 病毒标准阳性血清和标准阴性血清， 由国家指定单位提供。 使用前按说明书规定用血清稀释液稀释至工作浓度。6 . 1 . 2 . 4 抗原稀释液、 血清稀释液、 洗涤液、 封闭液、 底物溶液、 终止液等， 依照附录A自 行配制6 . 1 . 3 样品 采集被检猪血液， 分离血清， 血清必须新鲜、 透明、 不溶血、 无污染， 密装于灭菌小瓶内， 4 C或一3 0 C 冰箱保存或立即送检。试验前将被检血清统一编号， 并用血清稀释液作2 0 倍稀释。6 . 2 操作方法 参照图2GH吓门 厅不 医一 压3 厂 二 巨 厂 刁 匡 口 巨 厂 门 巨 二 口巨二 国画国 二口巨 二 口口口 口口巨二 巨二巨习巨4 仁二I二 二 二巨 二【 二仁 口 司1 N 二【 S 4 卫匡4 巨卫巨 口巨 巨 口巨 口巨二 【 二巨 口压扩 1 S 1S 5 S 5 下 厂 门 匡口 【二 口 厂 刃 巨 仁二下t 斤犷压习【 S S 二巨口厂 刃 巨 二巨 口巨 二 二仁 二 S 2 1 S 2巨 3 6压6 仁二 口巨 巨 口巨 口巨 二 口巨 二! S 2 二S 2国画 巨二口巨 二 口口口 口口V C V C V G V G V C V(6 . 2 . 1照杭原夜6 . 2 . 2 V 一为P R R S 病毒抗原包被列; C 一正常细胞抗原包被列; P -标准阳 性血清对照孔; N -标准阴性血清对照孔; S 1 , S 2 , S 3 等一被检血清编号 图2 间接E L I S A诊断板加样示意图包被抗原: 取9 6 孔平底微量反应板， 于奇数列加工作浓度的病毒抗原， 偶数列加工作浓度的对梅孔1 0 0 讨 _ ( 参照图2 ) ， 封板， 置 保湿盒内放3 7 C 恒温箱中感作 6 0 m i n ， 再移置4 冰箱内过洗板 弃去板中包被液， 加洗涤液洗板， 每孔 1 0 0 k L ， 洗涤3 次， 每次 1 m i n 。在吸水纸上轻轻拍免费标准下载网( w w w . f r e e b z . n e t )免费标准下载网( w w w . f r e e b z . n e t ) 无需注册 即可下载G B / T 1 8 0 9 0 -2 0 0 0千。6 . 2 . 3 封闭: 每孔加入封闭液1 0 0 I. L ， 封板后置保湿盒内于3 7 C 恒温箱中感作6 0 m i n6 . 2 . 4 洗涤: 方法同6 . 2 . 2 ,6 . 2 . 5 加血清: 反应板按图2 编号后， 对号加入已 作稀释的被检血清、 标准阳性血清和标准阴性血清每份血清各加2 个病毒抗原孔和2 个对照抗原孔， 孔位相邻。 每孔加样量均为1 0 0 u L 。 封板， 置保湿盒内于 3 7 0C 恒温箱中感作 3 0 mi n ,6 . 2 . 6 洗板: 方法同6 . 2 . 2 ,6 . 2 . 7 加酶标抗体: 每孔加工作浓度的酶标抗体 1 0 0 p L ， 封板， 放保湿盒内置 3 7 C 恒温箱中感作3 0 mi n ,6 . 2 . 8 洗板: 方法同6 . 2 . 2 ,6 . 2 . 9 加底物: 每孔加人新配制的底物溶液1 0 0 u L ， 封板， 在3 7 C 恒温箱中 感作1 5 m i n ,6 . 2 - 1 0 加终止液: 每孔添加终止液1 0 0 P L终止反应。6 . 3 光密度( O D ) 值测定与计算6 . 3 . 1 O D值测定: 在酶标测定仪上用A =6 5 0 r a n 读取反应板各孔溶液的O D值， 记入专用表格。6 . 3 . 2 O D值计算 按下式分别计算标准阳性血清、 标准阴性血清和被检血清与2 个平行抗原孔反应的O D值的平均值。 标准阳性血清( P ) 与病毒抗原( V ) 反应的均值P V ( O D s , a ) 按式( 1 ) 计算: P V ( 0 D _) 一 A l ( O D _) +B I ( O D s s o ) / 2 ( 1 ) 标准阳性血清( P ) 与对照抗原( C ) 反应的均值P C ( O D -) 按式( 2 ) 计算: P C ( O D e s o ) =仁 A 2 ( O D s s o ) +B 2 ( O D _) 1 / 2 ( 2) 标准阴性血清( N ) 与病毒抗原( V ) 反应的均值N V ( O D . . . ) 按式( 3 ) 计算: N V ( O D _) 二仁 C l ( O D -) +D l ( O D s s o ) 1 / 2 ( 3 ) 被检血清( S ) 与病毒抗原( V ) 反应的均值S V ( O D s s o ) 按式( 4 ) 计算: S V ( O D _) 二 E l ( O D s w ) +F l ( O D s s o ) 1 / 2( 以S 1 血清为例) ， ( 4 ) 被检血清( S ) 与对照抗原( C ) 反应的均值S C ( O D s s o ) 按式( 5 ) 计算: S C ( O D s s o ) = E 2 ( O D 6 s o ) +F 2 ( O D s s o ) / 2( 以S 1 血清为例) ( 5)6 . 3 . 3 按式( 6 ) 计算被检血清O D值与标准阳性血清O D值的比 值S / P , S / P= S V ( O D _) 一S C ( O D _) 1 / P V ( 0 D _) 一P C ( O D 6 , o ) ( 6 )6 . 4 结果的判定与解释6 . 4 . 1 有效性判定: P V ( O D . . . ) 与N V ( O D -) 的差值必须大于或等于。 . 1 5 。 时， 才可进行结果判定。否则， 本次试验无效。6 . 4 . 2 判定标准与解释 a ) S / P比值小于0 . 3 ， 判定为P R R S病毒抗体阴性， 记作间接E L I S A( 一) 。 b ) S / P比 值大于或等于。 . 3 ， 小于。 . 4 ， 判定为疑似， 记作间 接E L I S A ( 士) 。 C ) S / P比值大于或等于。 . 4 ， 判定为P R R S 病毒抗体阳性， 记作间接E L I S A ( + ) 间 接E L I S A ( 十) 者表明 被检猪血清中 含有P R R S 病毒抗体。了 血清中和试验( S N )7 . 1 材料准备7 . 1 . 1 器材: 9 6 孔细胞培养板、 微量移液器、 二氧化碳( C O O 恒温箱、 倒置显微镜等。7 . 1 . 2 病毒: 美洲标准株A T C C V R - 2 3 3 2 或欧洲标准株L V， 由国家指定单位提供。使用前按附录C方法滴定病毒效价后， 用含2 0 % 健康猪新鲜血清的E ME M营养液( p H 7 . 2 ) 将其稀释至2 0 0 T C I D , o /免费标准下载网( w w w . f r e e b z . n e t )免费标准下载网( w w w . f r e e b z . n e t ) 无需注册 即可下载G B / T 1 8 0 9 0 -2 0 0 02 5 M L作为工作病毒液7 . 1 . 3 细胞: MA R C - 1 4 5 或H S , H传代细胞， 由国家指定单位提供。 使用时， 用细胞分散液消化、 分散细胞， 计数， 再用E M E M营养液( 含犊牛血清1 0 y o ， 青霉素1 0 0 I U / m L ， 链霉素1 0 0 p g / m L , p H =7 . 2 )稀释至1 0 细胞/ m L .7 . 1 . 4 试剂7 . 1 . 4 . 1 P R R S 病毒标准阳性血清和标准阴性血清， 由国家指定单位提供， 使用前经5 6 灭活3 0 m i n ,并按说明书规定进行稀释。7 . 1 . 4 . 2 健康猪新鲜血清 无菌采自3 -8 月龄的无P R R S的健康猪， 可于一7 0 低温冰箱保存。 使用时不灭活7 . 1 . 5 样品: 无菌采集被检猪血清， 血清必须新鲜、 透明、 无溶血、 无污染， 密装于灭菌小瓶内， 4 保存或立即送检， 检9 11 前经5 6 灭活3 0 m i n 。 由于中和抗体产生稍晚， 故该血清以在疾病中后期或病毒感染后2 一3 周时采集为宜。7 . 2 操作方法 参照图 31 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0 1 1 2ARGH阵 刃 ，厂 勺厂节 厂 二 巨 口 r当 巴 竺 【 二泣 二 泣二 I二阵钾 一州 厂 一 广， 厂 ， 厂刁 巨二 二 二仁二 【 二 二 习S 2门 门 口口口 国 口 口巨二 巨二巨二S 2 ，厂， 厂下厂 下 门 1 N 口【 二【 二 二 仁二【 二 口S 3门 门 曰 门已 )门1 0 0国口压 勺亡 二户犷 一广 l一 一 厂 门 【 ， 1 1 0 0 一 1 0 丁 L 4 刃 二S 4门 口 口 口 口 口1 0 0画 口 回 二S 0 二 二 巨二仁二 巨口I二) 口1 0 0巨= 1仁口 巨国 二 被检血清毒性对照 细胞对照 病毒对照 细胞对照 P 一标准阳性血清对照; N 一标准阴性血清对照; S 1 , S 2 , S 3 等一被检血清编号; 1 0 0 , 1 0 , 1 , 0 . 1 -病毒浓度T C I D , , 图3 血清中和试验第1 块板加样示意图7 . 2 . 1 加营养液: 取9 6 孔细胞培养板， 编号， 于各血清检测孔内加入E ME M营养液( 含 1 0 %犊牛血清, 1 0 0 I U / m l ， 青霉素、 1 0 0 p g / m L链霉素, p H =7 . 2 ) 2 5 p L ， 细胞对照区各孔加5 0 p L ， 病毒对照区各孔不加( 参照图3 ) ,了2 - 2 加被检血清: 以单头微量移液器精确吸取已作灭活处理的被检血清， 在各排头两孔各加入2 5 1, 1 - 。 每份被检血清须平行安排两排， 即每个稀释度两孔。7 . 2 . 3 稀释被检血清: 从第2 列开始依次向后将被检血清作倍比 稀释， 使第2 , 3 , 4 , 5 , 6 列孔的血清稀释倍数依次为2 , 2 , 2 , 2 , 2 。稀释时， 用8 头微量取样器先在第2 列孔内吹吸数次， 充分混匀后吸取2 5 川移入第3 列， 同前混匀后取2 5 p L 移入第4 列， 以下依次进行。 当 第6 列各孔混匀后， 各吸取2 5 川 -弃去。稀释过程中切勿产生气泡。7 . 2 . 4 稀释对照血清: 同7 . 2 . 3 法进行标准阳性血清和标准阴性血清稀释。7 . 2 . 5 加病毒液: 除血清毒性对照、 病毒对照和细胞对照外， 各孔添加用含2 0 %健康猪新鲜血清E -ME M营养液， 将病毒液稀释成2 0 0 T C I D s o / 2 5 p L的工作病毒液2 5 p L o7 . 2 . 6 病毒对照: 取灭菌试管4 支， 用2 0 0 0 健康猪新鲜血清E ME M营养液( p H 7 . 2 ) 将病毒液稀释至含毒量为2 0 0 T C I D s o / 2 5 p L , 2 0 T C I D s a / 2 5 p L , 2 T C I D 5 o / 2 5 p L 和0 . 2 T C I D , o / 2 5 44 个滴度， 然后参照图3 各取2 5 p L加入相应的孔内( 每个滴度4 个孔) ， 再于各孔内加入2 5 p L 2 倍稀释的标准阴性血清。 此时， 病毒浓度分别降为1 0 0 T C I D , , / 2 5 p L , 1 0 T C I D , , / 2 5 p I1 T C I D , , / 2 5 p I 和0 . 1 T C I D , o / 2 5t l7 . 2 - 了 中和感作: 将培养板放入3 7 -C 的5 %二氧化碳保湿恒温箱中感作6 0 m i n ,免费标准下载网( w w w . f r e e b z . n e t )免费标准下载网( w w w . f r e e b z . n e t ) 无需注册 即可下载G B / T 1 8 0 9 0 - - 2 0 0 07 . 2 . 8 添加细胞: 于每孔内 加入配制好的M A R C - 1 4 5 或H S , H细胞悬液5 0 IA -7 . 2 . 9 培养: 封板后， 放入3 7 C的5 %二氧化碳保湿恒温箱内培养了 . 3 观察与记录 在倒置显微镜下逐孔观察致细胞病变作用( C P E ) 。每天观察一次， 连续观察5 夭， 并将观察结果记入专用登记表内 P R R S病毒在MA R C - 1 4 5 或H S , H细胞上生长， 引起的C P E七 要是 细胞圆缩、 聚集、固缩， 最后溶解脱落7 . 4 中和效价计算和结果判定 在各对照组符合下述要求时， 本次中和试验才成立 a ) 病毒对照: 病毒浓度为。 . 1 T C I D , 。 的各孔不应出现任何C P E , 1 0 0 T C I D , 。 的各孔均应出现C P E b ) 血清毒性对照: 相当于试验中最低稀释度( 本标准中为2 倍) 的被检血清对细胞应没有任何毒性作用。 c ) 细胞对照: 在整个试验中应一直保持良好的形态和特征。 d )阳性血清对照: 试验中所显示的能抑制C P E出现的血清最高稀释度不应比其已知滴度差 1 个滴度以上。 e )阴性血清对照: 各稀释度均应出现C P E , 对被检血清的中和效价进行计算。 其血清中和效价为能抑制平行两孔或两孔中一孔出现C P E的血清最高稀释倍数的倒数。 血清中和效价大于或等于1 : 4 ， 判定为血清中和试验阳性， 记作S N ( +) ; 小于1 : 4 ， 判为阴性， 记作S N ( 一) 。 S N( +) 表示被检猪血清中含有P R R S 病毒抗体8 综合判定 当在临床上怀疑有P R R S 病毒感染时， 可根据实际情况， 由上述五种方法中选用一 种或两种方法进行确诊 对于未接种过P R R S 疫苗或已超越疫苗免疫期的猪， 经任何一种方法检测呈现阳性结果时，都可最终判定为P R R S 病毒感染猪。对接种过P R R S灭活疫苗并在疫苗免疫期内的猪， 当病毒分离鉴定试验为阳性结果时， 可终判为P R R S 病毒感染猪; 当仅血清学试验呈阳性结果时， 应结合病史和疫苗接种史进行综合判定， 不可一律视为P R R S 病毒感染猪。免费标准下载网( w w w . f r e e b z . n e t )免费标准下载网( w w w . f r e e b z . n e t ) 无需注册 即可下载G B / T 1 8 0 9 0 -2 0 0 0 附录A ( 标准的附录)血清学试验中试剂的配制A l P B S 液( 0 . 0 1 m o l / L P B S , p H =7 . 2 ) 用于I F A氯化钠( N a C l )氯化钾( K C I )碳酸氢钠( N a H C O , )磷酸几氢钾( K H , P O , )三蒸水加至保存于 4 C备用。8 g ;0 . 2 g ;1 . 1 5 g ;0 . 2 g ;1 0 0 0 mL;A 2 洗涤液( 0 . 0 1 m o l / L P B S - 0 . 0 5 %吐温- 2 0 , P H=7 . 4 ) 用于I P MA和间接 E L I S A 磷酸二氢钾( K H 2 P O , ) 0 . 2 g ; 磷酸氢 几 钠( N a , H P O , 1 2 H( ) )2 . 9 g ; 氯化钠( N a C l ) 8 . 0 g ; 氯化钾( K C I) 0 . 2 g ; 吐温- 2 0 0 . 5 m L; 三蒸水加至1 0 0 0 m l - 现用现配。A 3 抗原稀释液C O . 0 5 m o l / L碳酸盐缓冲液, p H 9 . 6 ) 用于间接E L I S A 碳酸钠( N a , C O)1 . 5 9 g ; 碳酸氢钠( N a I I C O , ) 2 . 9 3 g ; 一 三 蒸水加至1 0 0 0 m L , 4 c 保存，一 周内用完。A 4 血清稀释液 用于I P M A和E L I S A 为 含1 %犊牛血清的“ A l ” 液。A 5 封闭液用于间接E L I S A 为含1 鲜犊牛血清白蛋白或1 0 %马血清的“ A 1 液。A 6 显色/ 底物溶液用于 I P MAA 6 . 1 A E C贮存液 称取氨乙基咔哇( 3 - a m i n o -m a m i d e ) 4 m l中， 充分溶解后置A 6 . 2 乙酸钠溶液 乙酸钠( C H, 0 0 0 N a ) 加气馏水至 用冰乙酸调整至p H=5 . 。 。9 - e t h y l - c a r b a z o l e , A E C ) 4 m g 溶于二甲 基甲酞胺( N , N - d i m e t h y - f o r4 0C 避光保存4 . 1 5 g ;1 0 0 0 ml ,免费标准下载网( w w w . f r e e b z . n e t )免费标准下载网( w w w . f r e e b z . n e t ) 无需注册 即可下载G B / T 1 8 0 9 0 -2 0 0 0A 6 . 3 乙酸盐缓冲液 冰乙酸( C H B C O O H) 1 4 . 8 mL ; 乙酸钠溶液3 5 . 2 m L ; 三馏水5 0 . 0 m L ; 充分混匀。A 6 . 4 显色/ 底物溶液( A E C - H 2 0 2 ) 乙酸盐缓冲液1 9 m L ; A E C贮存液1 ML ; 3 0 %过氧化氢( H z 0 2 ) 0 . 0 6 7 m L ; 充分混合后装于褐色玻璃瓶内避光存放。 现用现配。A 7 底物溶液用于间接E L I S AA T 1 。 1 M O O 柠檬酸溶液 柠檬酸( C , H a 0)1 . 9 2 g ; 加三馏水至1 0 0 m LA 7 . 2 0 . 1 m o l / I磷酸氢二钠溶液 磷酸氢二钠( N a , H P O , 1 2 H 2 0 ) 3 . 5 8 9 ; 加三馏水至1 0 0 m l _A 7 . 3 底物溶液( T MB - H , O , ) 。 . 1 m o l / L柠檬酸溶液3 3 . 0 m L ; 。 . 1 m o l / L磷酸氢二钠溶液6 6 . 0 m L ; 四甲 基联苯胺( T M B ) 4 0 . 0 m g ; 3 0 %过氧化氢( H A ) 1 . 5 m L ; 充分混合后装于褐色玻璃瓶避光存放。现用现配。A 8 终止液用于间接E L I S A 1 m o l / L氢氟酸( H F ) 溶液。 附录B ( 标准的附录)猪肺泡巨噬细胞( P A M) 制备、 鉴定、 保存与复苏B 1 试剂准备B 1 门磷酸盐缓冲盐水( P B S ) a ) 原液 甲 氯化钠( N a C I ) 8 . 0 0 g ; 氯化钾( K C U 0 . 2 0 g ; 磷酸氢二 钠( N a 2 H P 0 , ) 1 . 1 5 g ; 磷酸二氢钾( K H 2 P O , ) 0 . 2 0 g . 溶于5 0 0 m l三馏水中， 再加人5 m L 0 . 4 0 0 酚红液 b ) 原液乙 1 1 2， 加三馏水至8 0 0 m L, 5 6 k P a 2 0 m i n灭菌备用。免费标准下载网( w w w . f r e e b z . n e t )免费标准下载网( w w w . f r e e b z . n e t ) 无需注册 即可下载G B / T 1 8 0 9 0 -2 0 0 0氯化镁( Mg c l z 6 H , O )加三馏水至0 . 1 g;1 0 0 mL 5 6 k P a 2 0 m i n 灭菌备用。 c )原液丙 氯化钙( C a C l , ) 0 . 1 g 溶于1 0 0 m l三馏水中， 5 6 k P a 2 0 m i n灭菌备用 d ) 工作液 原液甲8 份; 原液乙1 份; 原液丙1 份。 充分混合后备用。 必要时， 可适量加入抗生素( 青霉素1 0 I U / m L , 链霉素1 0 v g / m l 、 庆大霉素1 0 K g / m L ) ， 不 加 制 霉菌 素。B 1 . 2 细胞生长液 含 1 0 % 犊牛血清的R P M1 1 6 4 0 营养液( 含青霉素 1 0 0 I U / m L , 链霉素1 0 0 p g / m l 、 庆大霉素5 0 tz g / ml ) 。B 1 . 3 细胞冻存液 取细胞生长液8 . 0 in ， 加人分析纯二甲基亚矾( D MS O ) 2 . 0 m L ， 混合均匀。 不加制霉菌素。B 2 P A M的制备 取4 -8 周龄的S P F猪或被证实无P R R S 病毒感染的健康猪， 动脉放血致死后， 立即无菌操作取出肺， 切勿划破被膜。 每次用约2 0 0 m L P B S 液从气管灌人肺. 挤压灌洗3 -4 次， 收集灌洗液, 1 0 0 0 X g 离, L 1 0 m i n ， 得到的巨噬细胞泥用P B S 液再悬浮和离心洗涤2 -3 次。 最后的细胞泥用5 0 m L细胞生长液悬浮， 进行细胞计数， 用细胞生长液稀释使细胞浓度达4 X1 0 / 1 . 5 m L 。所得新鲜巨噬细胞立即应用或定量分装后冻存B 3 P A M的冻存 取细胞浓度为8 X 1 0 / 1 . 5 m L的细胞悬液， 加入等量细胞冻存液， 缓慢滴加， 边加边振摇。 加毕， 立即用聚苯乙烯管分装， 每管 1 . 5 m l ， 放一7 0 过夜， 转人液氮中保存。 液氮保存各批巨噬细胞， 不可混合。B 4 P A M的批次试验 侮批巨噬细胞应检验合格后再使用。 方法是， 在9 6 孔细胞培养板上用已 知滴度的标准病毒感染巨噬细胞， 并用标准的阳性血清和阴性血清进行I P MA或I F A测定。只有能支持特定滴度的标准病毒良好生长的巨噬细胞， 方可用于试验。B 5 P A M的复苏 从液氮中取出冷冻细胞管， 立即投入温水( 3 8 左右) 中迅速解冻。 将细胞移入1 0 倍量的R P -MI 1 6 4 0 营养液( p H = 7 . 2 ) 中， 1 0 0 o x g 离心1 0 m i n ， 弃去上清液， 沉淀的细胞用细胞生长液悬浮， 计数，稀释至要求的细胞浓度后， 即可使用。B 6 I P M A诊断板的制备 用细胞分散液消化Ma r c - 1 4 5 或H S 2 H细胞， 用细胞营养液稀释成5 X1 0 4 细胞/ m l ， 加人P R R S美洲或欧洲标准毒 使其最终浓度为1 0 0 T C I D , 杯 2 5 I L , 混合后接种9 6 孔细胞培养板1 , 2 , 4 , 5 , 7 , 8 , 1 0 ,免费标准下载网( w w w . f r e e b z . n e t )免费标准下载网( w w w . f r e e b z . n e t ) 无需注册 即可下载G