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文档简介
代谢工程,定义:藉某些特定的生化反应的修饰来定向改善细胞的特性或运用重组DNA技术来创造新的化合物。 代谢工程的要素:将分析方法运用于物流的定量化,用分子生物技术来控制物流以实现所需要的遗传改造。,术语,途径:催化总的代谢物的转化,信息传递和其他细胞功能的酶反应的集合 物流(通量):物质或信息通过途径被加工的速率 物流控制系数(flux control coefficient, FCC):用物流百分比变化除以一酶活的百分比变化,术语,弹性系数:酶催化反应速率对代谢物浓度的敏感性,是个别酶的特征 物流分担比:途径A与途径B之比 节点(node):将细胞的生化反应以网络整体来考虑,而不是孤立地来考虑。将代谢网络分流处的代谢产物称为节点,对终产物合成起决定作用的少数节点称主节点。,代谢物流的定量是代谢工程的重要分析技术,尤其与代谢物的生产研究有关 目标是使尽可能多的碳从基质流向代谢产物。 代谢物流分析是一种定量计算通过各种途径的物流的强有力的技术。,代谢(物)流分析(MFA),用于代谢物流分析的方法是一种适用于所有主要胞内反应的化学计量模型和围绕胞内代谢物的物料平衡。 输入到计算中的是一套测量的物流,典型的有基质吸收速率和代谢物的分泌速率。如用富集C13的碳源做试验和测量胞内代谢物富集的C13部分再加上一套模型的限制条件,便可如愿地测量胞内物流。最后,还可将有关同位素分布的信息用于获得更多有关胞内代谢物的信息。,代谢物流分析的应用: (1)定量各途径物流(测量流入和流出细胞的碳) 用化学计量模型和测得的物流计算代谢物的生产速率。 (2)鉴别细胞途径中的刚性分支点(节点) 通过比较不同突变株和不同操作条件下各途径的物流分布可以鉴别途径的节点是刚性还是柔性。,(3)不同途径存在的鉴别 通过计算不同细胞途径的代谢物流可以鉴别哪些途径很可能存在,并获得有关同工酶或途径功能的信息。 (4)非测量所得的胞外物流的计算 被测量物流数目胞内物流数目,(5)考察另一些途径对物流分布的影响 可做一些设想,如插入一条新途径或同功酶(或将其消除)是否具有消除该限制的积极效果,从而引起所需物流的增加。,(6)最大理论得率的计算 基于化学计量模型,如已知各种限制条件,便可以计算一已知代谢物的最大理论得率。此值对揭示过程得率的上限有用。 此模型曾应用于棒状杆菌的Lys和产黄青霉的青霉素生产上,求得不同比生长速率下的最大青霉素理论得率,并发现,当比生长速率从0提高到0.05h-1时,理论得率急速下降。,产黄青霉的青霉素生产分析中作者发现在6-磷酸葡萄糖节点上的物流分担比 与基于葡萄糖的青霉素得率之间的相互关系。这种关系表现在青霉素的 生产需要大量的NADPH。,代谢工程的一个最为重要的方面是物流的控制。 代谢物流分析只是对不同途径的相互作用的研究和围绕支点的物流分布的定量有用,无法评估物流怎样得到控制,即代谢物的合成与转化速率如何在外部条件变化很大的情况下保持严密的平衡,而不至于引起代谢物的浓度灾难性地升高或下降。,代谢控制分析,反馈抑制、协同作用、酶的共价修饰和酶合成控制的发现,引入一些可能对控制物流有一定作用的分子效应。早期的发现认为,途径的第一个酶,分支后的第一个酶往往是速率限制步骤,受到某种类型的调节,如反馈抑制作用。,代谢控制分析则认为这类定性的观点没有多大意义,因物流控制被分布在途径的所有步骤中。只是若干步骤的物流量比其他的更大些。虽然并不排斥其中一种酶的物流控制系数可能达到1,但考虑到途径的其他的酶也要分享此物流控制系数,因此,这些酶中没有一个是真正速率限制性的。,以青霉素合成为例,在培养的第一阶段物流控制主要在途径的头一步,即由ACV合成酶(ACVS)形成三肽,LLD-ACV。随后培养物流控制移到途径的第二步,即由异青霉素N酶(IPNS)将LLD-ACV转化为异青霉素N。这种物流控制的移动是由于胞内聚积了LLD-ACV,这是ACVS的抑制剂。 显然,在此提出速率限制步骤或瓶颈的说法是没有意义的。除了物流控制的波动,途径中的物流控制大多数是由头两步实现的。此外,通过模型的分析发现,FCC值取决于溶氧浓度,它是IPNS催化反应的一种基质。,物流求和理论阐明: 酶的物流控制系数(FCC)不是哪个酶单独固有的而是系统所具有的性质。当酶的活性从很低的水平提高到很高的水平,其物流控制系数也会改变。显然,其他酶的活性虽然未变,其物流控制系数也会改变。这是因为不管酶在哪一水平,途径中的所有酶的物流控制系数之和等于1。这明显是一种相互作用,其他一些酶量的变化也会引起酶物流控制系数的改变。,FCC不是固定的,随环
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