课件：细胞杀伤活性检测兼.ppt

NK细胞杀伤活性检测 -乳酸脱氢酶释放法,石河子大学医学院免疫学教研室 2013-7-5,目的要求,熟悉乳酸脱氢酶释放法测定NK细胞杀伤活性的检测方法。,【原理】,乳酸脱氢酶 (LDH) 是活细胞胞浆内含酶之一。正常情况下，LDH不能透过细胞膜。当靶细胞受到效应细胞的攻击而损伤时，细胞膜通透性改变，LDH可释放至介质中。释放出来的LDH在催化乳酸生成丙酮酸的过程中，使氧化型辅酶(NAD+) 变成还原型辅酶(NADH2)。后者再通过递氢体-吩嗪二甲酯硫酸盐 (PMS) 还原硝基氯化四氮唑蓝(NBT)，形成有色的甲臢类化合物，在490nm或570nm波长处有一高吸收峰。利用读取的A值，经过计算即可得知NK细胞杀伤靶细胞的活性。,实验原理,效应细胞 靶细胞 释放LDH,丙酮酸,乳酸,乳酸脱氢酶(LDH),NAD+,NADH+H+,PMS,NBT,甲臢(OD570nm）,吩嗪二甲酯硫酸盐,硝基氯化四氮唑蓝,【试剂】,1. 靶细胞 检测人的NK 细胞活性常用的靶细胞为体 外传代细胞株K562。 2. 效应细胞 从人外周血（肝素抗凝）分离的单个核 细胞。 3. 1640 培养液 4. LDH 底物溶液（临用前配制） NBT 硝基氯化四氮唑蓝 4mg NAD+I 氧化型辅酶I 10mg PMS 吩嗪二甲酯硫酸盐 1mg,【试剂】,加蒸馏水2ml 溶解，混匀后取上清液1.6ml，加1mol/L 乳酸钠0.4ml，然后加入0.1mol/L pH7.4 PBS 至10ml。 5. 1% NP40 ： 取1ml NP-40 加去离子水99ml。 6. 1mol/L 柠檬酸终止液 取柠檬酸21g 加去离子水100ml,实验步骤,效应细胞的制备（分离外周血单个核细胞）,靶细胞的制备,效-靶细胞相互作用,酶促反应,结果判读,取培养2448hr的靶细胞(K562), 洗涤3次（1000rpm10min）, 最后用完全RPMI-1640培养液调整细胞浓度至1105/ml, 备用。,靶细胞的制备：,效应细胞的制备 （分离外周血单个核细胞）,采集静脉血4 ml，加0.2ml肝素溶液（125-250U/ml）抗凝,分别吸取2ml淋巴细胞分层液置10ml离心管中， 将管倾斜45，沿管壁缓缓注入抗凝血,离心2000rpm20min,密度梯度离心分离淋巴细胞亚群,用完全RPMI-1640定容细胞，计数后调整细胞浓度 （加入0.2ml完全RPMI-1640 ，混匀，1x 107）,将所得PBMC用5倍体积的1640洗涤一次 2000rpm10 min,计数PBMC,1.计数4个大方格中（即64个小方格）所有细胞数 2.计数原则：数上不数下，数左不数右。 3.总数除以4，所得数据104即为1ml液体中的细胞总数 4.每ml健康成人血可分离出11062106个单个核细胞,计数PBMC举例,数4个大方格细胞数分别为：87，79，91，85 总数为： 87+79+91+85=342 一个大方格的平均数为：342/4=85.5 1ml液体中细胞量为：85.5104 如果用染液稀释后计数，则细胞数为该数据的2倍。,效-靶细胞作用,将效应细胞和靶细胞各0.1ml(E/T=100:1)加入96孔细胞培养板的孔中, 每份标本设2个复孔, 同时设靶细胞自然释放对照组 (0.1ml靶细胞+0.1ml RPMI-1640液) 最大释放对照组 (0.1ml靶细胞+0.1ml1NP-40液), 1000r/min, 2min后, 置37、5CO2温箱中孵育2-4h。,2019/8/23,16,可编辑,【操作方法】,酶促反应 ：从37温箱中取出培养物，吸取各孔上清0.1ml 加于另一培养板孔中。,酶促反应,置37预温10min, 加入新鲜配制的底物溶液0.1ml, 37避光反应1015min。 终止酶促反应 （用毛细吸管滴一滴1mol/L柠檬酸30l）,结果计算,用酶标检测仪在570nm波长下读取各孔OD值, 并计算NK细胞活性。,实验组OD值-自然释放对照组OD值,NK细胞活性（%）,最大释放对照组OD值-自然释放对照组OD值,=,100%,1、无论采用何种试验方法, 靶细胞的质量是影响细 胞标记率、自然释放率及实验稳定性的重要因 素。一般要求靶细胞的自然释放率10。 2、分离PBMC时，应用毛细吸管尽可能吸取灰白 层，切勿搅动各层。 3、吸取细胞培养上清时, 应尽可能不吸动沉淀的细 胞。 4、用此法测得NK活性的正常值范围在10-40%。,注意事项:,实验报告,记录NK细胞杀伤实验的原理、方法、 结果。,T淋巴细胞检查,1T细胞检查 （1）T细胞花环形成试验 （Erythrocyte rosette formation test, ERFT）,E花环形成试验 （Erythrocyte rosette formation test, ERFT） 【目的要求】 1.掌握T淋巴细胞E花环试验的原理、正常值， 了解其方法和用途。 2.熟悉光镜下E花环的形态和计数方法。,【实验原理】 T细胞表面具有能与绵羊红细胞（SRBC）表面糖肽结合的受体，称为E受体（CD2）。已证实E受体是人类T细胞所特有的表面标志。当T细胞与SRBC混合后，SRBC便粘附于T细胞表面，呈现花环状。通过花环形成检查T细胞的方法，称为E花环形成试验。,根据花环形成的多少，可测知T细胞的数目，从而间接了解机体细胞免疫功能状态，判断疾病的预后，考核药物疗效等。,【实验方法】 淋巴细胞与SRBC按一定比例(1:10)混合 37 5分钟， 420分钟 取样涂片瑞氏染色、镜检。 计数E花环数，算出总花环形成率。 正常值为60%80%。,【结果观察】 高倍镜检查：淋巴细胞呈蓝色，SRBC呈红色围绕淋巴细胞形成花环，凡表面粘附有3个或3个以上SRBC者为