课件：细胞工程制药复习.ppt

第四章,细胞融合 与 单克隆抗体 Cell Fusion and Monoclonal Antibodies,细胞融合 单克隆抗体技术,第一节 细胞融合 一、细胞融合剂 二、细胞融合方式 三、细胞融合技术 四、杂种细胞的筛选,第一节 细胞融合,定义：指将不同来源的原生质体相融合，并使之分化再生、形成新物种或新品种的过程，又称为体细胞杂交,第一节 细胞融合,原理： 植物细胞-去细胞壁(酶消化) 动物细胞-分散(酶消化) -单个原生质体-诱导融合-筛选 关键：建立细胞桥,一、细胞融合剂,受体作用,电荷作用,二、细胞融合方式,完整细胞之间的融合 核体、胞质体与完整细胞的融合作用 微小细胞与完整细胞的融合 脂质体介导的细胞融合,三、细胞融合技术,生物法（病毒诱导融合） 化学法（化学剂诱导融合） 物理法（电融合）,生物法,化学法：聚乙二醇（PEG） 介导的细胞融合,原理： 促使细胞凝结 （负电荷作用） 破坏接触处细胞膜 （被洗脱）,影响因素：,分子量：40006000 浓度： 2060% （通常：3050%） pH： 偏碱为宜（pH7.48.0） 其他： 二甲亚砜、植物血凝素,原理： 细胞在电场中极化成偶极子，并排列成串，然后用高强度、短时程的电脉冲击穿细胞膜。,物理法： 细胞电融合,甜菜原生质体电融合过程,1）在高频电流电场下的相互接 2）脉冲刺激后30s 50秒后 4）1.5分钟后 5）6分钟后 6）15分钟后，原生质体融合完成。,注意事项,1）介质要求高 2）控制电压的强度和时间,优点：,融合率高 融合率（融合组多核细胞的核数对照组多核细胞的核数/对照组的全部细胞数）100 可在显微镜下定向诱导细胞融合 可直接挑选杂种细胞,原理： 两种亲本细胞融合混合物中可有多种类型细胞，筛选目的是获得优良杂种细胞。,四、杂种细胞的筛选,同核体 异核体 多核体 异胞质体 核质体,1 植物细胞筛选方式,1）遗传互补筛选法 如 亲本1： 叶绿体缺陷型 亲本2： 光致死型 融合细胞：正常,2）抗性互补筛选法 如：亲本1：放线菌素D，MS 亲本2：放线菌素D，MS 杂种细胞：放线菌素D，MS 而亲本和其它细胞死亡,3）利用物理特性筛选法 亲本1：异硫氰酸荧光素（FITC）标记 亲本2：碱性蕊香红荧光素标记 荧光显微镜下，亲本1：绿色，亲本2：红色，杂种细胞可以区分,4）利用生长特性筛选法 如粉兰烟草与朗氏烟草细胞：外源激素 融合细胞：内源激素,动物细胞的筛选方式：,1）利用抗药性筛选系统 亲本A：Amp，Kan 亲本B：Kan，Amp 杂种细胞： Amp ，Kan,2）营养互补筛选系统 亲本A：色氨酸缺陷型 亲本B：苏氨酸缺陷型 杂种细胞可以在不含色氨酸和苏氨酸的培养基上培养，亲本细胞均死亡。,3）温度敏感突变型 亲本一：Kan，37度 亲本二：高温敏感突变型，Kan 杂种细胞能在高温和含Kan培养基生长。,第二节 单克隆抗体 一、抗体的结构与功能 二、单克隆抗体的制备和生产 三、单克隆抗体的改造和应用,抗体是由B细胞受抗原刺激后所分泌的蛋白质。,一、抗体的结构与功能,二、单克隆抗体的制备,杂交瘤技术：将能够产生抗体的B淋巴细胞和具有无限增殖力的骨髓瘤细胞融合在一起，形成杂交瘤细胞。 单克隆抗体(monoclonal antibody，简称McAb)：单一类型的只针对某一特定抗原决定簇的抗体分子。,单抗的特点,1.高度特异性 2.高度稳定性 3.高抗体活性 4.不可知性 5.过于单一性,单抗的制备原理,1.病毒转化 2.细胞杂交,单抗的制备过程,1.动物免疫与亲本选择 2.细胞融合 3.杂交瘤细胞的筛选 4.单抗制备和冻存 5.单抗纯化,1.动物免疫与亲本选择,1）骨髓瘤细胞 一般不分泌抗体 能在体外无限繁殖和连续继代培养 为HPRT或TK。 多用BALB/C 小鼠的骨髓瘤细胞。,2）淋巴细胞 免疫方法 体内法 体外法,2.细胞融合,脾细胞和骨髓细胞混匀 离心 沉淀滴加50%的PEG 0.5ml 静置90秒 滴加不含血清培液或BSS 510ml 静置10分钟,3.HAT培养基筛选杂交瘤细胞,细胞团块分散，加HAT溶液，稀释 加入有饲细胞的多孔培养板 23天半量换液，7天后完成,细胞融合的选择示意图,1）HAT选择系统,HAT：是含一定浓度次黄嘌呤（H）、氨基喋呤（A）及胸腺嘧啶核苷（T）的一种选择性培养基，其中三种成分与细胞DNA合成有关。 DNA合成途径有两种。,原理： 杂交瘤技术中，常选用次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶缺陷（HPRT-）或胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）骨髓瘤细胞为亲本之一，无补救途径。 含氨基喋呤培养基抑制了全合成途径。 淋巴细胞具有合成DNA的两条途径。 杂种细胞通过互补作用获得HRPT或TK基因，可应用培养基中次黄嘌呤及胸腺嘧啶核苷，通过补救合成途径合成DNA。 在HAT培养基中，HPRT- 或TK- 亲本细胞死亡，淋巴细胞亦逐渐死亡，只有杂种细胞存活。,2）特异性杂交瘤细胞的筛选,可溶性抗原:放射免疫、免疫酶标测定等 细胞抗原:免疫荧光、被动血凝实验、补体依赖的细胞毒等,利用培养基对单抗进行鉴定的过程,一种制备人肿瘤单克隆抗体的方案,4.杂交瘤细胞的克隆化培养,方法有有限稀释法、软琼脂培养法、显微操作法、流式细胞仪等。,有限稀释法,通过适当的稀释达到分离单个细胞进行培养的目的 1）取出阳性孔内的细胞进行计数 2）用培液将其稀释到例如每毫升内10个细胞。 3）如果在96孔板内每孔加0.1ml，其机率将为每孔内落入一个细胞。 4）加入一定数量的饲养细胞，经过812天后，可观察到有集落生长的孔。 5）根据检测的阳性结果再次进行克隆化。,软琼脂培养法,在加入饲养细胞的无菌平皿内铺上一层0.5的琼脂，待凝固后再铺上一层混有杂交瘤细胞的0.25的软琼脂。待细胞长成集落后，用毛细管吸出移种于含饲养细胞的96孔板内。,5.单抗的大规模生产,1）诱生腹水（动物生物反应器） 2）利用微载体、微囊、旋转瓶、中空纤维系统等进行大规模培养（人工生物反应器）,三、单克隆抗体的改造和应用,单抗作为体内体外诊断试剂在临床生化诊断、病理组织定位、体内肿瘤的定位等 单克隆抗体靶向制剂，治疗癌症等疾病 杂交人鼠单克隆抗体,单抗作为体内体外诊断试剂,现在已经有各种不同类型的单抗试剂合在市场出售，例如乙型肝炎的表面抗原，铁蛋白、促绒毛膜性激素、促甲状腺激素、癌症、艾滋病等诊断试剂。 用同位素标记的单抗在特定的组织中成象的技术可以用于肿瘤、心血管畸形的体内诊断。,1、单克隆抗体靶向制剂,1）药物与单抗直接偶联 通过化学反应使药物分子的氨基与抗体分子的羧基之间直接形成稳定的酰胺键。 利用氧化剂把药物分子上的糖基氧化成羰基。 利用羰基与抗体分子的氨基反应形成西佛氏碱，最后还原。 这样的靶向制剂保留一定的药物活性，并具有一定的选择性。 如：1，4溴柔红霉素,2）药物通过小分子与单抗连接 通过一些小分子交联剂，把药物分子上的某些基团连接起来。 小分子交联剂：如同型双功能试剂，包括戊二醛、顺乌头酸酐、马来酸酐、戊二酐；异型双功能试剂：N琥珀酰胺基3丙酸和寡肽等。 顺乌头酸酐制成的最常用,3）药物通过大分子与抗体相连 大分子聚合物：葡聚糖、多聚赖氨酸、多聚谷氨酸、聚合多肽和血清蛋白等。 总之，利用单抗试剂合可以作为靶向药物，针对肿瘤、自身免疫系统疾病、各种病原体病等。,2、杂交人鼠单克隆抗体,鼠源抗体一般无法有效地激发宿主的免疫防卫系统，还可能引发人对鼠源抗体本身的免疫反应。 Fc片段 利用人源的Fc区域的DNA片段替换鼠源单抗的Fc的DNA片段。 嵌合抗体可以保留其目标专一性，降低人的抗鼠反应。,3、人源单克隆抗体,方法1：分离人B细胞，使之与荧光标记的抗原相结合，通过荧光标记选择能产生特殊抗体的B细胞，并用EpsteinBarr病毒转化，得到少量的单抗。 方法2：将人源免疫干细胞导入缺失大部分免疫细胞的小鼠体内，遇到抗原时，产生人源的抗体。 方法3：将改造过的人的抗体基因导入鼠胚胎中，能在免疫后得到产生人抗体的转基因鼠,4、抗体融合蛋白,将抗体的可变区与一非抗体蛋白融合起来，使融合蛋白继承有抗体分子的结合特异性。可以保留不同程度的抗体结合特异性和激发其他免疫反应的能力。,5、抗体酶,一种对酶促反应过渡态特异的抗体结合了酶与抗体的优点，既可以起酶促催化作用，又可以起抗体的选择性和专一性结合抗原的作用。,6、单链抗体,在大肠杆菌的系统中，可以表达VL衔接物VH的序列，产生单链抗体。 单链FV片段:抗体体积小、免疫原性较低，渗透性好，用于实体肿瘤的诊断和治疗。 生物导弹：利用单链抗体序列接上一段药物蛋白的编码序列，表达后的蛋白可以根据抗原抗体反应，而达到专一性治疗疾病的目的。 双功能抗体片段：两个抗原结合特异性不同的Fab或Fv片段通过二硫键连接起来，如一个结合肿瘤特异性抗原，一个结合杀伤性T细胞，这样识别和消灭肿瘤细胞的功能可以统一在一个单链抗体分子上。,后面内容直接删除就行 资料可以编辑修改使用 资料可以编辑修改使用,主要经营：网络软件设计、图文设计制作、发布广告等 公司秉着以优质的服务对待每一位客户，做到让客户满意