棉籽糖水解法制备三氯蔗糖的初步探索.pdf

第8卷第2期 2002年6月 冷 饮 与 速 冻 食 品 工 业 Beverage 6 ,4,1,6-四氯- 6 ,4,1,6-四脱氧棉籽糖(TCR) ;水解 Preliminary Exploration into How to Extract Sucralose Through Hydrolyzing Raffinose ZHAN Jian - xian ,GAO Xian - fong ,YUN Er - dong (School of Food and Biotechnology ,South China University of Technology ,Guangzhou 510641 ,China) Abstract :After selective chlorination of raffinose , sucralose is formed through hydrolyzing C - 6 galactose group in the presence of galactosidases. The enzymatic hydrolysis of 6 ,4,1,6- tetrachloro - 6 ,4,1,6- tetradeoxy - raffinose (TCR) was discussed in detail. And the enzymatic synthesis of raffinose was studied briefly. This great potentially method has some advantages , such as simple synthesis route and product concentration. Keywords :raffinose;6 ,4,1,6- tetrachloro - 6 ,4,1,6- tetradeoxy - raffinose (TCR) ;hydrolysis 0 前 言 在目前已有的各种合成三氯蔗糖的方法中,棉 籽糖水解法受到人们的关注。虽然从技术和经济方 面考虑,这种方法目前离实用阶段尚有一定距离,却 为三氯蔗糖的合成提出了一种新的思路和方法,具 有较高的理论研究价值和应用前景。 棉籽糖水解法合成三氯蔗糖,是以棉籽糖为原 料,经选择性氯化后,由-半乳糖苷酶的水解作 用,除去半乳糖基,制成三氯蔗糖。其中氯化衍生过 程与传统的化学方法一致,作者仅对其中的酶法水 解部分作详细研讨。 1 反应原理及步骤 棉籽糖的化学结构,见图1。 图1 棉籽糖的化学结构 由图1所示,棉籽糖可以看作是蔗糖的半乳糖 衍生物,是一种三糖分子。由于棉籽糖的半乳糖残 基正好位于蔗糖的C - 6位上,充当着蔗糖C - 6位 上天然保护基团的角色。因此,若以棉籽糖为原料, 对其C - 6 ,4,1,6 进行选择性氯化,再水解- 1 , 1 收稿日期:2001 - 10 - 05 ;修订日期:2001 - 11 - 20. 基金项目:国家自然科学基金资助项目(29906003) . 作者简介:郑建仙(1964 - ) ,男,福建仙游人,教授,博士,硕士生导师,主要从事食品的研究与开发. 6 -糖苷键,除去半乳糖残基,即可得到三氯蔗糖,反应过程见图2。 图2 棉籽糖水解法合成三氯蔗糖的主要步骤 除棉籽糖外,蔗糖C - 6位羟基已被糖苷键保 护的低聚糖,还包括四棉水苏糖(Stachyose)和五棉 毛蕊花糖(Verbascose)等,理论上可利用它们的这一 性质来合成三氯蔗糖。 2 TCR的酶法水解 由于化学水解缺乏专一性,因此对- 1 ,6 -糖 苷键的水解需要在特定酶的作用下才能完成。 2. 1 酶制剂的选择 已知具有糖酶活性(如葡聚糖酶、 蔗糖酶及、 -半乳糖苷酶等)的50多种商品酶制剂,人们已进 行了水解6 ,4,1,6-四氯- 6 ,4,1,6-四脱氧 半乳棉籽糖( TCR)的- 1 ,6糖苷键的活力测试, 但结果并不理想。这些酶制剂包括4种从植物中获 得的-半乳糖苷酶,以及7种从细菌和霉菌中获 得的-半乳糖苷酶,其中只有一种商品酶制剂 ,即 半纤维素酶对TCR具有活力,但水解速度非常慢。 为此,人们转向从微生物中寻找能水解TCR的- 半乳糖苷酶。筛选具有水解TCR活力的微生物通 常要经过如下3个步骤: 1) 将微生物置于以棉籽糖为唯一碳源的培养 基中进行富集培养。 2) 用超声波破碎微生物细胞,并以对硝基苯- -D-半乳糖苷为底物对微生物进行活力测试,确 定具有对硝基苯-D-半乳糖苷活性的微生物, 再进一步检测其水解棉籽糖为半乳糖和蔗糖的能 力。 3) 对具有水解棉籽糖活力的微生物再用TCR 进行筛选,以确定其水解TCR的-半乳糖苷酶活 力。 事实上,所有被测试的微生物都能水解棉籽糖, 但对TCR具有活性的则非常少,结果见表1。 表1 水解四氯棉籽糖的酶活力比较 微 生 物 ATCC 序 号 酶 活 力 (p- NP3) 酶 活 力 (TCR3 3) 酶活力的比值 (TCR:p - NP) Absidia griseola2043035.500- Absidia griseola2043118.600.20- Absidia griseola2261843.700- Aspergillus awamori4473320.800- A. niger3622020.100.490.024 Circinella muscae1600875.401.120.015 Circinella muscae2039428.900.20- Circinella muscae2233711.300- M. vinacea2003418.201.090.060 M. vinacea2003421.304.300.202 M. vinacea341958.901.330.149 M. vinacea4242510.601.060.100 Saccharomyces uvarum423671.600- Talaromyces thermophilus164611. 00- 注: 3 p- NP是对硝基苯-D-半乳糖苷,此处酶活以p- NP为底物进行测量。 3 3 酶单位的含义为 ( mg 三氯蔗糖)/ ( g酶制剂)/ h ,以 mg/ (g h) 来表示。 2 显然,具有显著-半乳糖苷酶活力的酶制剂 都是从霉菌菌丝体中获得的。在5个具有最强的水 解TCR活力的霉菌中,有4个是从M V inacea中 获得的,有1个是从C Muscae中获得的。其中M V inaceaATCC 20034在所有被测试的微生物中,对 TCR具有最高的水解能力。从该微生物中提取的 -半乳糖苷酶(EC 3. 2. 1. 22)不含转化酶的活力, 目前已在甜菜糖精炼中被用来水解棉籽糖。它还可 以被固定化,此时对TCR则有更强的水解能力。 -半乳糖苷酶水解TCR的速率通常是水解 棉籽糖速率的1/ 501/ 100左右。产物抑制是一个 可能的原因,因为-半乳糖苷酶常常会受到半乳 糖的抑制;另一个原因可能是由于自由的C - 6位 羟基对底物与酶活性部位的高效结合。酶活力降低 的原因还可能是由于位于糖苷键附近的4- Cl会 阻碍酶的水解作用。 2. 2 TCR溶剂的选择 由于TCR在水中的最大溶解度仅为15 % ,使 棉籽糖酶解法合成三氯蔗糖在经济上受到限制。因 此,首先必须找到一种合适的TCR溶剂,要求它既 能较大限度地溶解TCR ,又能保证-半乳糖苷酶 的活力。 TCR只有在亲水溶剂中才能高度溶解,但在保 证酶解反应能得到必要的水的前提下,-半乳糖 苷酶却被证明在与水互不相溶的有机溶剂中最稳定 并具有最高的活力。这个矛盾可以通过使用被含水 缓冲液预饱和的有机溶液来得以解决。研究发现, 与水混溶的溶剂如二氧六环、 丙酮、 甲醇和四氢呋喃 等即使使用高达30 %的含水缓冲液进行预饱和,也 不支持-半乳糖苷酶的水解反应。但在含水缓冲 液预饱和的正丁醇、 甲基异丁基酮和乙酸乙酯3种 溶液中,TCR的溶解度均达50 %以上,这些溶剂同 时也支持-半乳糖苷酶的活力,只是三者对三氯 蔗糖的溶解性存在较大差别,见表2。 表2 TCR和三氯蔗糖在各种溶剂中的溶解度 溶 剂 3 TCR/ %三氯蔗糖/ % 水1530. 0 正丁醇 50 50. 0 甲基异丁基酮 506. 0 乙酸乙酯 505. 7 正辛醇5B 由表5可知,影响螺旋藻酸奶综合口味的主要 因素是琼脂,其次是螺旋藻含量,最后是发酵剂接种 量,较优组合为ABC。 3. 5 理想配方 由上可知,螺旋藻酸奶的最佳配方为:脱脂乳粉 12 %;发酵剂接种量2. 5 %;砂糖4 %;螺旋藻粒 0. 05 %;琼脂0. 2 %。 4 产品质量指标 4. 1 感官指标 螺旋藻粒外型圆润,蓝绿透明,大小适中,均匀 悬浮于酸奶中,无杂质,产品酸甜适口,具有乳香及 藻香味。 4. 2 理化检验结果 脂肪含量 3. 0 %;酸度(以乳酸计) :0. 73 % 0. 99 %。 4. 3 卫生指标 大肠菌群 90个/ dL ;致病菌未检出。 5 结 语 1) 以螺旋藻干粉和脱脂奶粉为主料生产的螺 旋藻酸奶富含蛋白质、 维生素、 生理活性物质、 乳酸 菌等,集营养、 保健于一体,符合人们的消费观念。 2) 螺旋藻营养液造粒时可在芯液中添加适量 牛磺酸、VC、 葡萄糖酸锌等,增加其保健效果,该产 品的市场前景广阔。 3) 如果制备冷冻型酸奶,可不添加琼脂,而增 大螺旋藻颗粒后,将其放于杯顶,但有一些其它因素 应重点考虑。 参考文献: 1曹力民,吕朋.螺旋藻在冰淇淋中的应用研究J .食品工业科 技,2001(2) :4344. 2黄来发.蛋白饮料加工工艺与配方M.北京:中国轻工业出版 社,1987. 119120. 3王福源.现代食品发酵技术 M.北京:中国轻工业出版社, 1998. 12. 4李作良,郑家麟.海藻酸钠珍珠胶囊饮料生产工艺初探J .食品 科技,1998(2) :3637. 5秦立虎.微胶囊技术在乳品工业中的应用J .食品科技,1997 (6) :2930. 6诸葛健,王正祥.工业微生物实验技术手册M.北京:中国轻工 业出版社. 1994 ,214215. (上接第3页) 缩使棉籽糖从溶液中结晶出来,进而使反应向合成 棉籽糖的方向进行,以提高棉籽糖得率。结果虽然 得到棉籽糖的结晶沉淀,但结晶物中却同时含有大 量的葡萄糖。 此外,棉籽糖也可以通过使用A . niger-半 乳糖苷酶先从葡萄糖合成蜜二糖,再使用果糖转移 酶将蔗糖的果糖单元转移到蜜二糖分子上以最终合 成。而其它-半乳糖苷酶以及具有- 1 ,6糖苷 键活力的酶,如葡萄糖化酶或葡聚糖酶等,却不能合 成棉籽糖。 4 前景展望 棉籽糖水解法制备三氯蔗糖的工艺简单,可操 作性强,也不存在色谱分离方面的问题。而且,反应 过程中使用的-半乳糖苷酶,可以很经济地获得 并以固定化的形式使用。同时,三氯蔗糖还可以从 反应溶剂中被选择性地结晶出来,