杏鲍菇漆酶部分酶学性质的研究.pdf

基金项目： 北京市教委资助项目 “固定化杏鲍菇漆酶处理工业废水的研究”（KM200710020010） 。 第一作者简介： 万善霞， 女， 1963年出生， 副教授， 主要从事生物化学、 酶工程的教学和科研工作。通信地址： 102206 北京市昌平区回龙观镇北农 路7号， 北京农学院生物技术系。E-mail： wanshanxia 。 收稿日期： 2009-06-05， 修回日期： 2009-06-22。 杏鲍菇漆酶部分酶学性质的研究 万善霞， 滑 静， 王文平， 张淑萍 （北京农学院生物技术系， 北京 102206） 摘 要： 漆酶是一种含铜多酚氧化酶， 可以氧化分解各种酚类染料、 芳香胺等， 由于漆酶具有相当宽泛 的底物专一性和较好的稳定性， 漆酶在废水处理、 生物漂白、 芳香化合物转化、 生物传感器构建等方面 具有重要应用价值。从多种新鲜食用菌子实体中提取漆酶， 发现杏鲍菇漆酶的酶活性最高， 对其酶学 性质的研究对今后漆酶的应用提供有价值的理论数据。漆酶提取液通过硫酸铵分级沉淀、 透析制备 漆酶粗酶液。采用分光光度法， 以ABTS2,2-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)为底物 测定漆酶活力。结果表明， 杏鲍菇漆酶的最适反应温度为45 。该酶在50 以下保温14 h， 酶活损 失很小， 但当温度超过70 时， 酶活力损失较大。但漆酶的贮存稳定性相对较高， 酶液在4 下保存 近60天后仍残留60%的酶活性。杏鲍菇漆酶的最适pH为3.0； 漆酶在pH 4.08.0， 25 保温110 h酶 活力损失15%25%， 但在pH 2.03.6， 25 保温110 h酶活力损失40%60%。金属离子对漆酶活性 有明显的影响作用， Ca2+、 Mn2+、 Fe2+、 Ag+对酶的活性有抑制作用， Na+、 K+、 Mg2+、 Cu2+、 Pb2+、 Zn2+对酶的活 性有促进作用。从上述实验结果可以得出结论： 杏鲍菇漆酶在50 以下保温， 相对酶活性及热稳定 性均较好。最适温度为45 。但当温度超过70 时， 酶活性被强烈抑制。杏鲍菇漆酶的最适pH 为3.0， 表明该酶可以在较酸的环境中发挥作用。金属离子作为酶的辅助因子可以激活或抑制漆酶 的活性。 关键词： 杏鲍菇； 漆酶； 酶学性质 中图分类号： Q554.9文献标识码： A论文编号： 2009-1183 Studies on Partial Enzymatic Properties of Laccase from Pleurotus eryngii Wan Shanxia, Hua Jing, Wang Wenping, Zhang Shuping (Beijing University of Agriculture, Beijing 102206) Abstract: The laccase as a copper-containing polyphenol oxidase, can oxidise a variety of phenolic oxidation dyes, aromatic amines, etc. as a result of its broad substrate specificity and good stability, laccase is used in wastewater treatment, biobleaching to build an important application value. The laccase was extracted from fresh Pleurotus eryngi fruit body. Crude laccase extraction was through ammonium sulfate fractional precipita tion, dialysis Preparation. The laccase activity was determined by spectrophotometry. The results showed that optimal temperature of laccase was 45 . It was preserved below 50 for 1-4 h, the activity loss is very small, but when the temperature exceeds 70 , a larger loss of enzyme activity was found. The optimal pH of laccase was 3.0. Laccase was insulated at 25 in pH 4.0-8.0 for 1-10 h, laccase activity was lose by 15%-25%, but in pH 2.0-3.6, by 40%-60%. The activity was inhibited by Ca2+、 Mn2+、 Fe3+、 Ag+, and was en hanced by Na+, K+, Mg2+, Cu2+, Pb2+, Zn2+. From the above results it can be concluded: The laccase was insulat ed below 50 , the relative activity and thermal stability was good. The optimal temperature was 45 . The optimal pH was 3.0. Metal ions as a cofactor of enzymes can activate or inhibit the activity of laccase. Key words: Pleurotus eryngii, laccase, enzymatic properties 中国农学通报2009,25(21):107-109 ChineseAgricultural Science Bulletin 中国农学通报 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? U ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?U ? 温度? 酶活力? ? ? ? ? ? ? 图1温度对漆酶活力的影响 0 引言 漆酶 （Laccase， EC1.10.3.2） 是一种含铜多酚氧化 酶1， 可以转化多环芳香化合物、 氯代酚、 多氯联酚、 二氯苯胺、 杀虫剂、 染料等多种难降解的有机化合物 2。由于漆酶具有相当宽泛的底物专一性和较好的稳 定性， 漆酶在废水处理、 生物漂白、 芳香化合物转化、 生物传感器构建等方面具有重要应用价值3-4， 因而近 年来国内外日益重视对漆酶的研究， 成为环境保护用 酶的研究热点5。 漆酶最早在日本紫胶漆树 （Rhus vernicifera） 的汁 液中发现6， 按其来源可分为漆树漆酶 （rhus laccase） 和真菌漆酶 （fungal laccase） 两大类7。近年来对于漆 酶的研究多以真菌培养液或漆树漆酶为材料， 对于食 用菌中漆酶性质的报道很少， 有关杏鲍菇漆酶的研究 更鲜有报道。为进一步开发漆酶资源， 笔者从多种食 用菌中筛选到漆酶活性较高的杏鲍菇作为材料， 研究 漆酶性质， 对漆酶在环境保护方面的广泛应用具有重 要意义。 1 材料与方法 1.1 时间与地点 全部试验于2007年11月2008年4月在北京农 学院北京市农业应用新技术实验室进行。 1.2 材料 新鲜的杏鲍菇子实体由天津鸿滨禾盛农业技术 开发有限公司提供。 ABTS2,2-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sul- fonic acid)为美国Sigma公司产品， 其他试剂均为国 产分析纯试剂。主要仪器有SCR-20BA 高速离心机、 WFJ2000 可见分光光度计、 PHS3E数字式pH计、 高速 自控组织搅碎机、 HWS12 电热恒温水浴锅。 1.3 方法 1.3.1 漆酶粗酶液的制备 新鲜的食用菌子实体与预 冷保存的生理盐水等体积混合， 用高速组织捣碎机匀 浆， 匀浆液 6000 r/min 4 离心 20 min， 上清液加入 80%饱和度的硫酸铵进行分级沉淀， 于4 10 000 r/ min离心20 min， 弃上清液， 取沉淀重溶于蒸馏水中， 用蒸馏水透析48 h， 中间换水3次作为粗酶液冰箱保 存备用。 1.3.2 漆酶活性测定 采用 ABTS-分光光度计法， 乙 酸-乙酸钠缓冲体系5。反应体系为3 ml， 定量加入漆 酶 粗 提 液 和 底 物 ABTS， 反 应 3 min， 于 25 用 WFJ2000可见分光光度计测420 nm处的吸光度。酶 的活性单位定义为每分钟吸光值增加0.01所需的酶 液量。 1.3.3 酶学性质的测定 （1） 最适反应温度及热稳定性和贮存稳定性 在 不同温度下按照标准方法测定酶活， 确定最适反应温 度。酶液在20 、 30 、 37 、 50 、 65 、 80 下 分别保温0.5 h、 1 h、 2 h、 3 h、 4 h， 迅速冷却至室温， 用 标准方法测残余酶相对活力， 以未保温的酶液的酶活 为100%。 （2） 最适反应pH及pH稳定性 将酶液分别加在 pH 2.08.0的缓冲液中， 按标准方法测酶活力， 以酶活 最高者为 100%， 将酶液在不同 pH 2.08.0 的缓冲液 中25 保温1 h、 10 h后， 测残余酶活力， 以未保温的 酶液的酶活为100%， 测定漆酶pH稳定性 （3） 金属离子对酶活力的影响 在反应体系中， 金 属离子终浓度为5 mmol/L， 与一定量酶液25 保温 10 min 后， 再加底物 ABTS， 按标准方法测定漆酶活 力， 以不含金属离子的反应液为对照。 2 结果与分析 2.1 最适反应温度及热稳定性 结果见图1， 试验结果表明， 酶的最适反应温度 为45 。该酶在50 以下保温1 h， 酶活损失很小， 保温 24 h 仍残留 90%酶活力， 但当温度超过 70 时， 酶活力损失很大， 高温可以很强的抑制漆酶活性， 说明此酶对高温敏感。但漆酶的贮存稳定性相对较 高， 酶液在4 保存近60天后仍残留60%的酶活性。 2.2 最适反应pH及pH稳定性 由图2可见， pH 2.0时时酶活性较小， 但当pH达 到3.0时酶的活性却达到最高值， 因此漆酶的最适pH 为3.0。pH在2.54.0之间酶活性相对较高， 但之后随 着pH的增加酶的活性急剧下降， 当pH 8.0时酶基本 失活。pH稳定性试验结果表明， 漆酶在pH 4.08.0， 25 保温1 h酶活力损失15%以下， 保温10 h酶活力 损失25%左右； 但在pH 2.03.6， 25 保温1 h酶活力 108 损失约40%， 保温10 h酶活力损失60%左右， 由此推 断杏鲍菇漆酶不是一种耐酸的酶。 2.3 金属离子对酶活力的影响 由表1可以看出， Pb2+对漆酶活性的促进作用最 显著， Na+、 K+、 Mg2+、 Cu2+、 Zn2+也有一定程度的激活作 用， 而 Ca2+、 Fe3+、 Ag+则对酶活有较强的抑制作用， Mn2+对漆酶活性影响不明显。 3 讨论 漆酶可以催化空气中的氧气直接氧化分解各种 酚类染料、 芳香胺等， 在漆酶介体存在下， 漆酶还可以 催化降解与木质素相关的二苯基甲烷、 N-取代对苯基 二胺、 有机磷化合物 （农药） 及二恶英等8-11。 虽然对不同来源漆酶的性质研究都已有报道， 但 从试验结果表明， 漆酶反应的最适温度、 最适pH及其 他生物学特性， 与已有报道有所不同， 这就证明不同 品种、 不同菌株所产漆酶的部分性质是有差异的， 这 就为今后漆酶的应用提供了有用的理论数据。 温度对漆酶活性的影响表现为酶的最适温度、 热 稳定性及贮存稳定性。从试验结果可以看出， 杏鲍菇 漆酶在50 以下保温， 酶活损失很小， 相对酶活及热 稳定性均较好。最适温度达到45 。4 贮存60天 仍有60%的酶活。但当温度超过70 时， 酶活性被 强烈抑制。其应用的温度范围为常温至50 。 pH是影响酶活性和稳定性的重要因素， 酸碱环 境通过影响酶蛋白的构象， 而影响酶的活性， 因此最 适pH和pH稳定性， 是酶的重要性质之一。杏鲍菇漆 酶的最适pH为3.0， pH稳定范围为2.54.0， 表明该酶 可以在较酸的环境中发挥作用。 金属离子作为酶的辅助因子可以激活或抑制漆 酶的活性， 在终浓度为5 mmol/L时， Pb2+离子对漆酶 有极强的激活作用， 而Ca2+、 Fe3+、 Ag+则对酶活有较强 的抑制作用， Mn2+对漆酶活性影响不明显。 参考文献 1Eggert C, Temp U, Eriksson K E. The Ligninolytic System of the White Rot Fungus Pycnoporus Cinnabarinus: Purification and Char- acterization of the LaccaseJ. App Environ Microbiol,1996,62(4): 1151-1158. 2刘淑珍,钱世钧.担子菌漆酶的分离纯化及其性质研究J.微生物 学报,2003,43(1):73-78. 3李洪臣,于秀俊,杨秀艳.漆酶及其应用J.沧州师范专科学校学 报,2005,21(4):91-92. 4Gianna Palmieri, Paola Giardina, Giovanni Sannia. Laccase-Mediat- ed Remazol Brilliant Blue R Decolorization in a Fixed-Bed Bioreac- torJ. Biotechnol,2005,21(5):1436-1441. 5杨建明,张小敏,刑增涛,等.毛木耳漆酶纯化及其部分漆酶特性 的研究J.菌物学报,2005,24(1):61-70. 6Yoshida H J. Chemistry of lacquer(Urushi)part1J. Chem Soc., 1883,43:472. 7康从宝,刘巧,李清心.白腐菌产漆酶的纯化及部分酶学性质J. 中国生物化学与分子生物学报,2002,18(5):638-642. 8堵国成,赵政,陈坚.真菌漆酶的酶活测定及其在织物染料生物脱 色中的应用J.江南大学学报:自然科学版,2003,2(1):83-86. 9Eggert C, Temp U, Eriksson K L. Laccase is essential for lignin degradation by the white rot fugusPyc