级硕士高级免疫学实验技术概述.ppt

高级免疫学实验技术 2012级硕士研究生,吉林大学白求恩医学院 免疫学系 袁红艳,选用教材,免疫学实验课要求,不许迟到、早退、缺课。 不允许擅自换教室。 穿白大衣。 爱护实验器材（使用后用水冲洗，然后放入指定地点），损坏者按价赔偿。 课后认真打扫教室卫生（擦地面和桌面）。 关掉手机或设置为振动状态。,实验分组,实验操作内容安排,淋巴细胞转化试验 酶联免疫吸附试验（ELISA） 免疫印迹试验(Western blot) 巨噬细胞吞噬功能测定,自讲安排,自讲评分标准,考核方式,考核要求,自讲自评（20分），每组成员合作准备资料和上讲台讲述，老师及其他组给评分，取平均成绩，4人给相同的自讲成绩。 综合考试（40分），共四个大题，每题10分。（周五下午） 出勤情况（10分），每4学时1分。 实验设计（30分），应用免疫学相关实验方法，设计与自己专业的课题。（12.29之前上交，如能完成可在本周五上交） 谈谈你对本次免疫学实验教学的看法。包括:内容安排、备课情况、讲授情况等的优缺点、意见与建议。（最后一次课当堂写。）,实验设计,应用免疫学相关实验方法，设计与自己专业的课题。 包括: 1）题目 2）研究内容 3）研究方案 4）创新点,实验设计的原则,研究的题目：确定研究题目是开展研究工作的首要任务。 研究摘要：研究背景，要开展的主要研究（利用什么样的方法开展研究），研究意义（本次研究的预期成果及其推动科学进步的作用）。 研究内容：叙述主要开展的工作。 研究方案：利用什么样的手段去解决研究内容提到的相关工作。 研究的特色与创新之处：主要科学贡献。,题目：XX细胞因子诱导肺癌细胞凋亡的作用及其机制研究 摘要：肺癌是最常见的肿瘤之一。XX与多种肿瘤的发生发展有关，但其在肺癌中的作用仍缺乏报道。本研究采用人肺癌细胞，利用流式细胞术分析XX诱导人肺癌细胞凋亡作用，通过分析Caspase3,8,12等确定XX诱导肿瘤细胞凋亡机制。本研究不仅可以进一步揭示XX抗肿瘤作用机制，也为寻找新的肺癌治疗方法提供研究基础。,实验设计的基本思路,研究内容：1）XX在人肺癌肿瘤细胞的表达分析，确定XX表达与肺肿瘤的关系。2）检测患者血清XX水平，确定其辅助诊断肺癌的价值 研究方案：1）采用肿瘤组织切片，通过免疫细胞化学染色观察XX在人肺癌组织中的表达情况。2）采用ELISA法检测血清XX水平。 研究的特色与创新之处：本研究阐述了XX与肺癌的关系，并提出XX可作为肺癌的血清学诊断标志物，研究发现XX可以诱导肺癌细胞凋亡，并阐述了其作用机制。,实验设计的基本思路,免疫学实验技术概述,小调查-对免疫学实验技术的了解,目前你知道的免疫学实验技术有哪些？ 这些免疫学实验技术的原理是什么？ 这些技术有什么应用？,免疫学实验技术概述,免疫学技术的范畴,1、对具有免疫活性物质的定性、定量测定 2、对免疫系统的组成成分的数量、状态的测定,免疫学检测技术的评价,一、评价标准 Specificity（特异） Sensitivity（敏感） Simplicity（简便） Safety（安全） Saving（节约） 二、特异性与敏感性的关系 特异性高、敏感性低 敏感性高、特异性低,免疫学实验技术概述,抗原抗体反应 淋巴细胞的检测技术 细胞因子的检测技术 免疫学常用的分子生物学技术,多克隆抗体 单克隆抗体 基因工程抗体 前两者常用于实验研究，而后者用于临床治疗研究。,抗体的应用,多克隆抗体是通过免疫动物血清分离获得 优点：制备方法比较简单，价格低廉，制备所需时间短等 在确定新基因编码蛋白研究方面，仍然是首选抗体类型。但由于多克隆抗体含有针对多个抗原表位的抗体成分，也可能包括抗原变性后暴露的新抗原表位，因此，多克隆抗体在检测变性抗原如采用Western Blot检测蛋白时，其效果比单克隆抗体更敏感。,多克隆抗体,缺点： 纯度差 易发生交叉反应 来源有限 所产生的抗体因动物个体差异滴度不同 不易标准化 因免疫动物血清中含有非常复杂的多种蛋白质成分，所以在进行实验室分析、检测之前，必须将其有效的抗体成分分离、纯化。,多克隆抗体,单克隆抗体(mAb)是通过B细胞杂交瘤获得 与多克隆抗体相比，单克隆抗体主要具有以下三个显著特点（优点）： 高度均质性 高度特异性 来源稳定 不足： 制备方法比较复杂，价格昂贵，制备所需时间较长。,单克隆抗体,mAb是由起始于一个B淋巴细胞的单克隆细胞系所分泌的，因此是一种每个抗体分子的结构(包括氨基酸排列顺序和空间构型)都相同的均质性抗体。,高度均质性,mAb只专一的识别抗原分子上单个抗原位点，因此容易获得特异性抗体，较少产生交叉反应。,高度特异性,可大量生产，当得到稳定分泌mAb的杂交瘤细胞系后，可置液氮中长期保存，需要时取出复苏，既可在体外培养中收获mAb，也可将杂交瘤细胞接种入同系小鼠腹腔内，然后从荷瘤小鼠的腹水中收获大量mAb。,来源稳定,根据实验的目的不同，其分离、纯化的纯度要求也不同。 作为ELISA检测时的抗体，部分情况下饱和硫酸胺纯化即可； 最常使用的抗体是经过A蛋白(Protein A)亲和层析获得的IgG型抗体； 免疫放射测定的标记用抗体必须达到双级纯才可应用(亲和层析纯+SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳纯)。,纯度要求,单克隆抗体在制备过程中经过严格的筛选，因此应根据不同的应用目的选择不同单克隆抗体亚类，如标明供ELISA检测用的单克隆抗体，可能不适合Western Blot检测。 作为初学者尤其应该注意各类单克隆抗体标明的应用范围，而多克隆抗体一般情况下均有较宽的适用范围。,适用范围,一抗和二抗,一级抗体：抗原特异性的抗体 二级抗体：抗抗体（针对一抗的Fc段，具有种属特异性）,Ag