生物化学第24章生物氧化.ppt

第24章 生物氧化电子传递和氧化磷酸化作用,(Biological oxidation electron transport and oxidative phosphorylation),一、氧化还原电势 二、电子传递和氧化呼吸链 三、氧化磷酸化作用,一、氧化还原电势,1. 电池：电子由负极流向正极，电流由正极流向负极，正极发生还原反应，负极发生氧化反应。 2. 电解：与外加电源的正极相连的是阳极，与外加电源的负极相连的是阴极，阳极上发生氧化反应，阴极上发生还原反应。 3. 可充电电池：当电池放电时，正极发生还原反应，负极发生氧化反应；当给电池充电时，正极成为阳极，发生氧化反应，负极成为阴极，发生还原反应。,电极的名称与电极上发生的反应,原电池的结构,检流计,正极，还原反应,负极，氧化反应,电解装置,阳极，氧化反应,阴极，还原反应,电极电势和电动势,能斯特方程,两个电极组成电池的电动势,F: 法拉弟常数 96.5 kJ/Vmol,式中E 0 为标准电极电势，即反应物和产物的活度都为1（如果是气体则为1atm），温度25下的电极电势。规定氢电极的标准电极电势为0。令标准氢电极为负极，其它电极为正极，得到电池的电动势，此电动势即为其它电极的标准电极电势。,反应物和产物浓度与电动势的关系式,对于一个氧化还原反应 aAr + bBo cAo + dBr,氧化还原反应的判据,对于氧化还原反应来说， 反应可以自发进行， 是反应进行的限度。 如果已知两个氧还电对的标准电极电势，可以根据G0=nFE 0计算出该反应的标准自由能变化值。,生物体中某些重要的氧化还原电势,见P117表24-1,呼吸电子传递链中某些重要的氧化还原电势,二、电子传递和氧化磷酸化,柠檬酸循环及其它降解代谢途径产生还原型辅酶，包括NADH和FADH2，将其携带的电子经过电子传递，最终交给分子O2，形成H2O。在电子传递过程中释放出大量的自由能，这些自由能被用来推动ATP的合成。在呼吸电子传递链中，总反应式为 NADH + H+ + 1/2 O2 NAD+ +H2O G0= 220.07 kJ/mol FADH2 + 1/2 O2 FAD +H2O G0= 181.58 kJ/mol,线粒体结构图,柠檬酸循环在线粒体基质中进行，电子传递和氧化磷酸化在线粒体内膜上进行。,还原型辅酶中的能量,在糖酵解和柠檬酸循环中，1分子葡萄糖完全氧化可以生成10个NADH和2个FADH2，它们氧化后可以释放出的自由能为 220.0710 + 181.582 = 2563.86 kJ/mol 1分子葡萄糖完全氧化释放的自由能为 2870.23 kJ/mol 还原型辅酶中贮存的能量比例为 （2563.86/2870.23）100% = 89.3%,电子传递的方向,在电子传递链中，有一系列电子传递体，这些电子传递体的排列顺序是根据它们的电极电位决定的。电子由电极电位低的氧还电对中的还原态电子传递体传向电极电位高的氧还电对中的氧化态电子传递体。,电子传递形成跨膜的质子梯度,在电子传递过程中，还伴随有H+从线粒体内膜的基质侧，向内膜的外侧运输，结果造成跨线粒体内膜的质子梯度，这样在膜内外既造成质子的浓度梯度，又造成电势梯度，这种电化学势梯度贮存有能量。也就是电子传递过程中释放的能量转变成跨线粒体内膜的电化学势梯度中贮存的能量。当质子由膜的外侧向内侧运动时，推动ATP合成。这个过程称为氧化磷酸化。,电子传递链,呼吸电子传递链主要由蛋白质复合体组成，在线粒体内膜上有4种参与电子传递的蛋白质复合体，分别为 NADHQ还原酶（NADH-Q reductase） 琥珀酸Q还原酶（succinate-Q reductase） 细胞色素还原酶（cytochrome reductase） 细胞色素氧化酶（cytochrome oxidase）,电子传递链标准氧还电势、自由能变化和ATP形成部位示意图,上半图,下半图,Protein Complexes of the Mitochondrial Electron-Transport Chain,电子传递链各个成员,1.NADHQ还原酶,NADHQ还原酶又称为NADH脱氢酶，简称为复合体。该酶含有FMN辅基和Fe-S聚簇，催化反应时，先将NADH的电子传递到FMN上，再传给Fe-S聚簇，最后传给辅酶Q。Fe-S聚簇有几种类型，含有Fe-S聚簇的蛋白质称为铁硫蛋白，又称为非血红素铁蛋白。 Fe-S聚簇通过其中的Fe2+和Fe3+的变化来传递电子。,三种类型的Fe-S cluster,Fe Fe2-S2 Fe4-S4,NADH-Q还原酶催化的电子传递,每传递2个电子，可驱动4个H+从膜内侧运到膜外侧。,Negative,Positive,FP:黄素蛋白 IP:铁硫蛋白 HP:疏水蛋白,电子传递链各个成员,2.辅酶Q,辅酶Q（Coenzyme Q ）又称泛醌（ubiquinone），有时简称为Q或UQ，是一种脂溶性物质，它可以接受1个电子还原成半醌中间体，再接受1个电子还原成对苯二酚形式。由于其脂溶性强，可以在线粒体内膜中扩散。它有一个长长的碳氢侧链，哺乳动物中最常见的是具有10个异戊二烯单位的侧链，简写为Q10，在非哺乳动物中这个侧链可能只有68个异戊二烯单位。,辅酶Q的结构和氧化还原态,辅酶Q的space-filling模型,电子传递链各个成员,3.琥珀酸Q还原酶,琥珀酸Q还原酶又称为复合体，完整的此酶包括柠檬酸循环中的琥珀酸脱氢酶，琥珀酸氧化为延胡索酸时脱下的氢还原了FAD，FADH2将电子传递给琥珀酸Q还原酶的Fe-S聚簇，再传递给辅酶Q。,琥珀酸Q还原酶催化的电子传递,电子传递链各个成员,4.细胞色素还原酶,细胞色素还原酶又称复合体、辅酶Q细胞色素c还原酶。它的作用是将还原型辅酶Q的电子传递给细胞色素c。细胞色素还原酶中含有细胞色素b，也含有2Fe-2S聚簇。,细胞色素（cytochrome),细胞色素是一类含有血红素辅基的电子传递蛋白质的总称。还原型细胞色素具有明显的可见光吸收，可以看到、和三个吸收峰，其中峰的波长随细胞色素种类的不同而各有特异的变化，可用来区分不同的细胞色素。氧化型细胞色素在可见光区看不到吸收峰。细胞色素中的血红素有三种，分别称为细胞色素a、b和c，同一种细胞色素血红素因结合的蛋白质不同，其吸收峰的波长会发生小的变化，如细胞色素还原酶中含有的细胞色素b就分为bH（b562）和bL（b566）两种。,血红素的结构,细胞色素c的光吸收峰,还原态 氧化态,几种细胞色素的最大吸收峰,细胞色素还原酶催化的电子传递,前半个Q循环，运出去2个质子。,细胞色素还原酶催化的电子传递,后半个Q循环，运出去2个质子。,电子传递链各个成员,细胞色素 c 是一个分子量13000的单链球形蛋白质，直径3.4nm，由104个氨基酸残基组成，含有一个血红素辅基。它是唯一能溶于水的细胞色素，并且是了解最为透彻的蛋白质之一。,5.细胞色素c,细胞色素c 的三维结构,第三个硫原子来自Met，配位到Fe上。,电子传递链各个成员,细胞色素氧化酶又称为复合体、细胞色素 c 氧化酶。它的作用是将还原型细胞色素 c 的电子传递给分子O2，生成H2O。,6.细胞色素氧化酶,细胞色素氧化酶的传递电子作用,每传递2个电子可以运出2个质子。,氧与a3及Cub结合的关系示意图,Binuclear center,Cys,电子传递给氧生成水,Power stroke phase,Electron-filling phase,电子传递的抑制效应,电子传递链中的抑制剂,三、氧化磷酸化作用,伴随着线粒体内膜上的电子传递，ADP与Pi合成ATP的过程称为氧化磷酸化作用（oxidative phosphorylation）。相应地，我们将在代谢途径中由含磷酸的底物直接把磷酸基团转到ADP上形成ATP的过程，称为底物水平磷酸化。,P/O比,用组织匀浆以及组织切片做的实验表明，组织利用O2的同时，ATP含量随之增加，每消耗1个O原子约合成3个ATP分子。这个比例称为P/O比。P/O比又可以看作是一对电子通过呼吸电子传递链传至O2所产生的ATP分子数。根据P/O比为3，人们认为在电子传递链中，ATP是在3个不连续的部位生成的，根据电子传递链中各环节释放的能量，也确实有3个部位释放的能量大于合成ATP所需的能量。FADH2进入电子传递链后的P/O比为2，说明它绕过了1个生成ATP的部位。现在认为氧化1个NADH可以产生2.5个ATP，氧化1个FADH2可以产生1.5个ATP。,ATP的合成部位,线粒体内膜上有许多球形突起，称为内膜球体（inner membrane sphere）。这些球体通过一个柄连接到内膜中的基座上，我们把球体和柄合称为F1，基座称为Fo，F1和Fo合称复合体。在离体条件下，这种复合体有水解ATP的活性，所以开始称它为ATP酶，后来发现在完整的线粒体中它的功能是合成ATP，现在称它为ATP合酶。,亚线粒体的电镜照片,ATP合酶简图,ATP合酶重组实验,能量偶联假说,（1）化学偶联假说,化学偶联假说是1953年Edward Slater最先提出来的。他认为电子传递过程中产生一种活泼的高能共价中间物，它随后的裂解驱动合成ATP，就像底物水平磷酸化那样。但是在氧化磷酸化中一直没有找到任何一种活泼的高能中间产物。,能量偶联假说,（2）构象偶联假说,这一假说是1964年Paul Boyer最先提出来的。他认为电子沿电子传递链传递使线粒体内膜蛋白质发生了构象变化，形成一种高能态。通过合成ATP使蛋白质恢复到原来的构象。这一假说至今也未能找到有力的实验证据。但是在ATP的合成过程中仍可能包含有不同形式的构象偶联现象。,能量偶联假说,（3）化学渗透假说,这一假说是1961年由英国生物化学家Peter Mitchell最先提出的。他认为电子传递释放出的自由能及ATP合成是与一种跨线粒体内膜的质子梯度相偶联的。也就是说，电子传递释放的自由能驱动H+从线粒体基质跨过内膜进入到膜间隙，从而形成跨线粒体内膜的H+电化学梯度。这个梯度的电化学势驱动ATP合成。,化学渗透假说的原理图,合,化学渗透假说的实验证据, 氧化磷酸化作用需要封闭的线粒体内膜存在。 线粒体内膜对H+、OH、K+、Cl等离子都是不通透的。 破坏H+浓度梯度的形成都必将破坏氧化磷酸化作用。 线粒体内膜上的电子传递能够将H+从基质运输到膜间隙。 人造的脂质小泡上重组细菌紫膜质和F1Fo ATP合酶后，在照光时有ATP的合成。,质子梯度驱动合成ATP的实验证明,细菌紫膜质,脂质小泡,线粒体F1Fo ATP合酶,The Nobel Prize in Chemistry 1978,“for his contribution to the understanding of biological energy transfer through the formulation of the chemiosmotic theory“,Peter D. Mitchell,Glynn Research Laboratories Bodmin, United Kingdom b. 1920 d. 1992,质子泵出是需能过程,质子逆电化学梯度跨过线粒体内膜的自由能变化可以用下式表示 G = 2.3RT pH(膜内)pH(膜外)ZF 式中，是膜电势，即膜内外的电势差。 = (膜外)(膜内),质子转移的两种假设机制,（1）氧化还原回路机制,该机制由Mitchell提出。他认为电子传递链中有一些电子传递体既可以传递电子，也可以结合H+，当它们被还原时，在膜内侧结合H+，而被氧化时，在膜外侧释放H+，这样就把H+从膜内运到了膜外。,氧还回路机制示意图,质子转移的两种假设机制,（2）质子泵机制,这个机制的内容是，电子传递导致复合体构象的变化，氨基酸残基在膜内侧结合H+，构象变化后在膜外侧释放H+，从而把H+从膜内侧运到膜外。,合成ATP与跨膜质子的数量关系,在生理条件下合成1个ATP所需的自由能大约为4050kJ/mol。至少需要两个质子跨膜回流释放的能量才够合成1个ATP。因为转移出膜外的质子有一部分漏回膜内，测定的结果表明，每合成1个ATP需要泵出23个质子。,电子传递与质子泵出相偶联,Go = -69.5kJ/mol,Go = -36.7kJ/mol,Go = -112kJ/mol,线粒体跨内膜的质子梯度,F1和Fo的亚基组成,F1由5种肽链组成，33。Fo由3种疏水亚基组成，a 1b 2 c 9-12。Fo形成跨膜的管道，质子通过此管道流回到膜内侧时驱动ATP合成。F1的、和亚基分别由510、482、272、146和50个氨基酸残基组成，F1的总分子量为371kD。、亚基是同源的，每一个亚基有1个ATP结合位点，催化位点在亚基上，亚基上ATP结合位点的功能还不清楚，因为缺失这个位点并不影响F1的活性。,ATP合成与蛋白质构象变化,John Walker及其同事测定了F1的结构，F1ATP合酶是一个不对称的结构，3个亚基有3种不同的构象。Walker研究发现，一个亚基ATP结合位点结合有AMP-PNP（一种不能被水解的ATP类似物），另一个结合有ADP，第三个位点是空的。这个发现与Paul Boyer提出的关于ATP合成的结合变化机制（binding change mechanism）相符，结合变化机制认为，3个反应位点协调地依次通过ATP合成的3种中间状态进行循环。,ATP的结构类似物AMP-PNP,App(NH)p(,-imidoadenosine 5-triphosphate),Nonhydrolyzable -bond,33的不对称结构,侧面观 顶面观,ATP合酶的结构和工作原理,从FO往F1方向观,分子马达,Fo的c亚基排列成环，c亚基的构象是一对反平行的跨膜螺旋，在内膜外侧由一个短的发卡环连接。c亚基环形成一个转子（rotor），相对于a亚基旋转，a亚基作为定子（stater），a亚基由5个跨膜的螺旋组成，在膜的每一侧有质子流动的通道（proton access channels）。亚基将F1和Fo连接起来，在ATP合成时亚基也相对于()3复合体旋转。亚基固着在c亚基转子上，它们可以一起转动。b亚基有1个跨膜片段和1个长的亲水头部，完整的定子由b亚基固着在a亚基的一端，并通过亚基与()3结合在一起。,分子马达,Fluorescencetly labeled,The worlds smallest molecular motor: rotational catalysis.,(K. Kinosita, 1997),Avidin： 抗生物素蛋白,分子马达,Rotation of thesubunit and the ring of c subunits in the FoF1 complex as directly observed by in vitro studies using fluorescence microscopy: they rotate in 120-degree increments, with each step consume one ATP; operation efficiency near 100%.,质子从膜外侧返回内侧的通道,c 转子每一个亚基上有一个重要的残基Asp61，将这个Asp突变成Asn将失去ATP合酶活性。c转子相对于定子的旋转可能依赖于Asp61上负电荷的中和。质子从a亚基的胞质溶胶侧的通道进入，质子化Asp61，推动转子旋转，直到到达a亚基的基质侧质子通道，Asp61上的质子再解离通过此通道进入膜内侧。这样的旋转能够引起亚基相对于()3复合体旋转，导致3个亚基依次发生构象变化。,Model of the E. coli ATP synthase: the proton gradient drives the rotation of the c ring using two half-channels on the a subunit.,ATP合酶的亚基构象循环变化与ATP合成,ADP+Pi,ADP+Pi,Energy,The Nobel Prize in Chemistry 1997,“for their elucidation of the enzymatic mechanism underlying the synthesis of adenosine triphosphate (ATP)“,Paul D. Boyer,USA University of California Los Angeles, CA, USA,United Kingdom MRC Laboratory of Molecular Biology Cambridge, United Kingdom,John E. Walker,F1Fo ATP合酶的抑制剂,在ATP合酶的柄部有一种寡霉素敏感性授予蛋白（oligomycin-sensitivity-conferring protein，OSCP），这种蛋白使复合体对寡霉素敏感，使得寡霉素抑制ATP的合成。Fo的名称即来自于此。 二环己基碳二亚胺（dicyclohexylcarbodi-imide，DCCD）能够修饰Fo蛋白中某亚基的Glu残基，导致抑制质子通过Fo，这种能被DCCD