实验二细菌基因组DNA的提取.ppt

细菌基因组DNA的提取,一、实验原理,1、核酸的分类,DNA 主要存在于细胞核的染色体中。核外也有少量DNA，如线粒体DNA（mtDNA），叶绿体DNA（cpDNA），质粒DNA。 RNA 存在于细胞质中，如mRNA, rRNA, tRNA等。 除上述DNA，RNA外，还有非细胞形式存在的病毒和噬菌体，其或只含DNA，或只含有RNA。,核酸制备时应注意的事项: 尽量简化操作步骤，缩短提取时间。 减少化学因素对核酸的降解。 减少物理因素对核酸的降解：机械剪切力和高温 防止核酸的生物降解。,核酸制备的步骤：,核酸酶的抑制和抑制剂 降低温度，改变pH及盐的浓度，都利于对核酸酶活性的抑制，但均不如利用核酸酶抑制剂更有利，当然，几个条件并用更好。 对于DNA，抑制DNase活力很容易，但防止机械张力拉断则更重要。 对于RNA，因分子较小，不易被机械张力拉断，但抑制RNase活力较难，故在RNA提取中设法抑制RNase更重要。,3、核酸制备的一般方法和原理,DNase抑制 加入少量金属离子螯合剂，如0.01 mol/L EDTA或柠檬酸钠，DNase基本可以全部失活。 去垢剂、蛋白变性剂及DNase抑制剂也可使DNase失活。,RNase抑制 操作要带手套。 所有器皿要严格消毒， 试剂处理 低温操作 在分离过程中要加入一定的RNase抑制剂。,核酸制备中常用的去垢剂 核酸本身带负电荷，结合带正电荷的蛋白质。用于核酸提取的去垢剂，一般都是阴离子去垢剂，去垢剂的作用： 1溶解膜蛋白及脂肪，使细胞膜破裂； 2溶解核小体上的蛋白质，使其解聚，将核酸释放出来； 3对RNase、DNase有一定的抑制作用。,如：SDS、脱氧胆酸钠、4-氨基水杨酸钠、萘-1.5-二磺酸钠、三异丙基萘磺酸钠,核酸制备中常用的蛋白质变性剂 1.使蛋白质变性、沉淀，从核酸提取液中分离除去，以防造成蛋白污染。 2.使蛋白质变性，故可使核糖体解聚释放出核酸。 3.某些蛋白质变性剂也有抑制RNase活性和破裂细胞的作用。,如：苯酚、氯仿、盐酸胍、DEPC,核酸制备中常用的酶 DNase RNase 蛋白酶K 溶菌酶,细胞破碎 抽提去蛋白质 沉淀核酸,核酸提取的一般过程,细胞破碎 机械方法： 超声波处理法、研磨法、匀浆法； 化学试剂法：用SDS处理细胞； 酶解法： 加入溶菌酶或蜗牛酶，破坏细胞壁。 DNA提取 SDS（十二烷基硫酸钠 ）法 ：SDS是有效的阴离子去垢剂, 细胞中DNA与蛋白质之间 常借静电引力或配位键结合, SDS能够破坏这种价键。 CTAB（十六烷基三甲基溴化铵 ）法 ：CTAB是一种阳离子去垢剂，它可以溶解膜与脂膜，使细胞中的DNA-蛋白质复合物释放出来，并使蛋白质变性，使DNA与蛋白质分离。 DNA纯化（去杂质） 蛋白质： 常用苯酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）或氯仿：异戊醇（24：1）抽提。 RNA ：常选用RNase消化 ，或是用LiCl来消除大分子的RNA。 酚类物质： 提取液中加少量巯基乙醇，选取幼嫩的材料。 多糖： 提取液中加1PVP。,核酸提取的一般过程,核酸样品的保存 温度： 4（5）最佳和最简单 -70是长期保存的良好温度，为一次性保存 -20保存 保存介质： TE缓冲溶液(最常用) 10mmol/L Tris-Cl pH8.0 1mmol/L EDTA pH8.0,二、材料、设备及试剂,菌种 ：大肠杆菌 设备 ：eppendorf管、微量取液器(20l,200l,1000l)， 台式高速离心机， 涡旋振荡器，水浴锅（ 37 、60 ） 试剂：LB液体培养基 、RNA酶A 、无水乙醇 无菌水（或TE）缓冲液、 10%的SDS、 20mg/ml的蛋白酶K，、5mol/L NaCl、酚：氯仿：异戊醇（25：24：1）、异丙醇、 75%乙醇、 CTAB/NaCl溶液(CTAB:5gCTAB溶于100ml0.5molNaCl中，加热到65度溶解。）,1、培养5ml的细菌培养物至饱和状态，取1.2ml的培养物离心12000rpm,1min。 2、沉淀物加入570ul的无菌水（或TE）缓冲液，用吸管反复吹打使之重悬。加入30ul 10%的SDS和10ul 20mg/ml的蛋白酶K，混匀，于37温育1h，（加入3ul的溶菌酶50mg/ml效果更好）。 3、加入100ul 5mol/L NaCl,充分混匀，再加入80ul CTAB/NaCl溶液，混匀，于60 温育10min。(上下颠倒混匀)，离心，12000rpm,5min。 4、取上清，加入等体积（约800ul）的酚：氯仿：异戊醇（25：24：1），混匀，离心12000rpm,5min，将上清液转至新管中。（抽提两次） 5、加入0.6体积异丙醇，轻轻混合直到DNA沉淀下来，静止10分钟，离心,12000rpm,10min 。 6、沉淀用1ml的75%乙醇中洗涤，离心5min，弃上清液，重悬于30ul的无菌水（或TE）缓冲液。,三、操作步骤,四、注意事项材料准备,最好使用新鲜材料，低温保存的样品材料不要反复冻融,四、注意事项细胞裂解,材料应适量，过多会影响裂解，导致DNA量少，纯度低 针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式： 植物材料液氮研磨 动物组织匀浆或液氮研磨 组培细胞蛋白酶K 细菌溶菌酶破壁 酵母破壁酶或玻璃珠 高温温浴时，定时轻柔振荡,四、注意事项核酸分离、纯化,采用吸附材料吸附的方式分离DNA时，应提供相应的缓冲体系 采用有机（酚/氯仿）抽提时应充分混匀，但动作要轻柔 离心分离两相时，应保证一定的转速和时间 针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应的去杂质的方法,四、注意事项核酸沉淀、溶解,当沉淀时间有限时，用预冷的乙醇或异丙醇沉淀，沉淀会更充分 沉淀时加入1/10体积的NaAc（pH