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文档简介
实验三,细菌的简单染色和革兰氏染色,一、实验目的及要求,学习微生物涂片、染色的基本技术, 掌握细菌的简单染色法。 学习并掌握革兰氏染色法,了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。 巩固油镜的使用和无菌操作技术。,二、实验原理,简单染色法是利用单一染料使细菌着色以显示其形态的染色方法。常用于染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。 碱性染料电离时,其分子染色部分带正电荷,能和带负电荷的物质结合。由于细菌生长于中性环境中一般带负电荷,所以通常采用碱性染料使其着色。 当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时,细菌所带正电荷增加,因此易被伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料着色。中性染料是前两者的结合物又称复合染料,如伊红美蓝、伊红天青等。,革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家C.Gram创立的。作为细菌学上最常用最重要的鉴别染色法,革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌(G+)和革兰氏阴性菌(G)两大类。 G菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质,而且肽聚糖层较薄、交联度低,故用乙醇或丙酮脱色时溶解了类脂质,增加了细胞壁的通透性,使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出,结果细菌就被脱色,再经番红复染后就成红色。 G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高,类脂质含量少,经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小,通透性降低,因此细菌仍保留初染时的颜色。,三、实验器材,1.菌种:枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis), 大肠杆菌(Escherichia coli), 金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus) 2. 染色剂:草酸铵结晶紫染液或齐氏石炭酸复红染 液,革兰氏染色液。 3. 其他:显微镜,酒精灯,载玻片,接种环,双层瓶 (内装香柏油和二甲苯),擦镜纸,废液缸等。,四、实验步骤,1、简单染色: (1)涂片:注意取菌不要太多; (2)干燥:室温自然干燥; (3)固定:手执玻片一端,让菌膜朝上, 通过火焰2-3次固定(以不烫手为宜); (4)染色:涂片加草酸铵结晶紫染液或齐氏石炭酸复 红染液 1min; (5)水洗:自来水冲洗,直至流下的无色; (6)干燥:自然晾干或用电吹风吹干; (7)镜检:先低倍观察,再高倍观察,并找出适当的 视野后,将高倍镜转出,在涂片上加香柏 油,油镜观察细菌的形态。,2、革兰氏染色 (1)制片:制片方法与简单染色相同; (2)初染:加适量(以刚好覆盖菌膜为 宜)的结晶紫染色液染色1-2min,水洗; (3)媒染:碘液媒染1min,水洗; (4)脱色:连续滴加95%乙醇脱色20-30s至流出液无色, 立即水洗; (5)复染:滴加番红复染约2min,水洗; (6)镜检:干燥后,油镜镜检观察。 (7)混合涂片法:按上述方法,在同一载玻片上,以大肠 杆菌和枯草芽孢杆菌或大肠杆菌和金黄色葡 萄球菌作混合涂片、染色、镜检进行比较。,Gram Stain,G+,干燥、固定,结晶紫染色,G-,碘液媒染,乙醇脱色,蕃红复染,Figure Mixed culture of large Gram positive rod and small Gram negative rods.,五、注意事项,革兰氏染色成败的关键是酒精脱色。如脱色过度,革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性菌;如脱色时间过短,革兰氏阴性菌也会被染成革兰氏阳性菌。脱色时间的长短受涂片厚薄及乙醇用量多少等因素的影响,难以严格规定。 染色过程中勿使染色液干涸。用水冲洗后,应吸去玻片上的残水,以免染色液被稀释而影响染色效果。 选用幼龄的细菌。若菌龄太老,由于菌体死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。,六、
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