离心分离和沉淀分离.ppt

离 心 分 离,0 概述,固液分离的常用手段 分类：,离心沉降 离心过滤 超离心,1 离心沉降原理,球形粒子沉降,在离心力场中,1 离心沉降原理, 常速离心机 - 中速离心机 高速离心,离心机的种类与用途,按速度和离心力： 1、常速离心机 最大转速8000rpm(r/min),相对离心力(RCF)104g以下,用于细胞、菌体和培养基残渣等分离； 2、高速（冷冻）离心机 1104-2.5104rpm，相对离心力104105g,用于细胞碎片、较大细胞器、大分子沉淀物等分离； 3、超速离心机 转速2.5-8104rpm，相对离心力5*105g；用于DNA、RNA蛋白质、细胞器、病毒分离纯化；检测纯度；沉降系数和相对分子量测定等。,瓶式离心机,1）斜角式离心机 是一类结构最简单的实验室常用离心机， 指离心管腔与转轴成一定倾角的转子； 角度越大，沉降越结实，分离效果越好， 角度越小，颗粒沉降距离短，沉降速度快，但分离效果差。 颗粒在角转子中沉降时， 先沿离心力方向撞向离心管， 然后再沿管壁滑向管底， 因此管的一侧会出现颗粒沉积。,2）平抛式离心机 平抛式离心机一类结构简单的实验室常用的低中速离心机，转速一般在 3000-6000rpm。 转子活动管套内的离心管，静止时垂直挂在转头上，旋转时随着转子转动，从垂直悬吊上升到水平位置（约200800rpm）。 颗粒在水平转子中的沉降是沿管子轴向移动。 样品便于收集 受振动和变速搅乱后对流现象小， 但转头结构复杂，最高转速相对要低 容量也小一些。,平抛式离心机转子,2 离心沉降设备,瓶式离心机,也称平抛式离心机 结构最简单的实验室常用的低，中速离心机， 转速一般在 3000-6000rpm。,2 离心沉降设备,管式离心机,液-液分离；液-固分离 结构简单 转速很高 可连续操作（液-液）,2 离心沉降设备,碟式离心机,固体的沉降距离极短，分离效果较好。 碟片间的距离一般为0.52.5mm,与被分离物料的性质有关。 液-液分离；液-固分离 连续操作,2 离心沉降设备,多室式离心机,增加了沉降面积，减少了沉降距离 同时还有粒度筛分的作用 常用于抗菌素液液萃取分离 间歇式生产,管式离心机,3 离心沉降的计算,r,z,管壁,沉 淀 分 离,概述,沉淀（定义） 是溶液中的溶质由液相变成固相析出的过程。 沉淀具有选择性 有选择地沉淀杂质 有选择地沉淀所需成分,优点：操作简单、经济、浓缩倍数高 缺点：针对复杂体系而言，分离度不高、选择性不强,概述,沉淀操作常在发酵液经过过滤和离心（除去不溶性杂质及细胞碎片）以后进行。 操作方式可分连续法或间歇法两种，规模较小时，常采用间歇法。不管哪一种方式操作步骤通常按三步进行：,蛋白质的溶解特性,蛋白质是两性高分子电解质 在水溶液中，多肽链中的疏水性氨基酸残基具有向内部折叠的趋势，一般仍有部分疏水性氨基酸残基暴露在外表面，形成疏水区。疏水性氨基酸含量高的蛋白质的疏水区大，疏水性强。 亲水性氨基酸残基基本分布在蛋白质立体结构的外表面。 蛋白质表面由不均匀分布的荷电基团形成荷电区、亲水区和疏水区构成。,蛋白质分子表面的憎水区域和荷电区域,概述,沉淀法操步骤 ：,沉淀剂,粒子生长,收集沉淀物,过滤,离心,概述,沉淀法,（1）盐析法； （2）等电点沉淀法； （3）有机溶剂沉淀法； （4）非离子型聚合物沉淀法； （5）聚电解质沉淀法； （6）高价金属离子沉淀法等。,除第（3）种有机溶剂沉淀法也能适用于抗生素等小分子外，其他各种方法只适用蛋白质等大分子。,分类,蛋白质盐析,因此，可通过降低蛋白质周围的水化层和双电层厚度（电位）降低蛋白质溶液的稳定性，实现蛋白质的沉淀。,蛋白质稳定因素,水化层,双电层,使蛋白质形成稳定的胶体溶液,静电排斥作用,蛋白质盐析,中性盐,蛋白质脱水,中和电荷,沉淀,盐析法机理,（1）破坏水化膜，分子间易碰撞聚集， 将大量盐加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子有很强的水化力，于是蛋白质分子周围的水化膜层减弱乃至消失，使蛋白质分子因热运动碰撞聚集。 （2）破坏水化膜，暴露出憎水区域，由于憎水区域间作用使蛋白质聚集而沉淀，憎水区域越多，越易沉淀。 （3）中和电荷，减少静电斥力， 中性盐加入蛋白质溶液后，蛋白质表面电荷大量被中和，静电斥力降低，导致蛋白溶解度降低，使蛋白质分子之间聚集而沉淀。,蛋白质盐析,盐析用盐的选择,盐析作用要强 盐析用盐需有较大的溶解度 盐析用盐必须是惰性的 来源丰富、经济,盐析操作,蛋白质盐析,直接加入固体(NH4)2SO4 粉末，工业上常采用这种方法，加入速度不能太快，应分批加入，并充分搅拌，使其完全溶解和防止局部浓度过高； 是加入硫酸铵饱和溶液，在实验室和小规模生产中，或(NH4)2SO4 浓度不需太高时，可采用这种方式，它可防止溶液局部过浓，但加量较多时，料液会被稀释。,蛋白质盐析,阴离子： 柠檬酸PO43- SO42- CH3COO- Cl- NO3- 阳离子： NH4+ K+Na+ 高价阳离子 硫酸铵： （1） 价廉 ；（2） 溶解度大，稳定蛋白质 ；（3）水解变酸；（4）高pH 释氨，腐蚀；（5）残留产品有影响。,盐析效果,影响因素,蛋白质盐析,pH 变化,温度变化,等电点附近有极小值,随温度升高减小，热促失水膜,lgS,蛋白质盐析,盐析注意事项：,(1) 稳定pH 用磷酸缓冲液 （2）硫酸铵加入后体积变大 （3）选择饱和度 （4）分步盐析 （5）初始蛋白浓度, S=-s S蛋白质的溶解度，g/L; I离子强度， I=1/2mizi2 mi离子 i的摩尔浓度； Zi所带电荷 常数，图中截距 Ks盐析常数，图中直线斜率,Cohn经验式 蛋白质溶解度与盐浓度的关系,等电点沉淀法,原理：,调pH至等电点，使蛋白质所带净电荷为零，降低了静电斥力，而疏水力能使分子间相互吸引，形成沉淀。,适用于疏水性较强的蛋白质,pH=pI,等电点沉淀法,（1）适用于疏水性强的蛋白质 （2）中性盐浓度增大时，等电点向偏 酸方向移动，同时最低溶解度会有所增大。 （3）无机酸通常价格便宜，无毒 （4）蛋白质对低pH 敏感，易失活,操作注意事项,等电点沉淀实例,从猪胰脏中提取胰蛋白酶原：胰蛋白酶原的pI8.9，可先于pH 3.0左右进行等电点沉淀，除去共存的许多酸性蛋白质(pI=3O)。 工业生产胰岛素(pI5.3)时：先调pH至8.0除去碱性蛋白质，再调pH至3.0除去酸性蛋白质(同时加入一定浓度的有机溶剂以提高沉淀效果)。,等电点沉淀法,细胞色素C洗脱液（离交）+ 硫酸胺（饱和度86%） 低温离心 上清液调 pH4.8- 5.1 产物 沉淀（杂蛋白）,有机溶剂沉淀法,概念：在含有溶质的水溶液中加入一定量亲水的有机溶剂，降低溶质的溶解度，使其沉淀析出。,优点在于：1）分辨能力比盐析法高，即蛋白质等只在一个比较窄的有机溶剂浓度下沉淀；2）沉淀不用脱盐，过滤较为容易； 缺点是1）对具有生物活性的大分子容易引起变性失活，2）操作要求在低温下进行。3）成本高,A 降低溶剂介电常数. B 破坏水化膜： C 相反力：,有机溶剂沉淀法机理,减小溶剂的极性，从而削弱了溶剂分子与蛋白质分子间的相互作用力，,从蛋白质分子周围的水化层中夺走了水分子，破坏水化层,疏水基团暴露并有机溶剂疏水基团结合形成疏水层,降低介电常数 破坏水化膜,常用的有机溶剂沉析剂,选择依据： 水溶性要好 介电常数要小 致变性作用要小（甲醇） 毒性要小、挥发性适中 容易获取 沉淀蛋白质和酶常用的是乙醇、甲醇和丙酮。沉淀核酸、糖、氨基酸和核苷酸最常用的是乙醇。乙醇是最常用的沉淀剂 乙醇：沉析作用强，挥发性适中，无毒，常用于蛋白质、核酸、多糖等生物大分子的沉析； 丙酮：沉析作用更强，用量省，但毒性大，应用范围不广；,温度 使用有机溶剂沉淀时，操作必须在低温下进行，,有机溶剂沉淀法的影响因素,pH值： pH多控制在待沉蛋白质的等电点附近。,举例：固体发酵生产-淀粉酶的提取工艺研究 -淀粉酶（米曲霉）菌体