SNT3767.1-2014出口食品中转基因成分环介导等温扩增（LAMP）检测方法第1部分：通用要求和定义.pdf

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 sN/T3767。 -2014 出口食品中转基因成分环介导 等温扩增(LAMP) 第 1部 分 :通 用要 检测方法 求和定义 Loop-mediated isothermal amplification detection method for genetically modified components in food for export- Part 1 : General requirements and definitions 2014-013发布 14-0g01实施 中华人民共和国 国 家 质 量 监 督 检 验 检 疫 总 局 发 布 sN/T3767。-2014 亠刖 曰 SN/T3767 出口 食品中转基因成分环介导等温扩增(LAMP)检 测方法 共分为30部分 : 第1部分 :通 用要求和定义 ; 第2部分 :筛 选方法 ; 第 3 部 分: 玉 米 B t - 1 1 品 系; 第 4 部 分: 玉 米 B t 1 7 6 品系 ; 第5部分 :玉 米GA21品系 ; 第 6 部分 : 玉 米M I R 1 6 2 品 系 ; 第 7 部分 : 玉 米M I R 6 0 4 品 系 ; 第 8 部分 : 玉 米M O N 8 1 0 品 系 ; 第 9 部分 : 玉 米M O N 8 6 3 品 系 ; 第 1 0 部分 : 玉 米M O N 8 8 0 1 7 品 系 ; 第 1 1 部分 : 玉 米M O N 8 9 0 3 4 品 系 ; 第 1 2 部 分: 玉米 T - 2 5 品 系; 第 1 3 部分 : 玉米3 2 7 2 品 系 ; 第 1 4 部分 : 玉米5 9 1 2 2 品 系 ; 第 1 5 部分 : 大豆A 2 7 0 4 2 品系 ; 第 1 6 部 分: 大 豆 A 5 5 4 7 - 1 2 7 品系 ; 第 17部分 :大 豆 DP356043品 系 ; 第 18部分 :大 豆 GTS4032品 系 ; 第 19部分 :大 豆MON89788品 系 ; 第部分 :水 稻Bt-63品系; 第21部分 :水 稻KF6品系 ; 第22部分 :水 稻KF8品系 ; 第23部分 :水 稻KMD品系 ; 第 部 分 :水 稻 LLRICE62品 系 ; 第25部分 :水 稻M12品系 ; 第 2 6 部分 : 水稻T l G 1 9 品系 ; 第27部分 :水 稻T2A1品 系 ; 第 2 8 部 分: 小 麦 B 7 3 - 6 品 系; 第29部分 :甜 菜H 1品系 ; 第30部分 :油 菜R73品系。 本部分为SN/T3767的第1部分 。 本部分按照GB/T1.109给出的规则起草 。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任 。 本部分 由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本部分起草单位 :中 华人民共和 国广东 出人境检验检疫局 、 中华人 民共和 国北京 出人境检验检疫 局 、 中华人 民共和国上海出入境检验检疫局 、 中华人 民共和国珠海 出入境检验检疫局 、 中国检验检疫科 学研究院、 中华人 民共和国辽宁出人境检验检疫局 、 中华人 民共和国天津 出人境检验检疫局 、 中华人 民 sN/T3767,卜 -2014 共和国黑龙江出人境检验检疫局、 中华人民共和国福建出人境检验检疫局、 中华人民共和国厦门出入境 检验检疫局、 中华人民共和国吉林出人境检验检疫局、 中华人民共和国汕头出人境检验检疫局、 仲恺农 业工程学院、 广州迪澳生物科技有限公司。 本部分主要起草人 :李 志勇、 刘津、 高东微、 谢力、 曾静、 李 晓虹、 冯家望、 陈颖、 曹际娟、 郑文杰、 栾凤侠、 邵碧英、 陈双雅、 罗雁非、 凌莉、 蔡颖、 易敏英、 刘静宇、 高苏娟、 石磊。 出口食品中转基因成分环介导 等温扩增 (LAMP)检 测方法 第1部分 :通 用要求和定义 1 范围 SN/T3767的 本部分规定 了食温扩增 ( L A M P ) 初筛检测方法 、 核酸提取纯化 、 原理 、 试剂 、 仪的范围、 规范性引用文件 、 缩略语 、 器设各 、 检测步骤 、 结果判定和结果 本部分适用于食品原料及其加工产品中转基 因 扩增(LAMP)检测 。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是,仅 注 日期的版本适用于本文 件。凡是不注 日期的引用文件 ,其 文件 。 GB/T6682 分 析实验室用水 GB/T19495.1 转 基 因 产 品 检 测 GB/T19495,2 转 基 因 产 品 检 测 通用要求和定 G B / T 1 9 4 9 5 . 3 转 基 因 产 品 检 室技 提取 G B / T 1 9 4 9 5 , 7 转 基 因 产 品 禾 口 3 术语和定义、 缩略语 3 . 1 术 语和定义 下列术语和定义适用于本文件 3 , 1 . 1 转基因 t r a n s g e n e 将本物种不具有 的 、 来源 于其他 物种 的功能DNA序列 ,通 过各种 导人 手段 ,使 其 在 该 物 种 中进行 表达 ,以 便使该 物种获得新 的品种 特征 。 3,1,2 转基因植物品系 g e n e t i c a l l y m o d i f i e d p l a n t e v e n t 目的基 因成 功导人植 物基 因组并 能在后代 中稳定遗传 即获得转 基 因植 物 品系 ,同 一基 因的不 同转 化体视为不 同的品系 。品系特异性序列指外源插人片段 与植 物基 因组 的连接 区序 列 ,是 转基 因植 物 品 系 的鉴定依据 。 3 , 1 . 3 结构特异性检测 c o n s t r u C t s p e c i f i c d e t e c t i o n 外源插入片段 中两个元件的连接区的DNA序列存在差异 。结构特异性检测是 以外源插人片段 中 两个元件的连接区域为检测对象 。 sN/T3767,卜 -2014 sN/T3767. -2014 3 , 1 . 4 品系特异性检测 e v e n t s p e c i f i c d e t e c t i o n 外源插人片段与植物基因组的连接区序列存在差异。品系特异性检测是以外源基因与植物基因组 相连接区域为检测对象。 3 . 1 , 5 环介导等温扩增 I o o p m e d i a t e d 诒o t h e r m a l a m p I i f i c a t i o n 在Bs莎 DNA聚合酶作用下 ,以DNA为模板 ,以 特异性引物为延伸起点 ,在 60 65 恒温条件 下通过链置换反应进行的DNA扩 增方法 ,扩 增产物是一系列复杂的大小不等的DNA混合物。是一种 区别于PCR等变温扩增反应的新型等温核酸扩增方法 。 3.2 缩略语 下列缩略语适用于本文仵 。 L A M P ( l o o p m 耐i a t e d i s o t h e r m a l a m p h c a o o n ) : 环介导等温扩增 T o t o n 1 0 0 : 聚 乙 二醇 辛基苯基醚 d N T P ( d e o x y r i b o n u c l e o “ d e t r i p h o s p h a t e ) : 脱氧核苷三磷酸 4 防 污染措施 按照 G B / T 1 9 4 9 5 . 2 的规定执行 。 5 抽 样和制样 按照 G B / T 1 9 4 9 5 , 7 的规定执行 。 6 核 酸提取纯化 按照 GB/T19495.3的规定执行 。可以采用商品化的植物基因组 DNA提 取纯化试剂盒 ,所 提取的 DNA质 量应符合GB/T19495.3的 规定 。 7 原 理 7.1 一般原理 根据检测样品 目标核酸序列设计特异性 内引物和外引物各一对或者添加一条或一对环引物 ,特 异 性识别序列上的六个独立区域 ,在 反应缓冲液中脱氧核糖核酸三磷酸 、 寡核苷酸引物在Bs莎聚合酶的作 用下启动循环链置换反应 ,在 特异 目标序列启动互补链合成 ,在 同一链上互补序列周而复始形成有很多 环的花椰菜结构的茎-环DNA混合物 ;从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液 中的 Mg2+结 合 ,产 生 副产物(焦 磷酸镁)形 成乳 白色沉淀 ,加 人显色液 ,即 可通过颜色变化观察判定结果 。在反应混合体系中 不应存在DNA聚合酶的抑制剂 。在设置合适对照和在检测下 限的情况下 ,定 性检测结果要清楚判断 样品是否为转基因产品。 7.2 显色液显色原理 LAMP检测通常使用SYBR Green I或 钙黄绿素两种显色液 ,其 显色原理分别如下 : a) SYBR Green I:一种高灵敏 的DNA荧光染料 ,可 以嵌人方式结合到双链 DNA的 小沟 内。 2 sN/T3767。 -2014 当它与双链DNA结合 时,荧 光信号是游 离状态 的8001000倍 。在不发生 扩增反应 时, SYBR染 料分子的荧光信号不发生改变 ,颜 色显现为橙色 ;当 发生扩增反应时 ,随 着双链DNA 的增加 ,SYBR染料的荧光信号也 随之大 幅度增强 ,其 信号强度可代表双链DNA分子 的数 量 ,同 时颜色由橙色变为绿色。 b) 钙 黄绿素 :在LAMP反应体系中加人预先混合 的钙黄绿素和锰离子 ,未 发生反应时锰离子与 钙黄绿素结合 ,钙 黄绿素的荧光被淬灭 ,呈 现橙色 。当扩增反应发生时 ,扩 增过程 中产生的焦 磷酸根离子可与锰离子结合 ,形 成不可逆的沉淀物 ,将 锰离子从钙黄绿素上释放下来 ,从 而使 钙黄绿素恢复荧光 ,同 时体系中的镁离子与钙黄绿素结合 ,进 一步加强钙黄绿素的荧光 ,可 在 365nm紫 外光激发下散发出约510nm的荧光 ,颜 色也 由橙色转为绿色。 8 试 剂 8.1 除另有规定外 ,所 有试剂均为分析纯或生化试剂 。 8.2 将LAMP反应液分装成小包装 ,每 次取一个小包装进行反应 ,其 余 的小包装保存在一 。 8 , 3 模 板 D N A / 对 照。 8 . 4 水 : 应 符合 G B / T 6 6 8 2 中 一 级水的规格。 8.5 dNTPs溶 液 。 8.6 Bs莎DNA聚合酶 :如 美 国NEB公司或具有 同等效果的DNA聚合酶 。 8 . 7 1 0 T h e r m l P o l 缓 冲液: 含 2 0 0 m m o l / L T s H C l ( p H 值 为 8 . 8 ) 、1 0 0 m m o l / L 硫 酸铵、 1 0 0 m m o l / L 氯 化钾、 m m o l / L 硫 酸镁、1 % T o t o n 1 0 0 。 8.8 硫 酸镁溶液 。 8.9 甜 菜碱。 8 . 1 0 显 色液: S Y B R G r e e n I 或者钙黄绿素。 8.ll 引 物 :包 括外引物1,外引物2,内引物1和内引物2,必要时包括环引物1或(和 )环 引物2。 9 仪器设备 9 . 1 水 浴锅或加热模板 : 6 3 . 0 0 , 5 和 8 0 . 0 o . 5 。 9 . 2 离 心 管 : 0 , 1 m L 、 1 . 5 m L 。 9 . 3 移液器: 量 程0 . 5 u L 1 0 u L ; 量程1 0 u L 1 0 0 u L ; 量程1 0 0 u L 1 0 0 0 u L 。 9.4 计 时器 。 10 检 测步骤 10,1 一般性要求 检测样品中DNA的提取和含量测定应按照GB/T19495.3中的规定执行 。对样品进行DNA提取 时要保证DNA的质量和浓度的稳定 ,以 保证 LAMP反 应的可重复性。检测样 品DNA进行LAMP检 测时应做平行实验 。 10.2 LAMP扩 增反应的-般要求 1 A M P 反 应体系包括 d N T P s 、甜 菜碱 、缓 冲液、M g 2 + 、引物、B s 莎 D N A 聚合酶、模板和水。其中, Mg2+浓 度 、 甜菜碱浓度 、 dNTPs浓 度以及反应温度要针对每个引物和体系进行优化 。Mg2+浓度一般 为 4 m m o l / L 1 0 m m o l / L , 甜菜 碱浓度为 0 . 6 m o l / L 1 , 2 m l / L , d N T P s 浓 度为 1 . 2 m m o l / L 3 sN/T3767。-2014 1 . 8 m m o l / L , 反应 温度为 6 0 , 0 6 7 . o 。 10,3 LAMP反应设计 10.3.1 一 般要求 LAMP反 应的特异性取决于 目的片段 的保守性和引物 的设计 ,筛 选 出合适 的 目标序列和引物 ,优 化实验条件 以使反应具有 良好的重复性以及抗外界干扰能力 。 10.3,2 扩 增片段的大小 LAMP扩 增是链置换合成反应,目 标序列 的长度直接影响LAMP的扩增效率,目 的片段应在 3 0 0 b p 以 内 , 一 般在 1 8 0 b p 0 10.3.3 引 锦 勿 10.3.3.1 一 般要求 在附录A中给出引物完整的序列信息资 10.3.3.2 引 物设计 LAMP引 物设计是基于 目标 于 5 端 的 B 1 、 B 2 、 B 3 区6 个 不同 的位点设计 的一对 内引物(HP a) FIP: (Forward Inner Pr 标序列F1的 互补序列)缅 灰而 b ) B I P : ( B a c k w a r d I n n e r P “ m e r ) 下 游内引物 B1的互补序列)组 成的。 F3:(Forward outer Pri 1,具 体包括以下部分 : 列F2)和位于5端的F1c区(目 目标序列B2)和 B1c区(与 目标序列的 列 的F3c区段互补 )组 成 。 列的B3c区 互补)组 成 。 序列的FLPc区段互补)组 成 。 示 序列的BLPc区段互补)组 成 。 C) d) e) f) 83: (Backward Outer FLP: (Forward Loop BLP:(Backward 夕 卜 引 夕 卜 环 )下游 F3 F3c F2c FLP F1cB1 BLPc B2 B3 3 |。玄 5 、 氵 I F3 F2 FLPc F1B1c BLP B2c B3c BLP BLP 图1 LAMP法引物的设计 sN/T3767, -2014 10,3,3.3 引 物设计的原则 引物设计应遵循以下原则 : a ) F 2 区段 的5 端 到 B 2 区段 的5 端 之 间 的 距 离 宜 是 1 2 0 b p 1 8 0 b p : F 3 区 段 的 3 端 到 F 2 区段 的5端之间的距离是宜0bp bp(同理 B2和 B3之间的距离宜是0bpbp);F2区 段的 5 端到F1区段的5端(形 成环的部分)之 间的距离宜是40bp60bp; b) 对 于GC含量正常或是GC含量富集 的引物Tm值为60 C65,而 对于AT富集 的引物 T m 值 为 5 5 6 0 ; c ) F 2 、 B 2 、 F 3 、 B 3 、 F L P 、 B L P 的3 末 端以及 F 1 c 和B l c 的5 末 端 6 b p 的 自由能改变值 -4kCal/m l; d) e) f) g) h) 引物GC含量在40%6 引物 自身 、 引物间没有结 内部没有二级结构 ; 必要时可以引人合适的酶切位点 ; 可以使用 Primer Expl。rer Version 10,3.3,4 引物的验证 引物的验证如下 : a) 应证实引物能够扩增其 目 b) 引 物的验证分两步 ,首 先 c) 理 论评价至少应该在一个 主要 的核酸序 : E M B L , G e n B a n k ) 里进行 F a s t A 或 Blast等 序列同源性 比对 ,评生 物 同源序列 ; d) 在引物特异性的实验评价 确目标序列和相近生物 的基 因序 列及阴性对照。 10.3,3,5 对照 LAMP反应需设立至少包 合 G B / T 1 9 4 9 5 , 1 规 定。 1 0 , 4 L A M P 检测方法的类型 性对 J白试 剂 对 照 , 对 照 的设 置应 符 对食 品中转基 因成分 的定性 检测食 品的分析要 求采取不 同的LAMP实验 。 包括 : a) 物 种特异性检测方法 ; b) 筛 选检测方法 ; c) 结 构特异性检测方法 ; d) 品 系特异性检测方法 ; e) 常 见商品化转基因作物品系外源基因的主要信息参见附录A。 10,5 LAMP检 测阳性结果的确证 本系列标准给出了各种LAMP检测方法 。对LAMP检测结果为阳性 的样 品,应 进行进一步确证 实验。可根据需要选择下列方法之一: a) 实 时荧光PCR检测 ; b) 对PCR扩增产物进行序列测定 ; sN/T3767。卜-2014 c) Southern杂z突 ; d) 其 他确证方法 。 ll 结 果判定 ll。1 检测样品DNA的两个平行检测结果保持一致 的情况下可进行结果判定和表述 。如果其 中一个 平行的检测 目标片段出现扩增而另一个 目标片段未 出现扩增时,应 重新进行检测。可通过增加反应 中 DNA的 模板量 ,使 两个平行检测结果一致 。重新检测的结果如果仍然不一致 ,则 按照 目标片段 出现扩 增进行结果判断和表述 。 ll。2 所检测 目标片段未出现扩增 ,所 有对照结果正常 ,结 果判定为阴性 ;所 检测 目标片段 出现扩增 ,应 按照确证实验情况进行结果判断和表述 。 12 结 果表述 12.1 一 般要求 实验结果不能用“+/ ” 来表述 。阴性结果不能用“不含GMO”(“ GMO not present”)来 表述 。 12,2 阴 性结果的表述 检测报告应该包括下列 内容 :“该样品未检出转基因(物 种) 品系。 ” 12.3 阳 1性 结果的表述 、 检测报告应该包括下列内容 :“检测结果为转基 因(物 种) 品系初筛 阳性 ,应 按照确证 实验情况进行结果判断和表述 。 ” sN/T3767。卜-2014 囟硼赆诔遭 P“ d口冖喇冖 屮o“雨 冖 “汩 恧赎以以避姐00臼 臼 丐舀只 05飞O 凶泄赢艹函 硼m M 臼冖冖H 一 屮 。 P“冖口的卩. 叫巛氍姬擎丽啬闵巛鉴K 0雨口“P口o 屮0雨冖0。的口“冖、P岗口 曰霜幂嚣避姐删脚粼田 曰7宀臼 “岿冖 雨口。阳G 日口冖屮匕雨冖 串叫巛避妪缧耐甾闷刨巛鉴饫 讠d臼 P“屮雨冖卩。“冖0 “ 凶泄鼠器8口掴鞋兴 口0冖 卩“冖口“口 l 岗卩、 “口屮丿飞 萏烈 凶妆纛艹 氍揆姬甾酾恁匪扣鹱山 屮萏0副照郫g廿斛邸姐兴 冖、 卩臼 卩冖屮 “屮p口雨“P岗冖0一。 u、臼 “O一。口“口 掣靼 H H 螟烁 冂 卩 u蝌粼志 舳巛爿兴艹斟 朴巛爿兴艹龄 遐蓰兴恋粼岬 鉴蓰兴画艹 口。hd臼 0、臼 . 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