蛋白质溶液的浓缩方法.ppt

1,蛋白质溶液的浓缩方法,2,目录,1,蛋白质种类和特性,2,蛋白质浓缩,3,常用浓缩方法,4,小结与展望,3,蛋白质的种类,4,蛋白质的性质,胶体性质 蛋白质的分子量在1万-100万之间，直径在1-100nm之间，属于胶体粒子。蛋白质的水溶液是一种比较稳定的亲水胶体，这是因为在蛋白质颗粒表面带有很多极性基团，如NH3、COO-、OH-、SH、CONH2等和水有高度亲和性，当蛋白质与水相遇时，就很容易在蛋白质颗粒外面形成层水膜。 两性解离和等电点 蛋白质同氨基酸一样也是两性电解质，在一定的pH条件下，能解离为带电基团从而使蛋白质带电。 蛋白质的变性,5,蛋白质溶液的浓缩方法,蛋白质溶液的浓缩连接了蛋白质的提取和蛋白质的分离纯化，是获取高浓度或高活性蛋白质的重要步骤。 浓缩目的：提高蛋白质浓度；减少样品体积； 便于进一步纯化。 常用的浓缩方法： 沉淀法（蛋白质的沉淀性质） 吸附法（吸水剂） 冻干法（真空低温脱水） 超滤法（分子量）,6,1.1 盐析法,1.2 低温有机溶剂沉淀法,1.3 等电点沉淀法,1.4 生成盐复合物沉淀法,1. 沉淀法,1.5 选择变性沉淀法,1.6 非离子多聚物沉淀法,7,1. 沉淀法,沉淀法浓缩蛋白质溶液，指将蛋白质分子凝聚从溶液中析出的现象。 沉淀法是比较传统的分离纯化蛋白质的方法，目前仍然广泛使用。一般常用的沉淀浓缩有硫酸铵沉淀法、（低温）有机溶剂沉淀法、丙酮沉淀法、免疫沉淀法、三氯醋酸沉淀法、聚乙二醇沉淀法等。,8,1.1 盐析法,定义：盐析一般指溶液中加入无机盐而使某种蛋白质溶解度降低而析出的过程。 原理：高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，使溶液中自由水分子数减小，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来。,9,1.1 盐析法,盐类的选择：价格低； 溶解度好； 溶解过程中产热少； 盐溶液密度与沉淀的密度有明显差别。 一般来说：高价阴离子：PO43- SO42- Ac-和NO3-， 单价阳离子：NH4+ K+和Na+， 高价阴离子的沉淀效果优于单价阳离子。,10,1.1 盐析法,e.g 硫酸铵盐析法浓缩蛋白质溶液 硫酸铵因其价格便宜、溶解度高且对温度的敏感性低而被常用于沉淀蛋白质。 操作方法：（1）加入固体硫酸铵，适用于要求饱和度较高而不增大溶液体积的情况； （2）加入饱和硫酸铵溶液，适用于要求饱和度不高而原来溶液体积不大的情况； （3）透析平衡法（多用于结晶），先将盐析的样品装于透析袋中，然后浸入饱和硫酸铵中进行透析，透析袋内硫酸铵饱和度逐渐提高，达到设定浓度后目的蛋白析出。,11,1.1 盐析法,硫酸铵盐析法的注意事项： （1）由于蛋白质沉淀的密度与硫酸铵饱和溶液的密度相近，因此离心分离沉淀物时一般需要高速离心机。 （2）硫酸铵会使溶液略微酸化，可用氨水进行调节。 （3）注意饱和度表中规定的温度，加入固体硫酸铵盐后的体积变化已考虑在表中； （4）盐析后一般放置半小时至一小时，待沉淀完全后才过滤或离心。离心多用于低浓度硫酸铵溶液，而过滤多用于高浓度硫酸铵溶液； （5）硫酸铵中可能含有少量的重金属离子，使用前必须用H2S处理。,12,1.2 低温有机溶剂沉淀法,原理： （1）甲醇、乙醇、丙酮等有机溶剂加入水中使溶剂介电常数降低，增加了相反电荷的吸引力； （2）上述有机溶剂是强亲水试剂，破坏蛋白质胶体分子表面的水化层而使分子聚集沉淀。 有机溶剂的选择： 有机溶剂首选能与水混容的，常用乙醇、甲醇、丙酮等。大多数蛋白质通过加入等体积的丙酮或四倍体积的乙醇就可以沉淀下来，但也造成的了蛋白质溶液的稀释，所以蛋白质溶液的浓度一般要在1mg/ml以上。,13,1.2 低温有机溶剂沉淀法,影响因素： （1）温度：低温可保持生物大分子活性，同时降低其溶解度，提高提取效率； （2）样品浓度和pH： 与盐析法中的作用基本相同； （3）金属离子：一些多价阳离子如Zn2+和Ca2+在一定pH下能与呈阴离子状态的蛋白质形成复合物，这种复合物在水中或有机溶剂中的溶解度都大大下降，而且不影响蛋白质的生物活性。 （4）离子强度：盐浓度太高或太低都对分离有不利影响，对蛋白质和多糖而言，盐浓度不超过5%比较合适，使用的乙醇量不宜超过二倍体积。,14,1.2 低温有机溶剂沉淀法,优缺点： 优点：（1）分辨力高于盐析法，即蛋白质只在一个比较窄的有机溶剂浓度下沉淀； （2）沉淀不用脱盐，过滤更为容易。 缺点：容易使蛋白质变性失活，操作要求在低温下进行。如利用丙酮沉淀蛋白质时，必须在04低温下进行。蛋白质被丙酮沉淀后，应立即分离，否则蛋白质会变性。,15,1.3 等电点沉淀法,原理：两性电解质分子上的净电荷为零时溶解度最低。 适用范围：只适用于水化程度不大、在等电点时溶解度很低的蛋白质，如酪蛋白。对于亲水性很强的蛋白质，在等电点附近仍然有很大的溶解度，用等电点法沉淀不完全。 等电点法常与盐析法、有机溶剂沉淀法或其他沉淀方法联合使用，以提高其沉淀能力。 优缺点： 优点：很多蛋白质的等电点在偏酸性范围内，调节pH时所需要的无机酸价格低，操作也比较方便。 缺点：对低pH敏感的蛋白应避免使用此法。,16,1.4 生成盐复合物沉淀法,蛋白质可生成盐类复合物沉淀，主要方法： （l）与酸性功能团作用的金属复合盐法（如铜盐、银盐、锌盐、铅盐、锂盐、钙盐等），沉淀可通以H2S使金属变成硫化物而除去； （2）与碱性功能团作用的有机复合盐法（如苦味酸盐、苦酮酸盐、丹宁酸盐等），沉淀加入无机酸并用乙酸萃取，或用离子交换法除去。 （3）无机复合盐法（如磷钨酸盐、磷钼酸盐等）。 但值得注意的是，重金属、某些有机酸与无机酸和蛋白质形成复合盐后，常使蛋白质发生不可逆的沉淀，应用时必须谨慎。,17,1.5 选择变性沉淀法,原理：利用蛋白质对某些物理或化学因素的敏感性不同，有选择地使之变性沉淀，以达到分离提纯的目的。 方法： （1）利用表面活性剂（三氯乙酸）或有机溶剂； （2）利用生物大分子的热不稳定性，加热破坏某些组分，而保存另一些组分； （3）酸碱变性沉淀。很多蛋白质在pH5.0或以下被沉淀，只有少数蛋白质在中性或碱性条件下形成沉淀，且可以通过调节pH来去除杂蛋白。,18,1.6 非离子多聚物沉淀法,背景：非离子多聚物是六十年代发展起来的一类重要沉淀剂，最早用于提纯免疫球蛋白、沉淀一些细菌和病毒，近年来逐渐广泛应用于核酸和酶的分离提纯。 包括不同分子量的PEG（常用PEG-6000）、NPEO、葡聚糖、右旋糖酐硫酸钠等。 方法：（1）基于不同蛋白质的表面结构不同，分配系数不同，可选用两种水溶性非离子多聚物组成液/液两相体系，不等量分配而分离沉淀。 （2）选用一种水溶性非离子多聚物，使蛋白质在同一液相中，由于分子相互排斥而凝聚导致蛋白析出。该方法操作时先离心除去大悬浮颗粒，调整溶液PH值和温度至适度，然后加入中性盐和多聚物至一定浓度，冷贮一段时间，即形成沉淀。,19,2.1 透析袋吸附法,2.2 凝胶吸附法,2. 吸附法,20,吸附法,定义：通过吸附剂直接去除溶液中的水分子以达到浓缩蛋白质溶液的目的。 吸附法是最简单快速的浓缩蛋白质溶液的方法，所需仪器简单，特别适用于稳定性较差的蛋白质。 吸附剂的选择： （1）吸附剂不能与溶液发生化学反应； （2）吸附剂对蛋白质不吸附； （3）吸附剂易于溶液分开。 常用的吸附剂：PEG、聚乙烯吡咯酮、蔗糖、凝胶等。 常用的吸附方法：透析袋法和凝胶浓缩法。,21,2.1 透析袋吸附法,透析袋吸附法在透析技术的基础上改良而来的。 传统的透析是基于分子质量大小的液相分离技术，它由透过半透膜的选择性扩散来实现。但是纯粹的透析主要用于除去小分子类的溶质，而要达到浓缩（即除去溶剂）的目的则费时较长。 透析袋吸附法是将透析液换成可以吸水的溶液或者固体吸附剂，这样可实现很好的浓缩作用。,22,2.1 透析袋吸附法,具体操作： 将蛋白质溶液加入到透析袋中（无透析袋可以用玻璃纸代替），结扎好后将PEG、蔗糖等吸附剂撒在透析袋外；或者把吸水剂配成30%-40%的溶液，将装有蛋白质溶液的透析袋放入吸附剂溶液中。吸水剂用过后，可放入温箱中烘干或自然干燥后重复利用。 优缺点： 优点：该方法简单高效，操作过程中可以保持蛋白质不变性，吸附剂可回收利用。 缺点：蛋白质可能吸附在透析膜上，导致回收率低。操作过程需要低温。,23,2.2 凝胶吸附法,定义：凝胶是一种惰性多孔聚合物，孔径较小的凝胶具有很强的吸水性，适宜浓缩分子量在10000以上的蛋白质。 常用的凝胶有Sephadex G系列以及Bio-GelP系列凝胶。,具体操作：将干的凝胶加入到蛋白质溶液中吸收水分子和其他小分子，当凝胶完全膨胀后，用过滤或立信德方法除去凝胶，即可得到浓缩后的蛋白质溶液。 注意事项：溶液的pH值应大于被浓缩物质的等电点，否则在凝胶表面会产生阳离子交换，影响蛋白质的回收率。,24,3.1 原理,3.2 操作过程,3. 真空冷冻干燥法,25,3.1 原理,冻干法是指将蛋白质溶液在低温下冻结，然后在真空条件下升华干燥，除去冰晶，待升华结束后再进行解吸干燥，除去部分结合水的干燥方法，最终达到浓缩蛋白质溶液的目的。,26,3.1 原理,冷冻速率会影响最终产品的质量。慢速冷冻，快速冷冻。,80% 的溶剂被除去，残留的溶剂以湿气的形式吸附在产品上。,残留溶剂降低到足以抑制微生物生长或化学反应发生的水平，同时保持了冻干蛋白的活性和完整性。,需要使用时，加蒸馏水或生理盐水制成悬浮液，即可恢复原状态。,27,3.2 操作过程,油面一定不能低于油镜的中线。严禁无油或低油位开启真空泵。,28,4.1 原理,4.2 超滤装置及类型,4. 超滤法,4.3 超滤膜的选择,4.4 注意事项,29,4.1 原理,超滤（Ultrafiltration）技术是一种膜滤法，也有错流过滤（Cross Filtration）之称。其基本原理是在常温下以一定压力和流量，利用不对称微孔结构和半透膜介质，依靠膜两侧的压力差作为推动力，以错流方式进行过滤，使溶剂及小分子物质通过，大分子物质和微粒子如蛋白质、水溶性高聚物、细菌等被滤膜阻留，从而达到分离、分级、纯化、浓缩目的的一种新型膜分离技术。 实验室常用超滤管和冷冻离心机，实现蛋白质溶液的超滤浓缩。,30,4.2 装置及类型,31,4.2 装置及类型,32,4.3 超滤膜的选择,超滤技术的关键是膜。 常用的膜一般是由乙酸纤维或硝酸纤维或此二者的混合物制成。近年来为适应制药和食品工业上灭菌的需要，发展了非纤维型的各向异性膜，例如聚砜膜、聚砜酰胺膜和聚丙烯腈膜等。这种膜在pH 114都是稳定的，且能在90下正常工作。 超滤膜通常是比较稳定的，若使用恰当，能连续用12年。暂时不用，可浸在1甲醛溶液或0.2 叠氮化钠NaN3中保存。,33,4.3 超滤膜的选择,34,4.3 超滤膜的选择,不同截留分子量(MWCO)的超滤膜选择指南,35,4.4 注意事项,36,4.4 注意事项,提高超滤收率方法（样品在微克级别）： （1） 根据样品处理量，选择最小可用的超滤容器，在小容器中反复添加样品，反复超滤。 （2）在适量范围内，选截留分子量最低的超滤膜。 （3）如可能，使用水平转头代替角转头离心，这样可减少在离心过程中溶液与离心管接触的表面积。 （4）将压力或离心力降低到大约最大推荐数值的一半。 （5）避免过度浓缩，最终体积越小，越难得到完全回收，如可