艾滋病感染实验室检测.ppt

艾滋病感染实验室检测,郭志宏 浙江省疾控中心 电话/传真:Email: ,2006年10月12日浙江省艾滋病治疗培训班,HIV相关检测目的,1.临床诊断 2.安全输血 3.流行病学调查、高危人群监测 4.自愿咨询检测VCT 5.抗病毒治疗后效果检测 6.抗病毒治疗耐药性检测 7.免疫功能测定,2006年10月12日浙江省艾滋病治疗培训班,HIV感染的实验室检测方法,常用HIV病原学检测方法: 1. 核酸检测（ cDNA测定-PCR、 RNA测定-病毒载量） 2. 病毒培养分离 3. P24抗原检测 常用HIV抗体检测方法: 初筛：1.酶联免疫吸附法 ELISA：第三代、第四代 2.快速检测 RT：金标、硒标 3.简单法 PA: 明胶颗粒凝集 确证：免疫印迹法 WB:（Western Blot）、RIBA 其他相关检测方法: 免疫功能测定：CD4/CD8检测,2006年10月12日浙江省艾滋病治疗培训班,（一）HIV核酸检测,1. HIV核酸定性检测：通常使用PCR或 RT-PCR技术，用于HIV感染的辅助诊断。 2. HIV核酸定量检测：使用RT-PCR, NASBA, bDNA等技术，常用于监测HIV感染者的病程进展和抗病毒治疗效果。,2006年10月12日浙江省艾滋病治疗培训班,核酸检测特点：,能够用于常规不能培养和分离的病毒的检测（如HBV、HCV、HIV等）； 仅需少量标本或标本中仅含少量病毒也能检测； 在病毒感染的急性期抗体尚未出现之前，病毒感染的诊断主要依靠NAT，适用于早期诊断； 可对病毒进行定量检测，有助于疗效监测； 可对病毒基因进行基因分型，比血清分型更有价值； 通过对病毒耐药基因的检测，可预测或发现病毒的耐药性； 可用于先天性或围产期获得性病毒感染的诊断； 灵敏度高（可达ng甚至fg水平，理论上能检出单个病毒基因），特异性好、快速、简捷。,2006年10月12日浙江省艾滋病治疗培训班,定量NASBA技术：,是由一对引物引导的，连续均一的体外特异核苷酸序列的等温扩增的酶促反应过程。 优点：操作十分简单，只需将制备好的模板直接加到反应体系中，恒温41培育1.52小时，即可将模板扩增109倍。 NASBA反应体系包括AMV反转录酶、RNA酶H、T7RNA聚合酶、核糖核苷三磷酸、脱氧核糖核苷三磷酸、两个特异的引物及适宜的缓冲液。 NASBA的反应分为两相：循环相和非循环相。,2006年10月12日浙江省艾滋病治疗培训班,NASBA图解,引物1,逆转录酶,RNA酶H,逆转录酶 引物 2,T7 RNA多聚酶,引物 2,逆转录酶,逆转录酶,RNA酶 H 引物1,liniar phase,amplification phase,2006年10月12日浙江省艾滋病治疗培训班,PCR反应图解,2006年10月12日浙江省艾滋病治疗培训班,bDNA信号扩增技术,主要包括分枝DNA检测（branched DNA assays）和杂交捕获检测（hybrid capture assays）。 检测时病原模板并不扩增，而是通过对检测信号的放大来实现对病毒核酸的检测和定量。,2006年10月12日浙江省艾滋病治疗培训班,bDNA HIV 核酸检测的反应原理,2006年10月12日浙江省艾滋病治疗培训班,核酸检测主要应用：,1） 早期诊断围产期HIV感染的辅助诊断： 宫内感染（检测定义）： 新生儿出生48小时内，检测到病毒核酸，或病毒培养阳性，则提示孕期（宫内）感染。 对围产期感染儿童在18月龄前的早期诊断，目前以2次核酸检测结果作为辅助诊断的依据。2次不同时间的样本核酸检测均为阳性提示为HIV感染，均为阴性提示未感染。同时18个月时做抗体检测，当18个月HIV抗体确证阳性方可诊断 HIV感染。,2006年10月12日浙江省艾滋病治疗培训班,核酸检测主要应用：,2）对18个月婴儿HIV抗体WB试验的不确定（或可疑）结果进一步做辅助诊断； 3）在HIV抗体未产生之前（窗口期）辅助诊断急性原发感染； 4）HIV亚型分析；确定人群中HIV的变异； 5）监测临床抗病毒药物治疗效果； 6）检测病毒的耐药性突变。,2006年10月12日浙江省艾滋病治疗培训班,（二）HIV病毒分离培养,将病人淋巴细胞与正常人的淋巴细胞共同培养，适当周期培养后测定培养液HIV p24抗原/RT，从而判断病人的淋巴细胞是否受到HIV感染。 细胞培养与血清学方法相比，专一性很强，不会出现假阳性。但其敏感性不如血清学或PCR。 必须在P3级生物安全实验室进行。,2006年10月12日浙江省艾滋病治疗培训班,HIV病毒分离培养的应用,1.能得到最原始的临床毒种，其重要意义在于确认对WB不确定的可疑感染者及母婴传播、婴幼儿HIV感染者。对法律纠纷或职业暴露明确毒主株亲缘关系。 2.毒株可用于抗病毒药物筛选，耐药性及其生物学特性等研究。 3.用定量细胞培养法可测定细胞的半数感染单位（TCID50）和半数抑制药物浓度（IC50）用于抗病毒药物测定。或消毒杀菌药品的效果评价。 本法一般不用于常规诊断。,2006年10月12日浙江省艾滋病治疗培训班,（三）HIV p24抗原测定及适用范围：,是一种血清学夹心法EIA。 （1） HIV-1抗体不确定或窗口期的辅助诊断。 （2）HIV-1抗体阳性母亲所生婴儿早期的辅助诊断。 （3）第四代HIV抗原/抗体ELISA试剂检测呈阳性反应，但HIV-1抗体确认试验呈阴性者的辅助诊断。 （4）监测病程进展和抗病毒治疗效果。,2006年10月12日浙江省艾滋病治疗培训班,HIV-1 P24抗原检测结果报告和解释：,（1）HIV-1 P24抗原的阳性结果必须经过中和试验确认，若阳性标本的OD值比中和反应前减少50%以上，才确定为HIV P24抗原结果阳性。 （2）HIV-1 P24抗原阳性仅作为HIV感染的辅助诊断依据，不能据此确诊。 （3）HIV-1P24抗原阴性结果只表示在本试验中无反应，不能排除HIV感染。,2006年10月12日浙江省艾滋病治疗培训班,（四）HIV抗体检测,检测抗-HIV抗体是HIV/AIDS诊断的一项重要指标，抗-HIV抗体测定作为血清学诊断要求准确、可靠，必须经初筛、复检试验和确认实验三个步骤。 初筛实验方法主要有：酶联免疫试验（ELISA）、明胶颗粒凝集试验（PA）、快速免疫（层析或渗滤）试验（RT）。 确认试验主要用免疫印迹试验（ WB）。,2006年10月12日浙江省艾滋病治疗培训班,抗体检测的目的,1.输血和移植安全（为了接受者的安全） 2.监测(为了知晓人群流行状况) 3.临床HIV疾病的诊断和VCT检测 (为了知晓个体感染状况） 为了达到以上的某个目的的HIV 检测可能不适合其他目的，比如输血服务的检测不适合临床诊断HIV感染,2006年10月12日浙江省艾滋病治疗培训班,1、酶联免疫吸附法ELISA原理,第一、二代,第三代,第四代,2006年10月12日浙江省艾滋病治疗培训班,= 窗口期,HIV感染窗口期,2006年10月12日浙江省艾滋病治疗培训班,2、快速检测试验（RT）,快速HIV试剂的原理* 颗粒凝集 （Particle Agglutination, PA) 免疫渗漏 （Immunoconcentration, Flow through, FT) 免疫层析 （Immunochromatograpy, lateral flow, IF),2006年10月12日浙江省艾滋病治疗培训班,目前在国内批准注册的国外进口试剂有：Determine HIV1/2（ABBOTT，雅培）、Instant CHEK-HIV1+2（EY）、麦美华、中新科炬 一般10-30min内出结果。 2003年国内已有产品被SFDA批准。有金豪、万泰、艾康、科华 * 用最新快速HIV试剂检测HIV抗体比第三代EIA晚28天,快速检测试剂的应用,2006年10月12日浙江省艾滋病治疗培训班,快速检测的优点,1.操作更快 2.不需要成批实验 3.不需要使用特殊仪器 4.检测的当天就给出结果 5.只能采用经过WHO推荐的快速HIV抗体检测，以确保质量,2006年10月12日浙江省艾滋病治疗培训班,快速检测的影响因素, 检测的目的 实验的敏感性和特异性 受检测人群的HIV的流行率,2006年10月12日浙江省艾滋病治疗培训班,3、明胶颗粒凝集试验（PA）,PA是一种简便的HIV血清抗体检测方法。先将样品稀释，然后分别加入经抗原致敏的和未致敏的明胶颗粒，混匀后保温（一般为室温）。 操作简便，无需特殊仪器设备，适合对少量标本的检测。血清中有HIV抗体存在时，经抗原致敏的明胶颗粒与抗体发生抗原-抗体反应，根据明胶颗粒在孔中的凝集情况判读结果。,2006年10月12日浙江省艾滋病治疗培训班,（二）HIV抗体确认试验,免疫印迹式验（WB）原理： WB是将HIV病毒蛋白用SDS-PAGE电泳，把分子量大小不等的蛋白带分离开来，然后再把这些已经分离的不同蛋白带电转移到硝酸纤维素膜上。在受检血清中检测能够和一系列病毒蛋白发生反应的不同的抗体。原理类似与ELISA试验。,2006年10月12日浙江省艾滋病治疗培训班,HIV抗体检测策略,经典程序 初筛+确认 ( ELISA+WB ) 替代程序 策略I 一次ELISA 应用于筛查献血员 策略II 二次ELISA 应用于流行病学监测 策略III 三次ELISA 应用于高流行区临床诊断,2006年10月12日浙江省艾滋病治疗培训班,HIV检测策略,检测顺序: 首先应选择最敏感的实验 第二次实验应该采用更特异的实验,2006年10月12日浙江省艾滋病治疗培训班,队列检测与平行检测,队列检测 (最普遍) : 第一个实验应用高敏感性实验以减少假阴性结果 除非第一个实验结果为阳性，否则就不需要做第二个实验了 平行检测: 对于每一个样本总是作两种HIV抗体实验 这两种实验的抗原靶和方法不同 一种实验为高敏感性，另一种为高特异性,2006年10月12日浙江省艾滋病治疗培训班,HIV抗体筛查试验: ELISA、PA、RT,第1种筛查试剂（高敏感性）,第2种筛查试剂（高特异性）,阳性,阴性,阳性,阴性,第3种筛查试剂（高特异性）,提供疑似阳性咨询建议进一步做确认试验,确认试验,阳性,阴性,阳性,阴性,不确定,提供咨询随访，建议3个月后再次做确认试验,出具“HIV抗体阳性”报告提供咨询、指导、随访,出具“HIV抗体阴性”报告提供咨询、指导常规孕期保健,知情同意选择妊娠结局,检测前咨询，知情同意,对VCT、孕妇进行HIV检测策略（常规）,2006年10月12日浙江省艾滋病治疗培训班,同时用两种不同的快速检测试剂进行HIV抗体筛查试验,若产妇已临产，且只能用一种快速试剂检测，结果阳性。,两个均阴性,一阴一阳或两个均阳性,检测后咨询，解释结果,正常分娩,检测后咨询，知情同意选择干预措施,孕妇临产后/分娩前服用NVP200mg,产后进行HIV确认试验,产后暂时无法进行确认试验时,阳性,检测前咨询，知情同意,对临产产妇和急诊病人进行HIV检测策略,2006年10月12日浙江省艾滋病治疗培训班,婴儿12个月进行HIV抗体筛查试验,阴性,阳性,用另一种筛查试剂再次检测,阴性,阳性,排除儿童感染常规儿童保健,18个月时再进行HIV抗体筛查试验,对父母检测前咨询，知情同意,对HIV感染的产妇分娩的婴儿HIV检测策略,2006年10月12日浙江省艾滋病治疗培训班,排除儿童感染常规儿童保健,阴性,阳性,用另一种筛查试剂再次检测,确认试验,阴性,阴性,阳性,纳入当地艾滋病综合防治系统,18个月时再进行HIV抗体筛查试验,2006年10月12日浙江省艾滋病治疗培训班,检测结果的报告和处理1,1、HIV抗体筛查 筛查试验呈阴性反应出具HIV抗体阴性报告。 筛查试验呈阳性反应，可出具“HIV抗体待复查”报告，不能出阳性报告。同时应尽快进行以下处理： （1）认真核对病人身份，填写HIV抗体复查送检单，检测人和审核人签字。 （2）尽可能重新采集受检者的血样。 （3）将二份血样（或仅原血样）连同HIV抗体复查送检单一并送当地艾滋病 筛查中心实验室或直接送确认实验室确认。 （4）筛查中心实验室应尽快用两种试剂进行复测，如结果均阳性或一阴一 阳，则应将送检标本和HIV抗体复查送检单一并送艾滋病确认实验室确 认。如复检结果均为阴性，在送检单上盖上“HIV抗体阴性（一）”字样 图章，并及时将结果反馈送检单位，不必再送确认实验室。 （5）做好检测后咨询。,2006年10月12日浙江省艾滋病治疗培训班,检测结果的报告和处理2,2、HIV抗体确证 确证试验呈阴性反应出具HIV抗体阴性报告。 确证试验呈阳性反应，认真核对身份后可出具HIV抗体阳性报告。做好检测后咨询和阳性告知工作，同时应尽快按照传染病法要求向有关部门报告疫情。 确证试验结果不确定，做好检测后咨询，要求定期随访。,2006年10月12日浙江省艾滋病治疗培训班,检测前咨询要点,建立咨询关系，强调保密，了解求询者的要求。 评估求询者的感染危险性。 评估求询者有关艾滋病知识的水平和应付危机的能力。 提供必要的知识和信息。 解释检测方法，解释“窗口期”，说明检测过程。 讨论检测可能带来的利弊，阳性或阴性结果的意义和潜在的