姓名：王连连导师：梁建生专业：植物学.ppt

姓名：王连连 导师：梁建生 专业：植物学,蛋白质相互作用的研究方法,人类蛋白质组相用,有一些蛋白质可以以单体的形式发挥作用，但是大部分的蛋白质都是和伴侣分子或是与其他蛋白质一起发挥作用的。,举世瞩目的基因组计划使大量的新基因不断被发现，然而单纯的基因组DNA序列尚不能解答许多生命问题。基因是相对静态的，而基因编码的产物蛋白质则是动态的，具有时空性和调节性，是生物功能的主要体现者和执行者。蛋白质的表达水平、存在方式以及相互作用等直接与生物功能相关。 在所有生命活动中，蛋白质之间的相互作用是必不可少的，它是细胞进行一切代谢活动的基础。细胞接受外源或是内源的信号，通过其特有的信号途径，调节其基因的表达，以保持其生物学特性。在这个过程中，蛋白质占有很重要的地位，它可以调控, 介导细胞的许多生物学活性。,为了更好地理解细胞的生物学活性，必须很好地理解蛋白质单体和复合物的功能，这就会涉及到蛋白质相互作用的研究。因此，揭示蛋白质之间的相互作用关系、建立相互作用关系的网络图，已成为蛋白质组学研究中的热点。研究蛋白质相互作用的方法也就具有更为重要的意思。,免疫共沉淀,荧光共振转移技术,噬菌体展示技术,酵母双杂交技术,基因外抑制子,合成致死筛选,分子生物学方法,亲和印迹,Pull down 试验,遗传学方法,蛋白质相互作用研究方法,生物物理学方法,融合蛋白pull-down实验,融合蛋白pull-down技术基本原理是将一种蛋白质固定于某种基质上(如Sepharose),当细胞抽提液经过该基质时，可与该固定蛋白相互作用的配体蛋白被吸附，而没有被吸附的“杂质”则随洗脱液流出。被吸附的蛋白可以通过改变洗脱液或洗脱条件而回收下来。 为了更有效地利用pull-down技术，可以将待纯化地蛋白以融合蛋白地形式表达，即将“诱饵”蛋白与一种易于纯化地配体蛋白相融合。1988年Smith等利用谷胱甘肽S转移酶（glutathione-S-transferase ,GST）融合标签从细菌中一步纯化出GST融合蛋白。从此GST融合蛋白在蛋,白质相互作用研究领域里得到极大的推广。GST融合蛋白在经过固定有GST(glutathione)的色谱柱时，就可以通过GST 与GSH的相互作用而被吸附。当再有细胞抽提物过柱，就可得到能够与“诱饵”蛋白相互作用的兴趣蛋白。一般来说GST融合蛋白pull-down方法用于两个方面： 一是鉴定与已知融合蛋白相互作用的未知蛋白质 二是鉴定两个已知蛋白质之间是否存在相互作用,洗脱 （2）,结合 （3）,检测 （6）,收集 （5）,洗脱 （4）,固定诱 饵蛋白 （1）,噬菌体展示,噬菌体展示技术是在深刻理解噬菌体遗传学和生理学特性的基础上产生的。 其原理是将蛋白质文库整合到一个简单的噬菌体颗粒中，利用目的蛋白质与特异配基的亲和力，筛选和配基特异结合的蛋白质。噬菌体展示技术一般要经过多轮的筛选，这样就可以得到在文库中含量很低的与配基特异作用的蛋白质。,丝状噬菌体,蝌蚪形噬菌体,噬菌体、T4噬菌体、T7噬菌体,M13噬菌体,流程图,酵母双杂交,1989年Field等发明了酵母双杂交系统。该系统利用了酵母的生长转录因子GAL4含有的两个结构域, DNA 结合域(DNA binding domain, BD)及转录激活(activation domain,AD),将已知基因(诱饵基因)和靶基因或含有靶基因的cDNA分别构建在含BD及AD质粒载体上,当这两种质粒共同转化酵母感受态细胞,若BD结合的诱饵蛋白能够与AD结合的靶蛋白或文库中某些cDNA编码的蛋白相互作用、彼此间结合时,则会导致位于侧翼的BD 与AD在空间上接近,呈现GAL4 转录因子的完全活性,启动下游的报告基因如His及LacZ等基因的表达,从而在特定的缺陷培养基上生长。,因此,利用酵母双杂交系统能够筛选与诱饵蛋白相互作用的蛋白，还可以研究已知蛋白间的相互作用,用酵母双杂交技术筛选cDNA文库分离与诱饵蛋白相互作用的蛋白或研究蛋白间的相互作用，一般首先考虑的问题是诱饵载体的构建。编码诱饵蛋白的基因经酶切处理后，按照正确的读码框与诱饵载体如pGBTK7相连接，再经酶切或测序做进一步的验证分析。构建好诱饵载体还要同时转化诱饵蛋白酵母菌株如Y187 和靶蛋白酵母菌株如AH109，进行毒性和自激活性检测，证明诱饵蛋白的表达对酵母正常生长没有毒性,同时也不能自身激活酵母报告基因的表达,可用于筛选文库或研究蛋白间的相互作用。,第二个要考虑的问题就是靶蛋白载体或酵母双杂交cDNA文库的构建。一般在编码靶蛋白的基因或cDNA两端加上同源重组序列，然后与靶蛋白载体如pGADT72Rec共同转化靶蛋白酵母菌株如AH109,在酵母同源重组酶的作用下,靶蛋白基因或cDNA序列整合到载体上,完成靶蛋白载体或cDNA文库的构建。最后一步就是筛选文库或直接研究两个蛋白间的相互作用。分别含有诱饵蛋白载体和靶蛋白载体的酵母杂交后,在酵母体内融合表达BD2诱饵和AD2靶蛋白。诱饵蛋白和靶蛋白的相互作用,导致位于侧翼的BD与AD在空间上接近，呈现GAL4转录因子的完全活性，启动下游的报告基因如Ade、His及LacZ等基因的表达，根据报告基因的表达情况，从而达到分离蛋白或研究蛋白互作的目的。,蛋白质组学的发展促进了多种研究技术的开发和完善，越来越多的技术趋向于大规模、高通量方向发展。同时，物理学、化学、信息学等基础学科研究的发展也大大促进了这些技术的改进。新近发展的计算机分析方法，以基因序列和基因组信息为基础预测蛋白质相互作用，并涉及对参与蛋白质相互作用的表面残基的预测。依赖