病毒感染的检查方法与防治原则-109教室.ppt

第25章 病毒感染的检查方法与防治原则,讲授 陈利玉,内 容,第一节 病毒感染的诊断(检查方法） 第二节 病毒感染的特异性预防(自学） 第三节 病毒感染的治疗（自学）,第一节 病毒感染的诊断 （Diagnosis of viral infection）, 标本采集与送检原则 病毒感染的检查方法,一、标本采集与送检原则, 按疾病种类与病程采取不同标本 在发病早期与用药之前采取标本 无菌操作，有菌标本用“双抗”（青、链霉素）或 “三抗”（青、链霉素+两性霉素B）处理 冷藏速送，病变组织用50甘油保存 血清学检测：IgM 单份血清, IgG 双份血清,二、检查方法, 病毒的形态学检查 病毒的血清学检查 病毒的分子生物学检查 病毒的分离培养与鉴定,1. 病毒形态学检查,电子显微镜：可观察各种病毒的形态 但设备贵、操作复杂，应用受限 光学显微镜：可观察大病毒（痘病毒）和包涵体 对一般病毒检测意义不大,呼肠病毒感染回肠上皮细胞电镜照片,Electronmicrographs,Inclusion body,Cytomegalic cell that contains a dense, “owls eye,“ acidophilic intranuclear inclusion body,Negry body,2. 病毒血清学检查, 已知抗原测抗体（诊断） 已知抗体测抗原（鉴定病毒属、种、 型、亚型）,(1) 中和试验(Neutralization test) (2) 血凝抑制试验(Hemagglutination inhibition test) (3) 免疫标记法(FIA、EIA、RIA) 蛋白印迹(Western blot),2. 病毒血清学检查,方法：,Immunofluorescense test,Immunofluorescense test,Positive immunofluorescence test for rabies virus antigen. (Source: CDC),HEL细胞中CMV IE1蛋白的表达,Enzyme immunoassay (EIA),ELISA,Coloured wells indicate reactivity,AIDS的确诊试验,Western blot,3. 病毒分子生物学检查, 可用于检测常规培养系统不能培养的病毒 可用于检测少量标本或含少量病毒的标本 可用于抗体产生前或不能产生抗体的免疫缺陷患者检测 可对病毒进行定量检测，有助于疗效监测 可对病毒进行基因分型 灵敏度高、特异性好、快速、简捷,优点：,3. 病毒分子生物学检查, 核酸电泳(nucleic acid electrophoresis) 核酸杂交(nucleic acid hybridization) 核酸扩增(PCR） 基因芯片(gene chip) 基因测序(gene sequence),方法：,4. 病毒的分离培养与鉴定,:, 病毒的分离培养 病毒的鉴定 病毒数量及感染性测定,病毒的分离培养方法：, 动物接种 鸡胚培养 细胞培养,:, 动物接种(animal inoculation),动物：鼠、兔、猴、黑猩猩等 优点：结果易观察，可建立动物模型 缺点：有饲养条件要求，费用高、动物 体内常带有潜伏病毒。 目前已很少应用。, 鸡胚培养(embryonated egg culture),受精卵,孵育10-12天,鸡胚,接种病毒,孵育2-7天,收获相应的材料进行鉴定,鸡胚接种部位：,优点： 易管理 不带微生物 成本较低 缺点： 操作程序复杂 目前用鸡胚培养的病毒主要是流感病毒, 鸡胚培养(embryonated egg culture),(3) 细胞培养(cell culture),根据细胞生长的方式分: 单层细胞培养（monolayer cell culture） 悬浮细胞培养（suspended cell culture）,根据细胞来源、染色体特征及传代次数分: 原代培养细胞 二倍体细胞株 传代细胞系或株,(3) 细胞培养(cell culture),原代培养细胞（primary cultural cells),组织 组织块 分散的单个细胞 单层细胞,剪碎 蛋白酶,(原代细胞),单层细胞,(次代细胞),传代培养,培养基,原代培养细胞（primary cultural cells),epithelial cells,特点: 对多种病毒敏感 生长能力有限, 获取成本高 可携带潜伏病毒 应用: 病毒分离与鉴定 病毒学实验研究 不能用于制备疫苗,原代培养细胞（primary cultural cells),体外分裂50100代仍保持二倍染色体数目的单型细胞,特点: 对多种病毒敏感 不带异种蛋白(人源性) 不带病毒,无致瘤潜能 应用: 病毒分离与鉴定 病毒学实验研究 制备疫苗,二倍体细胞株(diploid cell strain),fibroblastic cells,传代细胞系(continuous cell line ),特点: 对多种病毒敏感性高 繁殖能力强,传代时间长 有致癌危险(来源于癌细胞或突变的二倍体细胞株) 应用: 病毒分离与鉴定 病毒学实验研究 不能用于制备疫苗,能在体外无限传代的细胞系。如 HeLa, Hep-2,epithelioid cells,4. 病毒的分离培养与鉴定,:, 病毒的分离培养 病毒的鉴定 病毒数量及感染性测定,病毒鉴定：, 病毒在细胞中增殖的指标 病毒形态学鉴定 病毒抗原鉴定 病毒基因鉴定, 细胞病变效应( cytopathic effect,CPE),病毒在敏感细胞内增殖引起的光镜下可见的细胞病理改变。,CPE：病毒感染细胞发生形态改变,Syncytium formation in cell culture caused by RSV (top), and measles virus (bottom).,CPE：病毒感染细 胞与邻近细胞融合,CPE：形成包涵体（inclusion body）,Syncytial formation caused by mumps virus and haemadsorption of erythrocytes onto the surface of the cell sheet., 红细胞吸附（hemadsorption, HAd）,受染细胞膜表面血凝素（HA） RBC表面HA受体, 干扰现象（interference）,风疹病毒人胚肾细胞 病毒增殖，CPE（）,埃可病毒人胚肾细胞 病毒增殖，CPE（）,人胚肾细胞,风疹病毒？ 埃可病毒,CPE(-)埃可病毒(-) 风疹病毒(+) CPE(+)埃可病毒(+) 风疹病毒(-),4. 病毒的分离培养与鉴定,:, 病毒的分离培养 病毒的鉴定 病毒数量及感染性测定,病毒数量及感染性测定：,蚀(空)斑形成试验 50%组织细胞感染量,病毒总量(活病毒+死病毒)： 感染性病毒量:,血凝试验,蚀(空)斑形成试验（plaque assay）,原理：适当浓度的感染性病毒在覆盖琼 脂的细胞层上产生可见和可数的局部病 灶称为蚀斑。一个蚀斑是由一个感染性 病毒颗粒增殖而形成的，由蚀斑的数目 可以计算出原始标本中感染性病毒的含 量。,PLAQUE ASSAY,PLAQUE ASSAY,PLAQUE ASSAY,PLAQUE ASSAY,分别为10-1、10-2、10-3倍稀释度的HCMV病毒液感染的HEL细胞,蚀(空)斑形成试验（plaque assay）,用途： 测定感染性病毒量 单位: PFU (plaque forming unit)/ml 由一个感染性病毒颗粒增殖而形成的一个空斑称为空斑形成单位。 分纯病毒,蚀(空)斑形成试验（plaque assay）,50%组织细胞感染量 (50% tissue culture infectious dose, TCID50),概念: 测定病毒感染细胞后引起50%细胞病变或 死亡的最小病毒量。 方法:一般是将病毒悬液作10倍的系列稀释，分 别接种细胞，经一定时间后观察CPE、血细胞吸 附等指标，以能使50%细胞感染的病毒的最高稀 释度作为终点。最后用统计方法计算出50%组织 细胞感染量。 用途: 测定感染性病毒的量和毒力,分别为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6倍稀释度的HCMV感染的HEL细胞,50%组织细胞感染量(TCID50),香港大学专家：患者鼻咽标本Vero细胞培养CPE EM观察：冠状病毒 随后加拿大和美国CDC等SARS国际协作组的多个实验室也培养出了冠状病毒 利用免疫荧光法将分离病毒与SARS患者血清进行血清学检测，反应呈阳性 从冠状病毒基因组的保守区设计引物，采用RT-PCR方法从培养上清中扩增出了冠状病毒基因测序经Genbank数据库同源性比对，发现同源性为64%左右,SARS冠状病毒的分离和鉴定,加拿大专家完成了全基因组测序发现与已知人和动物的冠状病毒的同源性差异较大确定为一种新的冠状病毒。 荷兰的病毒学家：用这种冠状病毒感染猴子出现了与SARS病人相同的临床表现和病理特征再次从动物学实验证实引起SARS的病原体是这种冠状病毒 WHO将其命名为SARS冠状病毒,SARS冠状病毒的分离和鉴定,电镜,免疫荧光 免疫印迹,分子生物学技术,核酸杂交,PCR,基因芯片,