《植物细胞制药》PPT课件-2.ppt

第七章 植物细胞制药,这是什么？,第一节 概述,一、基本概念,悬浮培养：在液体培养基中，能够保持良好分散性的细胞和小的细胞聚集体的培养，在此培养条件下组织化水平较低。,细胞培养：利用单个细胞进行液体或固体培养，诱导其增殖及分化。,分生组织培养：在人工培养基上培养茎端分生组织细胞。,外植体：用于植物组织（细胞）培养的器官或组织（的切断），植物的各部位如根、茎、叶、花、果、穗、胚珠、胚乳、花药、花粉等均可为外植体进行组织培养。,器官形成：在组织培养或悬浮培养物中芽、根或花等器官的分化与形成。 （1）在先形成的小根基部迅速形成愈伤组织，然后再形成芽 （2）在不同部位分别形成芽和根后，再形成维管将两者连接起来形成小植株。,无性繁殖系：又叫克隆，指使用母体培养物反复进行继代培养时，通过同种外植体而获得越来越多的无性系后代，如根无性系、组织无性系、悬浮培养物无性系等。从无性系中又可分离形成二个或多个不同的系列，该系列称为“无性系的变异体”。,突变体：细胞本身发生遗传变异或应用诱变处理发生的遗传变异所得的新细胞。,继代培养：由最初的外植体上切下的新增殖的组织，培养一代称为“第一代培养”，连续培养多代的培养即为继代培养。,次级代谢产物：通常把除了核酸、核苷、核苷酸、氨基酸、蛋白质及糖类以外的成分称为次级代谢产物，如生物碱、黄酮、帖类、有机酸、木质素等。,原生质体培养：脱壁后的植物细胞称为原生质体（protoplast），其特点是： 比较容易摄取外来的遗传物质，如DNA； 便于进行细胞融合，形成杂交细胞； 与完整细胞一样具有全能性，仍可产生细胞壁，经诱导分化成完整植株。,单倍体培养：通过花药或花粉培养可获得单倍体植株，经人为加倍后可得到完全纯合的个体。,二、植物细胞培养的发展简史,19世纪，细胞学说 20世纪2030年代，在胚胎培养和器官培养领域取得了一定成果 30年代末40 年代，研究工作主要集中在植物细胞器官与营养需求之间的关系 40年代末50年代，植物组织培养进入了一个崭新阶段，主要是发现了一系列植物生长调节物质在植物培养中的作用，并且提出了用植物细胞培养技术生产有用的次级代谢产物。 60年代初，成功制备植物原生质体，开发了全化学培养基（MS培养基） 60年代70年代中叶，主要工作是开发培养基和研究培养方法 7585年，主要进行了优化细胞生长和次级代谢产物形成的研究，二者的结合，导致了硬紫草两段培养法生产紫草宁及其衍生物的商品化生产。 90年代 至今，主要是集中在抗癌药物，如长春花碱、喜树碱、紫杉醇等植物培养次生代谢物生产的研究,植物是自然界中最好的化工厂 目前超过100，000种化合物被从植物中鉴定，并以每年约4，000种新化合物的速度增加 植物次生代谢物质大多具有生物活性，被用作医药品、化妆品、食品添加剂等,三、植物次生代谢与次生代谢产物,植物次生代谢物的获得,直接从野生植株中分离提取 植物细胞培养 缺点：植物细胞生长缓慢；次生代谢物含量低；生产能力不稳定；难工业化 优点：不破坏自然资源；不受季节、气候和地域限制；不占用耕地 植物发根培养,利用组织和细胞培养技术生产药用成分 植物组织及细胞培养过程中，所产生的次生代谢物常存在于细胞内，可以收获细胞进行提取，因所含色素等杂质较少，所以提取过程相对于从原植物中提取要简单一些。 植物培养细胞中有效成分含量高于原植物中的含量 培养周期短，有利于节约成本大规模生产,利用组织和细胞培养产生新的化合物 鸡骨常山-利血平 长春花-蛇根碱 利用组织和细胞培养物转化药用成分 植物细胞和组织培养物中含有催化氧化、还原、甲基化、羟基化、异构化、酯化、糖基化、羧基化、去甲基化等多种反应的酶类，可使加入到培养物中的原料转化成有用的化合物。,第二节 植物细胞的形态和生理特征,一、植物细胞的形态,二、植物细胞的结构特征,三、细胞后含物 和生理活性物质,1、细胞后含物：系储藏物质或废弃物质，分布于液泡内，如糖类、盐类、生物碱、苷、有机酸、挥发油等。,（2）糖苷类：,（1）生物碱：生物体内的碱性含氮有机化合物，具环状结构，难溶于水，与酸可形成盐，有一定的旋光性与吸收光谱，大多有苦味，呈无色结晶状，少数为液体。 生物碱有几千种，由不同的氨基酸或其直接衍生物合成而来，是次级代谢物之一，对生物机体有毒性或强烈的生理作用。 毛莨科黄连根茎中的小蘖碱是黄连素的主要成分，有抗菌消炎作用； 萝芙木中的利血平能降血压； 石蒜中的加兰他敏对小儿麻痹后遗症有疗效; 罂粟果皮中所含的吗啡碱是著名镇痛剂； 奎宁碱是有价值的解热药； 三尖杉碱和长春花碱是治癌良药； 秋水仙素（碱）能人工诱变产生多倍体。,托品类生物碱：颠茄产生的次级代谢产物，具有松弛平滑肌，阻断汗与唾液分泌的作用。,莨菪碱：古希腊神殿女祭司发布预言前，在仪式中燃烧莨菪，由于烟中含有令人失忆的东莨菪碱，因此被用来作为洗脑的药物。现今眼科或外科手术前使用的镇静药物，或晕车晕船时贴在耳后的贴剂，均含有东莨菪碱。具有与阿托品相类似的生理活性。,古柯碱：来自古柯树的叶子，是早期南美洲土人的零食。十九世纪时，欧洲探险家见到南美洲土人咀嚼一种灌木树叶后，不需进食就可长期劳动，因此将树叶带回欧洲研究，最后分离得到能令人舌头麻木的古柯碱（cocaine）。美国早期生产的可乐亦含有古柯叶萃取物。后来据此开发出麻醉药品。,吗啡和可待因：吗啡对中枢神经有麻醉作用，有极快的镇痛效力，但易成瘾，不宜常用。可待因是吗啡的甲基醚。可待因与吗啡有相似的生理作用，可用以镇痛，但可待因主要用作镇咳剂。麻醉剂海洛因是吗啡的二乙酰基衍生物，即二乙酰基吗啡。海洛因镇痛作用较大。并产生欣快和幸福的虚假感觉，但毒性和成瘾性极大，过量能致死。,吗啡,可待因,海洛因,麻黄碱：是含于中药麻黄中的一种主要生物碱，又叫麻黄素，仲胺类生物碱，不具含氮杂环，因此它们的性质与一般生物碱不尽相同，与一般的生物碱沉淀剂也不易发生沉淀。麻黄碱具有兴奋中枢神经、升高血压、扩大支气管、收缩鼻粘膜及止咳作用，也有散瞳作用，临床上常用盐酸麻黄碱（即盐酸麻黄素）治疗气喘等症。,小檗碱：小檗碱又名黄连素，存在于小檗属植物黄柏、黄连和三颗针中，它属于异喹啉衍生物类生物碱，是一种季铵化合物。黄连素具有较强的抗菌作用，在临床上常用盐酸黄连素治疗菌痢、胃肠炎等疾病。,长春新碱：又名醛基长春碱，存在于夹竹桃科植物长春花中，属于双聚吲哚类生物碱，长春新碱对白血病、癌症均有效，且毒性较低。,喜树碱：从喜树的种子或根皮中提炼出的一种生物碱，是DNA合成抑制剂，对DNA合成期的肿瘤细胞有较强的杀伤作用。主要用于治疗消化道癌包括食管癌、贲门癌、结肠癌、直肠癌、胃癌、肝癌、其中对胃癌的疗效最好。对肺癌、绒毛膜上皮癌、膀胱癌、急性白血病、慢性粒细胞白血病也有一定疗效。,人类白血病T细胞经1微升喜树碱处理凋亡,HL-60 cells（急粒，p53缺陷）被喜树碱诱导3小时,（2）糖苷类：某些有机化合物和糖经苷键结合而成。很多糖苷类化合物对疾病有治疗作用，如洋地黄毒苷有强心作用，大黄中的蒽醌苷有强烈的泄下作用，紫草中的紫草宁可作为天然色素、抗菌药物和抗癌药物。,洋地黄（玄参科）,大黄（蓼科）,紫草（紫草科）,（3）挥发油：如薄荷油、丁香油、桉油等。,（4）有机酸：植物有机酸有苹果酸、柠檬酸、水杨酸、酒石酸等。,（5）紫杉醇：紫杉醇属有丝分裂抑制剂或纺锤体毒素,和目前常用的化疗药作用机理 不同，它是诱导和促进微管的装配。紫杉醇具有聚合和稳定微管的作用，致使快速分裂的 肿瘤细胞在有丝分裂阶段被牢牢固定，使癌细胞复制受阻断而死亡。,2、生理活性物质 （1）酶 （2）维生素 （3）植物激素 （4）植物杀菌素,四、植物培养细胞的生理特性,1、植物培养细胞重量的增加主要取决于对数期，而次级代谢产物的累积主要在稳定期完成。,2、很少以单一细胞悬浮生长，而多以非匀相集合体的细胞团形式存在。原因有二： （1）细胞分裂后没有进行细胞分离 （2）间歇培养过程中细胞处于对数生长后期时开始分泌粘多糖和蛋白质，或者以其他形式形成粘性表面，从而形成细胞团,3、纤维素细胞壁使得其外骨架相当脆弱，表现为抗张力强度大，抗剪切能力小，传统搅拌易损害植物的细胞壁。,4、植物细胞培养基粘度大，随培养时间延长，细胞数量增多，产生的粘多糖也随之增多，这些都易造成细胞培养液粘度增加。,5、植物细胞为好气性，培养过程中要不断供氧，但要保持较低的溶氧水平。,6、大多数植物细胞液体培养的pH值为5-7,应防止通气过高驱除CO2而使培养液的pH 升高。,7、光照可使植物细胞进行光合作用，解决部分碳源问题，但也防止光照不匀而使局部温度过高。,8、控制培养过程中的泡沫，维持培养过程的稳定性。,9、植物细胞培养过程中会造成在反应器内壁及附件上的沉积与粘附。,第三节 植物细胞培养的基本技术,一、植物材料的准备,1选取外植体： （1）带芽的外植体，如茎尖、侧芽、鳞芽、原球茎等，组织培养过程中可直接诱导丛生芽的产生。其获得再生植株的成功率较高，变异性也较小，易保持材料的优良性状。 （2）根、茎、叶等营养器官和花药、花瓣、花轴、花萼、胚珠、果实等生殖器官。这一类外植体需要一个脱分化过程，经过愈伤组织阶段，再分化出芽或产生胚状体，然后形成再生植株。,外植体的取用与组织部位、植株年龄、取材季节以及植株的生理状态、质量，都对培养时器官的分化有一定影响。一般阶段发育年幼的实生苗比发育年龄老的栽培品种容易分化，顶芽比腋芽容易分化，萌动的芽比休眠芽容易分化。在组织培养中，最常用的外植体是茎尖，通常切块在05厘米左右，太小产生愈伤组织的能力差，太大则在培养瓶中占据空间太多。培养脱毒种苗，常用茎尖分生组织部，长度为01毫米以下。,2外植体消毒： 培养前必须对外植体进行严格的消毒处理，既要全都杀灭外植体上附带的微生物，但又不伤害材料的生活力。因此，必须正确选择消毒剂和使用的浓度、处理时间及程序。目前，常用的消毒剂有次氯酸钙、氯化汞、次氯酸钠、双氧水、酒精（70）等。,（1）茎尖、茎、叶片的消毒：消毒前先用清水漂洗干净或用软毛刷将尘埃刷除，茸毛较多的用皂液洗涤，然后再用清水洗去皂液，洗后用吸水纸吸干表面水分，用70酒精浸数秒钟，取出后及时用10次氯酸钙饱和上清液浸泡1020分钟，或用210次氯酸钠溶液浸泡615分钟。消毒后用无菌水冲洗3次，用无菌纱布或无菌纸吸干接种。,（2）根、块茎、鳞茎的消毒：消毒前必须先用净水清洗干净，在凹凸不平处以及鳞片缝隙处，均用毛笔或软刷将污物清除干净，用吸水纸吸干后，在70酒精中浸一下，然后用0102氯化汞消毒510分钟，最后用无菌水清洗34次，用无菌纱布或无菌纸吸干后接种。,（3）果实、种子的消毒：有的表皮上具有茸毛或蜡质，消毒前先用70酒精浸泡几秒钟或210分钟，然后用饱和漂白粉上清液消毒1030分钟或2次氯酸钠溶液浸1020分钟，消毒后去除果皮，取出内部组织或种子接种。,（4）花药、花粉的消毒：植物的花药外面常被花瓣、花萼包裹着，一般处于无菌状态，只需采用表面消毒即可接种。通常先用70酒精棉球擦拭花蕾或叶鞘，然后将花蕾剥出，在饱和漂白粉上清液中浸泡1015分钟，用无菌水冲洗23次，吸干后即可接种。,二、培养基及其组成,1.无机盐：氮（N）、硫（S）、磷（P）、钾、镁、钙等。,2、碳源：通常为蔗糖或D-葡萄糖，用量通常为2%-4%，几乎所有的培养物在蔗糖作为碳源时生长都比较好，只有少数植物或组织在葡萄糖或果糖作为碳源的培养基上生长更合适。,3、植物生长调节物：包括植物激素（植物体内合成，并从产生处运送到别处，对生长发育产生显著作用的微量(1uM)有机物) 和植物生长调节剂（一些具有植物激素活性的人工合成的物质）。,植物生长调节物质,（1）生长素： 主要诱导刺激细胞分裂和根的分化，常用的生长素有：NAA（ -萘乙酸）、IAA（吲哚乙酸）、IBA（吲哚丁酸）、2，4-D（2，4-二氯苯氧乙酸）等。与IBA相比，NAA诱发根的能力较弱，诱发的根少而粗，但对某些植物如杨树等却具有很好的效果，IBA在根的诱导与生长上作用强烈，作用时间长，诱发的根多而长，特别有效，但也不可一概而论。对愈伤组织增殖最有效的是2，4-D，特别是对单子叶植物，10-7-10-5mol/L即可以诱导产生愈伤，常常不需再加细胞分裂素，但2，4-D是一种极有效的器官发生抑制剂，不能用于启动根和芽分化的培养基中。,（2）细胞分裂素： 为6-氨基嘌呤的衍生物，可以结合到高等植物的核糖体上，促进核糖体与mRNA的结合，加快翻译速度，从而促进蛋白质的生物合成；与细胞膜和细胞核结合，影响细胞的分裂、生长与分化；在tRNA分子的反密码子附近发现有细胞分裂素的结合位点，可能在基因表达的翻译水平上具有调节作用；还是rRNA、 tRNA的组成部分，如异戊烯基腺苷。 细胞分裂素主要在根中合成， 使用细胞分裂素的主要目的是刺激细胞分裂，诱导芽的分化、叶片扩大和茎长高，抑制根的生长。 培养基中使用的细胞分裂素：从甜玉米未成熟种子或其他植物中分离到的玉米素、人工合成的细胞分裂素如激动素（KT，6-呋喃氨基嘌呤）、6-苄基腺嘌呤（6-BA）、异戊烯氨基嘌呤等。 细胞分裂素常常与生长素相互配合，用以调节细胞分裂，细胞伸长，细胞分化和器官形成。,4、有机氮源：如水解乳蛋白、水解酪蛋白、椰子汁、玉米胚乳、麦芽浸出物、西红柿汁和酵母浸出物 。甘氨酸（氨基乙酸）和肌醇（环己六醇）也是一些培养基的添加成分,5、维生素 硫氨素（VB1）：几乎所有植物都需要，缺少时离体培养的根不能生长或生长缓慢，以盐酸盐的形式即盐酸硫胺素加入培养基中。 盐酸吡哆醇（VB6）和烟酸：可能有刺激生长的作用 维生素BX（氨酰苯甲酸）、VC、维生素E（生育酚）、维生素H（生物素）、维生素B12（氰钴胺酸）、叶酸、维生素B2（核黄素）、泛酸钙和氯化胆碱。,三、培养方法,1、固体培养： 缺点： （1）外植体或俞伤组织仅有一部分与培养基接触，该部位的营养物质被迅速吸收，从而形成培养基中营养物质的浓度差，进而导致俞伤组织的生长不平衡。 （2）由于外植体的基部插入固体培养基中，因此该处呈现气体交换不畅的状态，阻碍了组织呼吸作用的正常进行，同时也会堆积生长过程中排出的有害物 （3）静止状态下，由于重力作用，以及光线从上部或一则射入，因而在俞伤组织细胞间出现了极化现象，导致细胞群体的不均匀状态,2、液体培养,继代培养：外植体培养3周左右必须转移至新鲜培养基上，以保持培养物的继续正常生长，移换一次培养基称一次继代培养。,一种外植体经过一定次数的继代培养，其培养物可用于悬浮培养。由于外植体诱导形成的俞伤组织开始比较紧密坚实，在振荡养时不易分散为单细胞或小的细胞团，所以需要经过多次继代培养后，俞伤组织变得较为松软时才能进行悬浮培养。,液体培养：静止培养、振荡培养。,大规模液体培养,（1）成批培养法：将培养基一次性地加入反应器，接种、培养一定时间后收获细胞的操作方式。 常使用两步培养的方法，即使用两个生物反应器，第一个用于细胞生物量的积累，第二个用于次级代谢产物的生产。,（2）半连续培养法：在反应器中投料和接种培养一段时间后，将部分培养液和新鲜培养液交换的方法。,（3）连续培养法：利用连续培养反应器，在投料和接种培养一段时间后，以一定速度连续采集细胞和培养液，并以同样速度供给新鲜培养基，使细胞生长环境长期维持恒定的方法。 生产上常用两个反应器，第一罐投入生长培养基，进行连续培养；第二罐投入生产培养基，也为连续培养。两罐之间以管道连接，第一罐培养液不断流入第二罐，同时第二罐培养液不断流出。,通气： 悬浮培养中细胞的旺盛生长必须有良好的通气条件。小量悬浮培养时巨常转动或振荡，可起通气和搅拌作用。大量培养中可采用专门的通气和搅拌装置。,四、培养条件,温度： 对大多数植物组织2028即可满足生长所需，其中2627最适合。,光： 组织培养通常在散射光线下进行。光的影响可导致不同的结果。有些植物组织在暗处生长较好，而另一些植物组织在光亮处生长较好，但由愈伤组织分化成器官时，则每日必须要有一定时间的光照才能形成芽和根。有些次生物质的形成，光是决定三因素。,渗透压： 渗透压对植物组织的生长和分化很有关系。在培养基中添加食盐、蔗糖、甘露醇和乙二醇等物质可以调整渗透压。通常12个大气压可促进植物组织生长，2个大气压以上时，出现生长障碍。,酸碱度： 一般植物组织生长的最适宜pH为56.5。在培养过程中pH可发生变化，加进磷酸氢盐或二氢盐，可起稳定作用。,第四节 影响植物次级代谢产物累积的因素,一、外植体选择：延迟期、加速期、对数期、稳定期。,二、培养条件的影响,1、培养环境的内在因素,（1）接种和诱导： 外植体的大小不仅影响所诱导的组织和细胞的生长，而且也关系到次级代谢产物的生产能力，如长春花分泌利血平要求外植体直径在1-12cm。 次级代谢产物的产率与外植体大小、细胞密度及营养成分密切相关。 细胞生长率的增加有时会导致次级代谢物产量的下降。 外植体的前处理也可影响次级代谢物的累积方式，如有的需要光诱导才能产生次级代谢物。,（2）基本培养基组成：是愈伤组织和悬浮细胞培养的物质基础。,磷：低于基本培养基的含磷量常导致次级代谢物的累积，而缺乏磷有可导致生物量的大幅度降低。,氮：细胞生长能力通常取决于NH4+和NO3-之比，高于或低于最佳比例均可导致对细胞生长和次级代谢产物积累的不利影响。,铜：作为邻-二酚、对-二酚及抗坏血酸氧化酶的活性基团，是次级代谢产物累积的必要元素。在相对较高但不产生毒害的前提下，铜可作为非生物诱导子增加次级代谢产物的含量。,（3）碳源,CO2：光自养培养中使用，可诱导某些特征反应，积累CO2型的次级代谢物，还有增加某些次级代谢物的产量。,糖类：糖的种类和浓度影响次级代谢产物的合成和累积。 糖浓度的升高，可导致细胞干重和次级代谢产物的含量增加。 糖含量的增加，可增强生物碱合成起始酶的活性，增加相关mRNA的浓度。 蔗糖的作用取决于产物的生物合成过程。 .延长稳定期 .通过分解产物葡萄糖产生对内源生长素合成的抑制作用 .增强戊糖磷酸途径有关的酶活性 不同种类的糖加入，可改变植物次生代谢产物的种类和积累。,（4）植物生长调节剂：不同植物生长调节剂的组合形式可显著影响代谢产物的产生和积累。,（5）O2和pH, O2：供氧量的不同，可对代谢产物的生成和积累产生不同的影响。,pH：培养过程中产生有机酸或NH4+被利用，则pH ；NO3-被利用，或氨基酸脱氨后释放铵离子，或硝酸盐被还原，则pH 。pH的变化有时会影响次级代谢产物的产生。,2、两步培养法： 生长培养基：一般来说含丰富的糖类、肌醇、维生素、无机盐及生长素类物质，有利于细胞生长。 生产培养基：硝酸盐、磷酸盐含量较低，不含肌醇、维生素，只有较低的盐分和糖类，培养基中加入6-BA等细胞分裂素，有利于代谢物的生成和积累。,3、诱导子：可分为内源性诱导子和外源性诱导子；生物诱导子和非生物诱导子。,4、培养环境,（1）温度：低温对次级代谢产物的积累起抑制作用。当培养温度与培养物正常生长所需温度相差较大时，可引起应激效应以及对次级代谢产物产生激活作用。,（2）搅拌频率：主要表现在溶氧和剪切力。,（3）光的影响：光照时间长短、光质和光的强度对次级代谢物的累积有一定的影响。,在自然界中，药用茄科植物东莨菪碱的含量一般每升仅为毫克。生物学研究证明，甲基转移酶（PMT）和羟化酶（H6H)）是药用植物中东莨菪碱合成中最为关键的的两个酶。我国运用转基因手段，在国际上首次将甲基转移酶和羟化酶同时转入药用植物莨菪中，筛选获得高质量的莨菪药用组织细胞, 研究结果表明东莨菪碱含量与原来的细胞组织相比，药用成份提高了倍。,三、利用基因工程技术增加次生代谢产物的产量,莨菪碱和东莨菪碱在医用方面是作用于副交感神经系统的抗胆碱药，具有麻醉、解痉、止痛的功能。国内外市场上东莨菪碱的需求量是莨菪碱的倍，难以满足病人的需求。因此，运用转基因技术提高药用植物中东莨菪碱的含量，具有重要医学价值。,第五节 发根培养,内容纲要,什么是发根？ 发根培养的特点、优点 发展历史 发根农杆菌的生物学特性及致病机理 发根的诱导及培养 研究现状、存在问题、解决办法,什么是发根？,发根（hairy root）是发根农杆菌 （Agrobacterium rhizogenes)感染整体植株或其某一器官、组织、单个细胞甚至原生质体后，其Ri质粒上的TDNA片断整合进植物细胞核基因组中诱导产生的一种特殊表现型（形成多分枝的、生长迅速的不定根）,发根培养的特点、优点,稳定性和生长迅速的特点是工业化生产梦寐以求的，也是细胞培养和一般器官培养所不能兼备的 很多次生代谢产物仅在特定的器官或组织中形成，即只有分化才伴随次生代谢过程的进行，发根中含有相应的次生代谢物含量明显比培养的细胞高 近三分之一传统药材的药用部位是根，发根培养系统在传统药材生产中具有更重要的意义,生长迅速 激素自养 分化程度高 遗传性状稳定,发展历史,1934年，Hildebrand报道了发根农杆菌感染苹果树产生发根，自此开始对其致病机理进行研究，并与根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）一起作为基因工程的载体 80年代后期，发根培养技术应用在植物次生代谢物生产上,发根农杆菌的生物学特性,发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes） ：土壤细菌，能侵染大多数双子叶植物和少数单子叶植物 Ri质粒（root inducing plasmid）：TDNA区、Vir区两个功能区 TDNA区插入到寄主植物基因组中，表达决定发根生长和冠瘿碱合成的基因，冠瘿碱的检测是评价植物转化是否成功的证据之一 Vir区不插入寄主植物基因组DNA中，但与TDNA的转移有关，其缺失或突变不能使感染的植物出现发根,Ri质粒,Ri质粒感染过程,发根农杆菌感染植物伤口后，受伤的植物细胞合成特殊的小分子化合物，诱导Ri质粒的Vir区基因群活化； 在Vir区基因表达产生的酶作用下TDNA被切下； 3. TDNA转移进细胞并整合到植物基因组DNA中； 4. TDNA在细胞中转译，使宿主植物产生发根,发根的诱导及培养,发根的筛选及增殖培养 含抗生素的培养基上继代培养除菌 选择生长速度较快、分枝较多的发根进行扩大培养 增殖培养常在低盐浓度的液体培养基中黑暗、恒温条件下进行悬浮、振荡培养，适当通入氧气利于根的生长 一般为每月增殖数十倍，最高可达上千倍（如天仙子发根每月增殖25005000倍）,发根农杆菌感染植物的方法 向植物体直接注射 对植物外植体进行接种感染 与原生质体共培养,发根的鉴定,形态学水平 ：激素自养，根丛生，多分枝， 多根毛，无向地性 组织水平：GUS活性的测定或NPTII酶的检测 细胞水平：冠瘿碱的测定 分子水平：Southern Blot方法,影响发根农杆菌转化的因素,菌株 常用菌株：LBA9402，ATCC15834，R1601，TR105，A41027，A42659 植物及外植体 对Ri质粒的敏感性：双子叶植物单子叶植物，草本植物木本植物 在感染转化的受体选择上，倾向于将叶片、子叶、子叶柄、胚轴作为外植体 将菌株、植物、外植体进行不同的组合，会导致发根诱导率的变化 理化因子的影响 水溶性酚 ：乙酰丁香酮和羟基乙酰丁香酮、儿茶酚、原儿茶酚、没食子酸、焦性没食子酸、二羟基苯甲酸、香草酚和对羟基苯酚 ，激活Vir区基因表达 光照 其它 感染前高渗处理、诱导培养时添加生长素等,影响发根培养及次生代谢物合成的因素,培养基 基本培养基、碳源、氮源 植物激素 发根能在无激素培养基上较好生长，但外源激素的加入对其生长、形态和次生代谢物的合成均有影响 pH值 前体 诱导子 刺激代谢物的产生和分泌,培养方法 固体培养 液体培养法进行成批培养或大规模发酵培养 两步培养法 两相培养法 反复成批培养 补料成批培养 生物反应器 发根易受剪切力伤害，且其生长迅速，密度高，供氧困难，保持低的流体压力和高的溶氧量十分必要 通气性能良好且剪切力较小的反应器是其理想反应器,影响发根培养及次生代谢物合成的因素,发根生物反应器结构及其培养系统的研究主要集中在： 一是尽可能减低机械剪切力对发根的损伤（减少搅拌）； 二是提高气液传质速率，增加溶氧量,研究现状,人参（Panax ginseng）：在无外源激素的条件下，发根生长速度为用激素诱导根，人参皂甙含量最高可达干重的0.95 长春花（Catharanthus roseus）：从发根中检测到细胞培养中一直未能得到的长春碱和长春新碱 亲本植株能合成的次生代谢物都可用发根培养生产 发根培养是利用生物技术生产次生代谢物的新的有效途径,存在的问题及措施,有些植物发根难诱导，各转化系统相对独立，无模式系统 大量筛选菌种，采用合适的外植体，综合利用各种理化因子 有些发根生长不太快，有些难以维持正常的形态，常出现脱分化形成愈伤组织或分化出幼苗、胚状体等现象，致使生产能力下降、培养失败 采用合适的培养方法，必要时调节营养及激素水平，使发根维持正常的形态及快速生长和次生物质生产能力 难以大规模培养 选用通气性能良好且无机械搅拌的反应器 采用两相培养法或在培养基中加入诱导子使代谢物分泌到培养基中并及时收集，以减少其对生长的不利影响,第六节 植物细胞培养的生物反应器,由于植物细胞的固有性质，如细胞容易聚集，细胞分化，细胞的脆弱性，代谢途径和代谢产物形成与细胞生长关系的复杂性，选择合适的反应器构型及操作方法极大地关系到植物细胞的代谢产物合成。,（一）植物细胞悬浮培养特点,1、年幼的细胞内含有多个小液泡，而衰老细胞含有单个大液泡,细胞对渗透压及物理压力变化很敏感。另外，液泡与二次代谢产物积累及废物排放有关。,一、植物细胞悬浮培养特征及参数,4、植物细胞的需氧量较低，最大氧摄入速率1-3.5mM/h, 而微生物细胞是5-90mM/h。,3、在细胞培养中，植物细胞代谢缓慢，生长速率低，需要很长时间的培养过程，而长时间保持无菌状态给培养带来难度。,5、植物细胞易于粘附成团使搅拌不匀而导致营养物质的传输受到限制。,6、与微生物相比，植物细胞二次代谢途径非常复杂，并且代谢物生产通常与细胞变形分化有关，从而使不同细胞的生产速率常常不一致。,2、与微生物相比，它对剪切力更为敏感。,（二）植物细胞的聚集与粘附,1、植物细胞不象动物细胞以单个细胞存在，它们有成团的倾向。,2、植物细胞的聚集有两种形式： （1）发生在培养前期，年幼的细胞迅速分裂，产生的新细胞不能及时分开，于是细胞便积聚在一起。 （2）发生在培养后期，主要在对数生长后期，由于多糖物质及蛋白质的分泌，细胞容易相互粘附。,4、细胞聚集程度与细胞的生长阶段有很大关系。,3、细胞还粘附在容器的壁表面、电极上。这种形式的聚集体较大，往往给培养带来不利的影响。,5、不同尺寸的聚集体中二次代谢产物的含量不同，,6、聚集体的形成也有有利的一面，细胞团内的扩散受限制可导致中心细胞的分化。中心细胞的分化可刺激聚集体周围的细胞，从而提高二次代谢产物的产量。但聚集体的有利影响通常与聚集体大小联系在一起，聚集体过大反而会使产量降低。,（三）溶氧和气体成分,1、植物细胞对氧需求较微生物低。但由于植物细胞培养的高密度及高粘度特性，氧的传输会受到阻碍。,2、一定条件下溶氧量的增加有利于培养细胞中代谢产物的生成与积累。,3、高通气和氧浓度过高均会不利于植物细胞生长，因为高通气下气泡带来的扰动使细胞处于更强的剪切环境下。另外，溶氧水平过高会使细胞代谢受阻。,（四）流体性能,1、在植物细胞培养后期，由于聚集体形成、生物量的增大，目前普遍使用粘度仪测定不同转速下的液体粘度来衡量。,2、细胞浓度、细胞团大小和细胞变形是影响培养液流变性能的主要因素。,3、在细胞培养中，流体性能直接影响溶液的混合和物质传输，因而影响细胞生长及次级代谢。,（五）剪切力,1、气-固作用：包括气泡的凝聚和破碎对细胞产生影响。 2、固-固作用：细胞与细胞，细胞与搅拌器、探头和容器壁的碰撞和磨擦。 3. 对数生长期和静止期早期的细胞比延迟期、对数生长期早期、静止期后期的细胞对剪切力更敏感。 4. 剪切力的损害是剪切环境引起细胞通透性的提高，从而引起聚集体的分裂，聚集体形式的改变又会对细胞与细胞之间的接触及信息传递产生影响。,二、反应器的类型,（一）细胞自由培养：主要有搅拌式（STR）、气升式(air-lift) 、鼓泡式（bubble colum）、转鼓式（rotating drum）。,1、STR：较大的搅拌桨通常能在相对低的旋转速度下提供良好的搅拌，因此通过降低搅拌速度和改进搅拌子构型可以显著提高STR 的应用范围，提高细胞及代谢物的产量。,2、鼓泡式反应器是结构最为简单的反应器，气体从底部通过喷嘴或孔盘穿过液池实现气体传递和物质交换。不含转动部分，整个系统密闭，易于无菌操作。培养过程中无需机械能消耗，适合于培养对剪切力敏感的细胞。然而对高密度及粘度较大的培养体系，反应器的混合效率会降低。,4、转鼓式反应器：较新型的反应器，已用于长春花、紫草的培养，转子的转动促进了液体中溶解的气体与营养物质的混合，因此具有悬浮系统均一、低剪切环境、防止细胞粘附在壁上的优点，适合于高密度植物悬浮细胞的培养。,3、气升式反应器：比鼓泡型有更均一的流动形式。气升式反应器给植物细胞的生长和代谢合成都提供了适宜的环境，因此已被广泛用于工业化生产。,（二）反应器的比较与选择,（1）供氧能力和气泡在液体中的分散程度； （2）反应器内流变液体的压力强度及其对植物细胞系统的影响； （3）高细胞浓度混合的均匀性； （4）控制温度、pH、营养物浓度的能力； （5）控制细胞聚集体的能力； （6）放大的难易程度； （7）长时间维持无菌状态的能力,1、选择依据,2、各反应器的比较,（三）细胞固定化培养：将细胞固定在适宜的载体上，如多糖或多聚化合物，在不同类型的反应器中进行培养。 固定化培养有利于细胞之间的接触、信息传递、分化，有利于次生代谢产物的产生。 固定化培养优于自由细胞培养，可以帮助生长和产物形成过程相耦合。尤其当产物是外泌型的，固定化使产物与细胞易于分离，简化下游提纯工作。 固定化培养非常适合脆弱细胞的培养，保护细胞免受剪切力的伤害。 根据载体的不同，可将反应器类型主要分为胶粒固定反应器和膜反应器。,1、胶粒固定反应：，采用海藻钙固定细胞，常用反应器为流化床、笼式反应器、填充床反应器等。,2、膜反应器：中空纤维膜是另一种可供细胞固定化的载体。由于细胞并不粘附在膜上，因此更好控制压降和流体压力，不受操作规模的限制。,（四）发展方向,1、培养系统：植物次生代谢产物的合成与细胞生长、分裂联系在一起，但细胞生长和次生产物合成并不耦合，批式培养系统逐步发展成为补料批式和多步批式培养系统。 二步或多步培养采用生长培养基和生产培养基分别进行生物量扩增和次生代谢产物的生产。,2、过程检测、模型化与控制：检测和在线控制的参数有温度、DO、pH、泡沫以及细胞浓度（光密度法）、O2/CO2浓度、NADH 浓度等。,3、反应器：对反应器的改进以降低剪切力，实现均匀混合，促进物质交换。,4、生物过程的耦合：利用二相（溶剂相和水相）培养的反应器系统可以使产物及时同反应物分离，避免了产物的抑制效应，提高培养效率。,5、操作方式：细胞中营养物质的吸收和产物生产不是一个连续的过程，发生的时间各不相同。细胞分裂的同步化可以使营养物质的利用和产物合成达到最大化，从而提高反应器的生产性能。无论原核细胞或真核细胞都能诱导其实现同步分裂。采用反应器的进料振荡而使细胞产生共谐，生产效率大幅提高。诱导植物细胞同步的方法也可采用DNA 合成的选择性抑制剂处理细胞，诱导同步分裂，不同时期细胞继代培养和延迟生长素的添加。,第七节 转基因植物制药,一、转基因植物表达系统的优点：,（1）植物细胞培养条件简单,易于成活,便于进行遗传操作,利用植物细胞的全能性和组织培养,可以培育出稳定遗传的药用植物品种,通过田间种植生产药用蛋白,（3）使用安全，植物不是人类病原体的宿主，故与动物细胞培养比较，利用重组植物生产药物不含威胁人类健康的病原微生物。,（4）经转化植物的种子易于贮存有利于生产和运输。,（2） 植物具有完整的真核表达系统,表达产物可糖基化、酰胺化、磷酸化,亚基的正确装配等翻译后的加工过程,使表达产物具有与高等动物细胞一致的免疫原性和生物活性,（5）投资小，成本低,生产成本低,不需要昂贵的培养基和复杂的纯化。利用转基因植物生产药用重组蛋白的成本，仅为利用大肠杆菌发酵生产成本的1/10-1/50。,（6）可将蛋白质富集在种子中，以种子油脂体作为蛋白质或肽类的载体，可以有效地降低下游的加工成本并可相应的提高产率。,（7） 易于形成产业化生产,在筛选得到高效表达植株后,只需通过种植和扩大种植面积,就能形成“分子药田”,大规模生产,二、转基因植物制药的不足之处：,（1）表达量低,（2）糖基化的准确性,（3）转基因药物的安全性,（4）转基因植物疫苗的免疫耐受性,三、植物基因的转化技术和方法：,（1） 土壤农杆菌介导转化法：最为常用的植物转基因方法。根癌农杆菌一般只感染双子叶植物受损伤的部位，导致冠瘿瘤的形成。农杆菌内含有Ti 质粒，在质粒上有一段DNA，称为T-DNA,在农杆菌侵入植物细胞时，T-DNA 通过自身的Vir 基因的活化插入植物细胞的基因组，并稳定遗传给新分裂的细胞，利用T-DNA 的这一特点，将其中的能导致植物形成肿瘤的基因全部切除，换上所需的目的基因就可组成一个可将目的基因带入植物细胞中的载体。通过农杆菌转化系统获得的转基因植株较少沉默及可转移基因片段较长。近年来随着载体系统和转化技术的改进农杆菌的基因转化在单子叶植物上也取得了显著的进展。,（2）用重组病毒感染植株： I.植物病毒可侵染单双子叶植物的所有组织，病毒的复制、感染力强，利用这一特点，将编码疫苗抗原决定簇序列基因插入植物病毒基因组中，再用此重组病毒感染植物，抗原基因随病毒在植物体内复制，装配而得以高效表达。 II.植物病毒的基因组小，易于进行遗传操作，可以通过机械接种感染植物，适于大规模商业操作。现已发展了多种植物病毒载体构建策略，包括基因插入、基因取代、融合抗原和基因互补等。 III. 常用的两个宿主病毒系统是：烟草烟草花叶病毒（TMV)系统和豇豆豇豆花叶病毒（CPMV）系统。,（3）基因枪转化法：用外源基因DNA 包裹重金属钨微粒或金微粒形成微弹，通过加速装置将包裹了DNA 的微弹穿过植物的细胞壁和细胞膜，送入细胞内，从而将外源DNA 带入细胞，整合到植物基因组中去的一种遗传物质转化技术。基因枪转化法的不足之处是整合入植物细胞基因组的外源基因通常是多拷贝的，因此可能导致植物体的某些基因非正常表达或出现共抑制现象。,（4）花粉管通道转化法：我国首创，将外源DNA 置入萌发的花粉并整合到精核基因组中，或者通过花粉受精后尚存的花粉管通道直接进入受精卵。常用的方法是在受体植物自花授粉后一定时间内剪开柱头，将外源基因DNA 滴在剪开的柱头上，使其能够沿着尚存的花粉管通道进入胚囊，转化成受精前的卵细胞。 优点：可通过转化受体直接得到种子，从而避免了体细胞和原生质体再生的难关；由于不通过组织培养，避免了各种附加激素的不良影响。花粉管通道转化的操作简便，成本低，更适合在育种中使用。 缺点：花粉萌发时柱头释放的核酸酶会破坏外源DNA, 对转化的结果产生影响。,四、植物表达系统的选择,烟草：利用烟草作为外源基因表达系统分子工厂生产重组蛋白有较长的历史,使用也最广泛。 烟草作为外源基因表达系统的最大优势是技术成熟、产量高(每公顷产量超过100吨) ,并且因为种子的繁殖量大而有扩大规模的潜力。 许多烟草品种会产生大量的生物碱,但已培育出低生物碱含量的烟草品种用于药用蛋白的生产。 重组基因大多转入细胞核中, 从叶子中提取表达的蛋白。 将基因转入叶绿体中表达，可以得到高拷贝的基因,而且不存在转入基因的位置差异以及基因表达抑制等因素的影响。重组蛋白在叶绿体中的表达水平很高,可占总可溶性蛋白的25%。弊端是蛋白在其中不能完成糖基化,因而不能用来生产人的糖基化蛋白。,谷类和豆类： （1）在烟草中生产重组蛋白的局限是产品的不稳定性,因此运输过程中需要将烟草叶子冷冻或干燥,或者将蛋白产品就地加工。 （2）谷类和豆类植物种子中重组蛋白可以在合适温度下较长时间保存。种子的液泡还可以为重组蛋白的积累提供合适的生化环境。干燥后的种子可以避免储存的蛋白被水解或被蛋白酶降解。 （3）和叶子不同,谷类的种子中不含酚类物质,因而也避免了酚类物质给后期的蛋白提取带来的麻烦。 （4）利用谷类和豆类种子生产药用蛋白的弊端是重组基因有扩散到其他粮食作物中的可能,并且在种子的收获和储存过程中可能会与其他种子相互混杂而产生污染。,果实和蔬菜：最大优势是它们可以直接食用或半加工以后食用。因此非常适合于生产疫苗或食物添加剂。土豆已被用于生产人类诊断用蛋白和人奶中所含蛋白，利用土豆生产的疫苗也已被准许应用于人类的临床试验。西红柿和大白菜也是生产人用抗体的常用材料。除此之外，香蕉、胡萝卜、莴苣等也被用为载体生产转基因疫苗。,五、转基因植物疫苗,1、用转基因植物生产基因工程疫苗具有其独特的优势: 植物细胞的全能性; 完整的真核细胞表达系统,使表达产物具有较好的免疫原性及生物活性; 口服植物疫苗接种方便，能有效诱导粘膜免疫反应; 植物细胞的细胞壁起到生物胶囊的作用; 生产简便、成本低廉,不需要冷藏和低温运输; 安全性好,无外源性病原污染等。,2、转基因植物疫苗的研究方向： （1）利用植物生产大量的蛋白质抗原,经分离和提纯再制备成疫苗;（2）不需要分离和提纯,将植物或其某部分作为可以直接口服的疫苗。,3、转基因植物疫苗的免疫原性：转基因植物疫苗最主要的技术问题免疫原性不高，其中重要的原因是表达水平不高，早期的研究报道中,抗原在植物中表达量大多数占总可溶蛋白( total solution p rotein, TSP)的0. 001%0. 3%。,4、可食性疫苗与粘膜免疫： 在胃肠道、呼吸道和泌尿生殖道的上皮细胞中存在有粘膜免疫系统(MIS),一个成功的可食性疫苗应该能够有效诱导MIS反应。 诱导粘膜免疫应答是从膜细胞(M细胞)识别抗原开始的,M细胞位于小肠淋巴组织(如派伊尔氏淋巴集结)的粘膜上，将识别的抗原转移到下层滤泡组织,滤泡组织富含抗原呈递细胞,抗原表位呈递到抗原呈递细胞的表面,在Th细胞协助下激活B细胞,活化的B细胞转移到肠系淋巴结并成熟分化为浆细胞。 浆细胞能在粘膜部位产生分泌型IgA，同时，派伊尔氏淋巴集结中也聚集有能产生血清型抗体的B淋巴细胞，产生并分泌血清型抗体到血液当中，因此，摄取特异性的转基因植物抗原也能诱导产生相应的血清型IgA和IgG反应。 可食性疫苗要注意的两个问题：消化道降解和免疫耐受。,5、免疫原基因的高效表达策略：,（1）优化重组基因结构：免疫原在植物中的有效表达,在一定程度上依赖于选择合适的保护性抗原编码序列以及构建适宜于植物转化的表达盒。已有许多方法来优化重组基因的结构,使其能更适合在某种特定的植物中表达。,（2）植物膜泡运输机制靶向表达抗原蛋白：真核细胞内许多蛋白质需靠膜泡从一种细胞器运输到另一种细胞器, 基本过程包括:膜泡在供膜处芽生形成,将被运输蛋白包在其中,定向地运输到受膜后相互融合将被运输蛋白释放,从而完成膜泡运输过程。若将表达的不同抗原蛋白通过各种分选信号经植物细胞内膜泡定向运输到内质网( ER) 、液泡( vacuoles)或分泌到胞外 ( extracellular compartments) ,则不仅能使蛋白进行正确的翻译后修饰(如抗原糖蛋白的糖基化) ,而且能提高抗原的表达量。,常用的分选信号为内质网滞留信号肽( ER retrieval signal) SEKDEL,它具有使所表达的外源蛋白在内质网中累加的作用。例如：在编码麻疹病毒H蛋白序列的C - 未端加上SEKDEL可提高抗原表达量46倍,腹腔注射和灌饲后能诱导小鼠产生血清特异性抗体。,（3）载体蛋白与抗原决定簇的融合: 将相关抗原决定簇与合适的载体蛋白融合,以便于筛选高表达量的转基因植株,或使抗原蛋白靶向作用于细胞位点,从而提高疫苗的免疫原性。,举例：霍乱毒素B亚单位(CTB)与大肠杆菌热敏肠毒素B亚单位(LTB )具有结合神经节苷脂GM1的功能, 使融合蛋白紧密结合在肠道黏膜细胞表面,更易与消化道黏膜作用,进而刺激产生黏膜IgA和血清IgG抗体,加强免疫效果。H IV-1 gp120 V3环与CTB在转基因马铃薯中融合表达, GM1-EL ISA 检测到CTB-gp120 融合蛋白五聚体与肠上皮细胞膜受体结合活性。因此, CTB 和LTB可作为载体蛋白或免疫佐剂与抗原决定簇基因融合表达,强化半抗原的免疫原性。,（4）叶绿体遗传转化：叶绿体转化系统独立于传统的核转化,为植物导入外源基因提供了新途径。 优点:超量表达目的基因;以定点整合方式导入外源基因从而消除了位置效应及基因沉默;具原核表达方式,能以多顺反子的形式表达多个基因;母系遗传方式可防止基因扩散;基因产物区域化并能提供适于某些产物发挥功能的小环境等。 叶绿体中外源基因的表达量可高达46% TSP; 烟草叶绿体表达的CTB 也可达4. 1%TSP。 叶绿体遗传转化研究工作还有待于深入开展,限制高等植物叶绿体转化的主要瓶颈是大多数植物的叶绿体基因组序列不清楚,因此无法确定用于载体构建的同源重组片段和外源基因的插入位点。,6、口服免疫耐受性：作为植物口服疫苗,免疫耐受的产生对疫苗的作用显然是致命的,因此研究其与粘膜免疫反应的关系非常重要。大量动物实验的结果显示,机体对食物的口服免疫耐受性与免疫系统的抑制性T淋巴细胞( Ts)的功能密切相关。参与口服耐受性的Ts细胞是CD8+ T淋巴细胞,其表面的T细胞受体可能是TCR,迁移至肠系膜淋巴结后进入全身淋巴系统。转基因植物疫苗是否会引起口服耐受,目前尚无定论。,7、部分转基因植物疫苗,8、转基因植物口服乙肝疫苗研究进展,HBV病毒粒子,血清中的乙肝病毒颗粒,直径22nm的小球形颗粒；管状颗粒，长约100700nm，宽约22nm;直径为42nm的大球形颗粒。小球形颗粒及管状颗粒均为过剩的病毒外壳，含表面抗原，大球形颗粒即病毒颗粒，有实心与空心两种，空心颗粒缺乏核酸。,乙肝表面抗原已相继在烟草、马铃薯、羽扇豆、莴苣等十几种植物中实现了表达。,1992 年, 在转基因烟草中首次实现了HBsAg 的成功表达,表达量占烟草TSP的0.01 % ,表达的HBsAg 为22 nm 左右的颗粒,与从HBV 患者血液中分离出的HBsAg 病毒样颗粒的大小相一致。,1993 年,中科院微生物所利用农杆菌感染叶盘的方法成功转化了烟草G-140 品种,也获得具有乙肝免疫活性的烟草植株及后代,所表达的HBsAg 在电镜下检查也呈现为22 nm 的颗粒。,（1）烟草中表达乙肝疫苗,1995 年, 从转基因烟草中提取HBsAg ,混合完全福氏佐剂免疫小鼠。试验结果表明,转基因烟草表达的HBsAg 与酵母细胞表达的H