实验一大肠杆菌感受态制备及外源DNA的转化.ppt

实验一 大肠杆菌感受态制备及外源DNA的转化,实验目的,1.了解转化的概念及其在分子生物学研究中的意义。 2.学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞的方法。 3.学习将外源质粒 DNA 转入受体菌细胞并筛选转化体的方法。,实验原理,转化( Transformation )是将异源 DNA 分子引入另一细胞品系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究的基本实验技术。,转化中的受体细胞,转化过程所用的受体细胞一般是限制性修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株，常用 RM 符号表示。,转化方法：电击法、 CaCl2、 RuCl等化学试剂法 感受态细胞：的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源 DNA 分子通过时细胞的状态。 转化细胞(转化子)：带有异源 DNA 分子的受体细胞( Transformant )。,实验原理,实验原理,本实验以 E.coli DH5 菌株为受体细胞，用 CaCl2 处理受体菌使其处于为感受态，然后与 pUC18质粒共保温，实现转化。 pUC18质粒携带有抗氨苄青霉素的基因，因而使接受了该质粒的受体菌具有抗氨苄青霉的特性，用 Apr符号表示。将经过转化后的全部受体细胞经过适应稀释，在含氨苄青霉素的平板培养基上培养，只有转化体才能存活，而未受转化的受体细胞则因无抵抗氨苄青霉素的能力而死亡。,抗Amp,宿主细菌,含Amp培养基,影响转化率的因素,细胞生长状态和密度。 转化的质粒 DNA 的质量和浓度。 试剂的质量。 防止杂菌和其它外源 DNA 的污染。,实验仪器,超净工作台,离心设备 台式高速冷冻离心机,恒温空气摇床,恒温培养箱,培养皿,实验试剂,大肠杆菌DH5 LB培养基， 0.1mol/LCaCl2溶液（预冷） 氨苄青霉素 pUC18质粒,实验步骤,菌株活化 感受态细胞制备 外源DNA的转化,实验步骤,菌株活化 1用接种环直接取冻存的大肠杆菌DH5，在LB培养基平板表面划线，于37培养16小时 2挑取一个单菌落，转到35mlLB培养基中，于37培养35小时 3将培养液全部转到100mlLB培养基中培养23小时，到OD6000.30.4,实验步骤,感受态细胞制备 4将培养液转入1.5ml离心管中，在冰上放置1530min 54000rpm离心5min,弃上清 6加入0.8ml预冷的0.1mol/l CaCl2,悬浮沉淀，冰上预冷10min 74000rpm离心5 min,弃上清 8加入0.2ml预冷的0.1mol/l CaCl2,悬浮沉淀，即可使用。也可加入总体积15的甘油 可70长期保存,实验步骤,转化 9 取目的DNA加入大肠杆菌感受态细胞中，于冰上放置30min 10 于42水浴90S 11 冰上放置2min 12 加入800lLB液体培养基于37培养1小时 13 将培养液均匀涂布在含Amp+的培养基平板上 14 将平板放置于37恒温培养箱中培养12-14个小时，然后观察结果,对照组,对照组1: 以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,其它操作与上面相同。此组正常情况下在含抗生素的LB平板上应没有菌落出现。 对照组2: 以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,但涂板时只取5l 菌液涂布于不含抗生素的LB平板上，此组正常情况下应产生大量菌落。,转化率,统计每个培养皿中的菌落数。 转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子，根据此皿中的菌落数可计算出转化子总数和转化频率，公式如下： 转化子总数菌落数稀释倍数转化反应原液总体积涂板菌液体积 转化频率（转化子数每mg质粒DNA）转化子总数质粒DNA加入量(mg) 感受态细胞总数对照组菌落数稀释倍数菌液总体积涂板菌液体积 感受态细胞