用基因芯片检测单核苷酸多态性反应原理

用基因芯片检测单核苷酸多态性反应原理*中国生物工程杂志China Biotechnology, 2005, 25(11):5256张小燕1*左明雪1张占军2王忠3李瑶4(1 北京师范大学生命科学院北京 北京中医药大学临床医学院北京)(3 中国中医研究院西苑医院北京 复旦大学生命科学院上海）摘要基因芯片技术因其高通量、高效率的特点被用于第三代遗传标记单核苷酸多态性位点的筛选。近几年SNP芯片研究在反应原理方面取得了重大进展，其中包括基于核酸杂交反应的芯片、基于单碱基延伸反应的芯片、基于等位基因特异性引物延伸反应的芯片、基于“一步法”反应的芯片、基于引物连接反应的芯片、基于限制性内切酶反应的芯片、基于蛋白DNA结合反应的芯片，及基于荧光分子DNA结合反应的芯片。比较了上述各种芯片技术方法的优劣，为进一步科研工作的开展提供了参照，并综述了SNP芯片在疾病基因组学、药物遗传学和个体识别等科研领域的应用，且对其今后的发展方向进行了阐述。关键词基因芯片单核苷酸多态性疾病基因组学收稿日期：20050125修回日期：20050901*国家自然科学基金资助项目（）* 电子信箱：随着2001年人类基因组研究的完成,涌现出大量可利用且亟待分析筛选的基因组数据,这就要求有大规模、迅速的检测方法与技术来完成大量候选基因中的遗传标记的筛选。单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism, SNP）与基因芯片（microarray）相结合的战略正是应这一需求脱颖而出,成为生命科学界关注的新焦点。1SNP芯片技术简介单核苷酸多态性是由基因组核苷酸水平上的变异引起的DNA序列多态性,包括单个碱基的转换、颠换以及单个碱基的缺失和插入。其中最少的一种等位基因在群体中的频率不小于1%。作为第三代遗传标记的SNP在人类基因组中约每1 000个碱基就出现一个，并具有如下特点：(1)数量多,分布广泛；(2)遗传稳定；(3)易于基因分型；(4)适于快速、高通量检出。SNP自身的特性决定了它比其他两类遗传标记更适合于对复杂性状的遗传解析以及基于群体基因识别等方面的研究,促使人们不断地寻找新的SNP标记和革新SNP检测技术。目前已有多种方法可用于SNP检测,传统的SNP检测方法是采用一些已有的成熟技术,如DNA测序、限制性酶切片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism, RFLP)、单链构象多态性(single strand conformational polymorphism ,SSCP)、变性高效液相色谱(denaturing high performance liquid chromatography, DHPLC)等。这些技术虽在某种程度上能完成对SNP的检测,但距快速、高效、自动化的目标还相差甚远。DNA芯片技术是近年来新开发的一种DNA序列变异检测工具。其原理是利用目标DNA与支持物上所固定的密集的寡核苷酸探针阵列进行等位基因特异性反应,根据反应后信号的有无和强弱确定SNP位点。近年来随着复杂性疾病研究的深入，以及可利用的基因组数据的增加, 基于各种原理的SNP芯片被开发出来，以适应不同目的、规模和条件的基因分型。2SNP芯片反应原理的研究进展2.1基于核酸杂交反应原理的SNP芯片等位基因特异性寡核苷酸杂交反应(allele-specific oligonucleotide hybridization, ASO)是利用固定在芯片上的寡核苷酸与标记DNA靶标的序列特异性杂交，其分辨原理基于单碱基错配对DNA双螺旋结构稳定性的影响，因此分辨率依赖于反应中SNP位点前后的寡核苷酸序列和杂交反应条件。该反应很早已经被广泛使用，其优点是原理简单、操作方便，缺点是由于非特异性杂交导致分辨率不高，易产生假阳性1。2005, 25(11)张小燕 等：用基因芯片检测单核苷酸多态性反应原理中国生物工程杂志 China Biotechnology Vol.25 No.11 20052.2基于单碱基延伸反应原理的SNP芯片单碱基延伸反应(single base extension，SBE)，又名微测序法(minisequencing),其原理如图1所示，根据待检测样品的SNP位点5端序列设计引物（不包括SNP位点）并将其直接固定在芯片上，以待测样品的PCR产物作为模板，加以用各色荧光或者其他标记物标记的4种ddNTP，在适当的条件下，在DNA多聚酶的催化下与PCR产物配对的引物直接在芯片上进行固相单碱基延伸反应，根据样本序列中特异的碱基（SNP）加入特异的ddNTP，检测荧光的种类便知SNP信息2。DNA多聚酶的特异性使该方法的敏感度和分辨率均较高，但其缺点是必须使用多色荧光系统以及相应的检测系统，而且多种染料的激发光和发射荧光的光谱往往会有较大部分的重叠，从而干扰对荧光强度的测量精度3。图1单碱基延伸反应（SBE）检测SNP基因型(a): 寡核苷酸引物固定于芯片上； (b): 待测PCR产物与引物碱基配对；(c): DNA聚合酶作用下的单碱基延伸反应；(d): 荧光种类的检测Fig. 1SNP genotyping by single base extension(SBE)(a)：Oligonucleotide primers were immobilized on microarray; (b):PCR products and primers paired bases; (c): Single base extension catalyzed byDNA polymorphism; (d): Detection of fluorescence 2002年，Hirschhorn等4创建的SBE-TAGS法，原理如图2所示，在芯片上进行单碱基延伸反应时，使用了具有双重功能的引物，即除了等位基因特异性的序列，还另有一段具有特定序列的标签(tag)。由于对应于每一个位点都有一个不同的标签，基因型的检测反应能够以一个多重形式进行，通过引物上的标签和固定在芯片上的互补的标签相结合，不同位点的目标产物能够在芯片上相分离。这种方法的优点是简单、便宜，而且精确度较SBE高，用此方法对芯片上的100个SNP位点、5 000多个基因型进行了试验，结果证明正确率是99%5。图2SBETAGS检测SNP基因型Fig. 2SNP genotyping by SBETAGS(a): SBE-TAGS dual primers; (b): SBETAGS reaction2.3基于等位基因特异性引物延伸反应原理的SNP芯片等位基因特异性引物延伸(allele-specific primer elongation)也是依赖于DNA聚合酶的对错配碱基的敏感性进行的6。它的原理与SBE大致相同，但是引物的3端为SNP位点，且用以扩增的是dNTP而非ddNTP，因此引物末端延长的并非单个碱基，而是与靶标互补的核苷酸序列7。与SBE相比，该方法只需要单色荧光系统，而且荧光信号较强。其缺点是特异性不强，假阳性率较SBE高8。为了克服这一缺点，Omeara等9将三磷酸腺苷双磷酸酶引入到等位基因特异性延伸反应中以控制反应特异性。在该酶介导的等位基因特异性延伸反应中利用了错配引物和完全匹配引物延伸反应中的动力学差异，完全匹配引物的反应速度较快，能够在酶切之前完成引物链的延伸，而错配引物速度很慢，引物延伸速度小于降解速度，最后被完全消化。该方法克服了假阳性高的缺点,适合于精确有效的大规模基因分型。反转录酶在DNA-RNA双螺旋中区别终端错配的能力也被用于提高芯片上单核苷酸多态性分型的精确性。其分辨原理基于由反转录酶介导的等位基因特异性引物沿着RNA靶标延伸反应的特异性。该方法能真实反映出转录后的基因序列中的单个位点的等位基因的情况，对于研究基因转录过程有一定的帮助10。但是由于其假阳性较高和反应条件较苛刻，所以目前研究较少。2.4基于“一步法”反应原理的SNP芯片虽然芯片筛选的最大特点是高通量，但无论是单碱基延伸反应还是等位基因特异性引物延伸反应均需要靶标的扩增、制备和纯化等步骤，从而使大规模的基因分型工作费时耗力。Huber等11建立了将基因组DNA直接用于基因分型“一步法”芯片系统，所谓“一步法”，即将用于制备分型靶标的多重扩增反应和用于基因分型的等位基因特异性延伸反应在芯片平台上相结合，使两者直接在芯片上的单个反应步骤中完成。这种在芯片平台上进行的多重PCR固相扩增反应为SNP检测提供了一个有力的工具，避免了芯片外繁琐的液相PCR制备靶标的步骤，大大提高了芯片检测的效率，该方法在诊断和大规模的基因分型中具有很好的应用前景12。2.5基于引物连接反应原理的SNP芯片该方法与杂交延伸相似，不同之处在于，它利用T4噬菌体DNA连接酶连接DNA切口，以及粘性末端在探针末端连接上特殊设计的且与样品DNA中SNP位点下游片段完全互补的荧光标记探针13。在该方法中，等位基因的可变碱基设计在探针3末端，与靶序列的可变形式对应。与样品DNA完全匹配的探针能够在连接酶的催化下与荧光探针连接而不被洗脱，从而检测到荧光信号。常用的酶还有热稳定性DNA连接酶，因为它能高特异性地检测DNA碱基改变，并在较大的温度范围内都有活性14。2.6基于限制性内切酶反应原理的SNP芯片Yoshino等15构建的单细菌磁粒子（BMPS）微阵列系统利用了限制性酶切的原理检测了人的12号染色体上的ALDH2基因的寡核苷酸多态性位点。其步骤是直接将末端标记的PCR产物固定在BMPS上，限制性酶切后检测荧光强度值。如果被检测基因是一种可以被酶切的基因型，那么荧光标记末端被切下洗脱，检测不到荧光或者荧光较弱，反之则较强。该法原理和操作简单，酶切特异性强，但是由于酶切可能不完全，所以假阳性率较高。2.7基于蛋白DNA结合反应原理的SNP芯片该方法的原理是在开放模式的DNA芯片上进行非特异性核酸杂交,再用荧光标记的错配结合蛋白（Muts）与错配碱基结合，根据荧光的强弱来判定碱基的错配与否，以此判定SNP位点16。目前所用的大多数基于芯片的SNP检测方法只能适用于已知突变的检测， 但是Muts法对这些技术进行了补充，由于该方法基于错配原理而且对于突变位点在探针中的位置和探针长度的要求不像其他芯片那样苛刻，因而适合于新的SNP位点的发现。但该方法的缺点是：(1)由于检测基础是错配杂交，因此应尽量采用杂交效率比较高的主动杂交芯片，如微电子芯片，这就大大限制了其应用范围；(2)各种类型的错配碱基对与错配结合蛋白的结合能力不同而引起了假阳性率的提高，使得用于判定SNP基因型的准则难以确定。2.8基于荧光分子DNA结合反应原理的SNP芯片除了DNA和蛋白相互作用外，Goto等17用荧光分子丫啶酯对错配DNA进行检测以分析点突变的SNP芯片方案，又称为杂交保护机制（HPA）。在芯片上固定有在SNP位点处标记了丫啶酯的探针，与单链靶标杂交成双链DNA，洗脱后碱基错配处的双链DNA解链环化，释放出荧光分子，而完全匹配的探针处则不发生这种情况，因此只有完全匹配的探针才能检测到荧光。该方法较蛋白DNA结合反应的芯片简单，只需单一荧光标记，不需主动杂交，但是假阳性率得不到保证，而且不适用于新的SNP位点的发现。综上所述，不同方法有其适用范围和优缺点，研究者应根据不同的目的选取合适的方法，以达到最大的检出效率和准确性。3SNP芯片的应用和前景3.1在疾病基因组研究中的应用遗传性疾病的基因诊断是采用分子生物学的方法在DNA和RNA水平上对某一疾病的相关基因进行分析，从而对特定的疾病进行诊断。SNP芯片的出现在某种程度上说，恰恰是为基因诊断的广泛应用提供了很好的工具和平台，在芯片上根据相关致病基因特定的基因组序列，针对各种突变设计相应的核苷酸探针进行检测。随着人类基因组计划和后基因组计划的开展越来越多的与遗传病相关的基因被揭示出来，基因突变检测技术已得到了快速发展，成为诊断多种遗传病的常规手段18。3.2在药物遗传学研究中的应用药物遗传学是药物基因组学研究内容之一，其侧重点是研究药物反应多态性的遗传基础以及将研究成果用于药物开发和个性化治疗。药物遗传学的研究模式通常是通过基因组测序发现基因多态性，如SNP,然后进行药理和毒理学研究，检测其对临床药物反应多态性的影响。在研究中利用SNP芯片技术进行基因功能及其多态性研究，以确认与药物效应、药物吸收、代谢、排泄等相关的基因，并查明这些基因的多态性，这样就加速了药物基因组学的发展；另一方面，芯片技术利用药物基因组学的研究成果，根据基因型将人分群，以实现药物基因组学研究的目的和价值。因此芯片技术对药物基因组学研究影响重大19。3.3在个体识别中的应用人们的遗传背景有99.9%是相同的，但是每个人却在各个方面表现得千差万别，从本质上说，这些都是由于剩余的0.1%的差别造成的，这些差别即多态性。SNP芯片目前已被用于这些多态性的鉴别，以期制作个人鉴别的“基因身份证”。这些芯片的设计思路是，先根据SNP位点的分布特点和频率选择一定数量的位点，通过计算这些位点的个体识别率区分出世界上的任何一个人,然后根据这些位点各自独特的核苷酸序列，设计寡核苷酸探针，通过一定的流程制成SNP芯片。当一个人的基因组DNA经过抽提、PCR标记和杂交以后会得出各个位点的结果，这些数据就代表了一个人的身份。一串符号就是某个人的基因身份证19。总之，SNP芯片已经，并将继续被用于生命科学研究及实践，其高效、高通量的优点必将使它在医学、微生物学、中药学、遗传学、司法等领域得到广泛应用，在人类探索自身生命奥秘的进程中发挥举足轻重的作用。参考文献1 Ji M, Hou P, Li S, et al. 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