病毒与健康3-病毒的纯化、检测.ppt

病毒的纯化、检测和病毒病的诊断方法,病毒的纯化,Stanley 在1935年首次提纯TMV 病毒纯化对病毒学发展所起的作用十分巨大.,病毒的纯化前的预备工作,1.繁殖病毒 自然感染病毒的生物体的器官组织或细胞 的量往往难以满足提纯需求,需要用人工接 种寄主来大量繁殖病毒.,病毒的纯化前的预备工作,首先要选择最适合的寄主 对植物病毒,长期以来都是接种整体植物 一般说,用机械摩擦接种比昆虫媒介或嫁接等方法简便.,病毒的纯化前的预备工作,利用生物学方法纯化病毒 采集自然感染的生物体组织器官作原材料来提纯某种病毒时,混合感染的概率很大 生物学纯化:病毒在很多植物或动物细胞上产生一个个单个病毒株体,病毒的纯化前的预备工作,病毒纯化的基本原理,病毒的释放和萃取 病毒颗粒主要存在与寄主组织细胞内,因此提纯的第一步是设法破碎寄主感病的细胞,病毒纯化的基本原理,大多数病毒毒粒的等电点在PH4.0左右,而最稳定、溶解度最大是在PH7.0左右 此时可用0.1mol/L磷酸缓冲液来处理 一般破碎细胞、萃取以及以后各提纯步骤都在4左右进行操作。,病毒萃取液的分级纯化,清除较大的细胞器 去除较大的细胞组分如：细胞核、线粒体、叶绿体和细胞壁等,病毒萃取液的分级纯化,去除寄主蛋白质 1、沉淀法 用各种沉淀剂来沉淀，最常用的是硫酸胺，其溶解度高，更经济。 不同饱和度的硫酸胺可沉降水合化程度不同的病毒或蛋白质,病毒萃取液的分级纯化,范围广泛的有机化合物的亲水性程度不同，通过与蛋白质竞争水分，使蛋白质脱水而沉淀。最常用的是乙醇和丙酮。,病毒萃取液的分级纯化,离心法 由于大多数病毒颗粒在某种介质内的沉降速度与寄主组分有差别，使用离心法可有效地纯化病毒。,病毒萃取液的分级纯化,差速离心法 差速离心即将低速离心所得澄清液进行超高速离心，使大部分可溶性蛋白质和小分子化合物留在上清液中，而病毒颗粒等则保留在沉降物中,病毒萃取液的分级纯化,密度梯度离心 先在一个吊篮式离心管内由下而上铺以浓度递减的惰性致密介质，如蔗糖、甘油等,病毒萃取液的分级纯化,凝胶色谱法 这是利用化合物分子大小和扩散速率来区分它们的方法,病毒萃取液的分级纯化,电泳 一般较少用电泳方法制备病毒，因制备量少且繁杂。,病毒的检测,定性或定量的病毒检测的理论依据是病毒的理化性质，不同的方法所依据的性质不同，因此，检测结果也不一定完全相同。,侵染力的测定,侵染力的测定是对病毒活性的测量，也就是病毒与寄主特异反应的测定。 定量测定病毒活性又称滴定。与寄主产生某种反应所用最小病毒量叫侵染单位。,侵染力的测定,某病毒制品的效价是指每单位体积中侵染单位的数量。 动物病毒的滴定方法是计量病毒在铺满的菌落层或动物单层细胞上产生的噬斑或浊斑数。,侵染力的测定,一个病毒悬浮液的效价是以单位体积内的侵染单位来表示，在一定条件下即相当于毒粒数目。,病毒的培养,1、原代细胞 猴肾细胞、兔肾细胞、人胚胎肾细胞 2、二倍体细胞 纤维原细胞 3、连续细胞系 RD、MDCK、LLC-MK2,血清学方法,病毒颗粒产生免疫原性的活性部分主要是外壳蛋白表面上的抗原决定簇. 1、免疫沉淀法 抗原和抗体在有电解质存在下可以特异地结合形成沉淀,血清学方法,中和试验 此法常用于测知人、畜体内是否有中和抗体存在，及其该中和抗体的效价。,血清学方法,补体结合试验 此法主要利用补体的两个特性：一是可与任何抗原抗体复合物结合；二是免疫裂解反应必须有它的参与。,血清学方法,凝胶扩散法 在琼脂凝胶中扩散的病毒或其抗原与其抗体相遇形成沉降带,血清学方法,酶联免疫吸附测定法 酶标记的抗原或抗体间的特异性反应，并通过检测酶的颜色反应而定性定量检测抗原或抗体的方法。,病毒核酸检测,这类诊断方法针对的目标是病毒的基因组核酸,病毒核酸检测,杂交法 关键原理是在已知病毒基因组全序列或部分序列基础上，针对某段特定序列设计一段与该序列互补的核酸序列，又称为探针。进行检测时，必须对探针进行标记。,病毒核酸检测,聚合酶链反应 是一种对特定的DNA片段在体外进行快速扩增的方法。,病毒核酸检测,反转录PCR 技术核心是在逆转录酶的催化作用下，将RNA病毒的基因组通过随机引物逆转录为cDNA后，再经过PCR过程将cDNA进行扩增。,病毒核酸检测,依赖核酸系列的扩增 支链核酸信号放大系统 信号检测技术和即时PCR 其他衍生PCR技术 微阵列技术,病毒病核酸分子检测的优化和质量控制,实验室内的区域设置 尿苷酶防污染技术 检测对照的设置 核酸扩增检测系统的优化 核酸样品的分离纯化,SARA,传染性非典型肺炎是一种急性的呼吸系统感染，世界卫生组织(WHO)将其名称公布为严重急性呼吸道症候群(SARS)。SARS是由一种新病原引起的，临床主要表现为肺炎，在家庭和医院有显著的聚集现象。,非典型肺炎是什么病？,“非典型肺炎”发生，其英文名为Atypical Pneumonias ,系指一组具有肺火表现，如发热、头痛、咳嗽、咳痰等症状，肺部X线片有浸润阴影等肺炎体征，而病原体并不明确或由非细菌性病原体引发的肺炎，总称为非典型肺炎。,非典型肺炎是什么病,非典型肺炎是什么病？,既往有因为肺炎支原体、肺炎衣原体、鹦鹉热衣原体、军团菌、立克次体等分别引发非典型肺炎流行的记载。1976年美国、西班牙、瑞典、荷兰、英国等先后均有过因军团非典型肺炎暴发流行的报道。因其他病原体引发非典型肺炎流行也曾发生过。,非典型肺炎的病因是什么？,在2003年4月16日世界卫生组织宣布，经过全球科研人员的通力合作，终于正式确认冠状病毒的一个变种是引起此次非典型肺炎的病原体。,非典型肺炎的病因是什么？,冠状病毒直径为80160nm，为有包膜的单股RNA病毒，属冠状病毒科，至少有4株可引起人类呼吸道感染，OC43株在成人中能引起发热、胰腺炎、心包炎等。冠状病毒感染在人群中很普遍，,冠状病毒,非典型肺炎与一般肺炎有什么异同？,非典型肺炎与一般肺炎（如同细菌引起的大叶性肺炎或支气管肺炎）有相似的地方，其症状可为发热、咳嗽、胸痛全身酸痛、肺部阴影等，总体表现与一般肺炎主要症状很相似。,非典型肺炎与一般肺炎有什么异同？,它们也有不同之处： 非典型肺炎常表现不同程度的传染性，短期内形成不同范围、不同程度的流行；一般肺炎不形成流行传播，传染性小。,非典型肺炎与一般肺炎有什么异同？,由于非典型肺炎病原体的相对不确定性，使其表现总有极其特殊的部分，特别是全身中毒症状重而突出，呼吸变化多而明显，易出现呼吸衰竭；一般肺炎的病原体常为细菌，可以很快查明，表现相对规律，易于预测和把握。,非典型肺炎与一般肺炎有什么异同？,非典型肺炎有一部分在治疗和预防上目前没有十分有效的治疗药物，特别是病毒引发的非典型肺炎；一般肺炎对抗生素等药物敏感，治疗有良好效果。,非典型肺炎与一般肺炎有什么异同？,一般肺炎可因细菌毒力极强而引发死亡，如金黄色葡萄球菌肺炎、链球菌肺炎等，但其主要发生在体质或抵抗力较差的人群，其严重程度也也人体体质关系密切；非典型肺炎同样也存在相似诱在，发病也也体质密切相关，但并没有一般肺炎那么突出。,非典型肺炎与一般肺炎有什么异同？,非典型肺炎可出现突发的大量内霉素血症引发患者死亡，并且不易被控制；一般肺炎的病情变化较容易预测，预后也较易预测。,非典型肺炎与一般肺炎有什么异同？,在科学研究中，一般肺炎比非典型肺炎在各方面的研究都清楚得多，这也与非典型肺炎的不确定性有直接的关系。,非典型肺炎与一般肺炎有什么异同？,非典型肺炎死亡率明显高于一般肺炎的死亡率。,非典型肺炎是如何传播的？,本次流行的非典型肺炎病原体已经确定为冠状病毒的变异体，主要通过呼吸道飞沫传播。,非典型肺炎是如何传播的？,推断非典型肺炎流行特点及方式可能是近距离飞沫传播，而飞沫接触粘膜可能是主要传播途径，开放的粘膜包括鼻腔、口腔、眼结膜等。,非典型肺炎是如何传播的？,常规通风条件好的环境下非典型肺炎不易传播；天气变热，温度高时，不利于病原体传播，一般病毒或衣原体等在寒冷天气下存活时间较长，而气温较高时病原体存活时间却较短，不利其传播，有利于对非典型肺炎的预防。,非典型肺炎是如何传播的？,冠状病毒对理代因子的耐受力较差，56，10分钟、37数小时即可使感染性丧失。乙醚、氯仿、吐温、乙醇（70%）、甲醛、胰酶及紫外线等均可灭活病毒。,非典型肺炎的症状,1首先病人高烧、干咳，并没有一般流感的流涕、咽痛等症状，也没有通常感冒常见的白色或黄色痰液，偶有病人痰中带血丝，病人出现呼吸急促的现象，个别病人出现呼吸窘迫综合症。,非典型肺炎的症状,2非典型肺炎病人白细胞正常或下降。,非典型肺炎的症状,3X光胸片特点与临床状况分离，一般的肺炎先有很重的临床表现，后在X光胸片上可以看到肺部有阴影变化；但此次则是在临床症状还不严重时，X光片中已显示病人肺部有絮状阴影，并呈快速发展趋势。,非典型肺炎的症状,4通常时高烧患者应用抗生素都会有明显效果，但此病用抗生素大多无效。大多数非典型肺炎病人可自愈，个别病情恶化凶险，约有7%的病人需做人工呼吸。,非典型肺炎的症状,5男女之间发病无差别，从年龄看青壮年占70%，与既往的呼吸道传染病患者老少较多不同。,非典型肺炎的症状,6因最初起病时防护措施不够，医务人员属非典型肺炎高发人群，在家庭和医院有聚集现象。,非典型肺炎的症状,7非典型肺炎第一代的传播潜伏期在4天-5天，第二代在10天左右，其病原传染力在传播过程中逐渐下降。,教你如何防范“非典”,1. 避絕非典型肺炎病毒,戴上口罩，以保護自己及保護其他人； 避免前往人煙稠密的地方； 打開窗戶，保持空氣流通； 如無必要，應儘量避免到醫院。如有需要到醫院探病及與病人接觸，應戴上口罩，先洗手洗面才接觸其他人； 有意外遊人士，如有呼吸道感染病徵，最好不要繼續旅程，並馬上見醫生； 若發現子女染病，不要讓他們上學或託兒所。,2. 加強個人衛生,保持良好個人衛生習慣，打噴嚏、咳嗽和清潔鼻子後要徹底洗手； 勤洗手及洗澡，以保持雙手及身體清潔； 勤洗衣服，以徹底清潔可能沾染在衣服上的病毒。,3. 加強抵抗力,均衡飲食； 多喝開水：成人每人每日6-8杯開水，幫助排除毒素； 定時運動； 有足夠休息； 減輕壓力； 不要吸煙。,教你如何防范“非典”,教你如何防范“非典”,教你如何防范“非典”,教你如何防范“非典”,教你如何防范“非典”,教你如何防范“非典”,教你如何防范“非典”,教你如何防范“非典”,教你如何防范“非典”,教你如何防范“非典”,教你如何防范“非典”,教你如何防范“非典”,教你如何防范“非典”,教你如何防范“非典”,教你如何防范“非典”,l. 加强个人卫生，勤洗手。,教你如何防范“非典”,2. 室内经常通风换气，保持生活、工作环境的空气流通。搞好环境卫生，勤晒衣服和被褥等，经常到户外