《抗原抗体反应》PPT课件.ppt

1,2,ppt课件制作及讲课 原则 自愿 有兴趣 组织方式 分组讲 选出最好在班上讲 内容 自选 数量 15张 分别折算 1 2 3次作业,3,上章小结： 一基本概念 主要组织相容性复合物等 二MHC抗原的结构和功能 MHC-I MHC-II结构、功能及两者与肽结合的区别 三MHC抗原基因多态性及结构 四MHC的检测原理和应用,4,第七章 抗原抗体反应及应用,一节抗体的制备 二节抗原抗体反应 三节抗原抗体反应的应用,5,一节抗体的制备,一抗血清的制备及抗体纯化 二单克隆抗体的制备 三 抗体工程 四 催化性抗体 五 抗体在抗肿瘤治疗中的应用,继续,6,一抗血清的制备及抗体纯化 1、抗血清的制备 抗血清：含有能与相应抗原结合的抗体分子的免疫动物血清。,抗血清的纯化 见下图,免疫动物 抗原(半抗原需经转化),佐剂乳化 免疫动物,抗血清的制备 抗血清的效价测定,采血 获得抗血清,7,抗血清+3倍体积0ddH2O,调pH到7.7,加50% -20酒精至最后质量分数为20%(保持-5),悬浮于0.015-0.02mol/L冷NaCl,用0.05mol/L醋酸调pH至5(0),用0.5mol/LNaH2PO4调至pH7.4, -20至-3095%酒精至最后质量分数为25%，维持在-6 ,悬浮于ddH2O,用0.05mol/L醋酸调至pH5.1,调pH至5.5,离子强度为0.010.0075,加50%冷酒精至最后质量分数为10%(-3),通过分子筛将二者分开,2、抗体 初步纯化,8,抗血清的初步纯化只是多数抗体类别的纯化。 上述冷酒精沉淀法是1946年Cohn创立的较好方法。该法得到的只是较粗Ig。 硫酸铵盐析法：比较简便，蛋白质变性小，33%饱和硫盐沉淀各类Ig，分离纯度较差。浓盐使IgA形成二聚体，不宜采用。 离子交换层析法：通过层析法，才能获得高纯度某一类Ig。,9,3、抗体进一步纯化 IgG在血清中含量最高，占7580%，纯化的方法常用33-50%硫铵盐析和DEAE-纤维素柱层析法。 IgG在pH7.5溶液中带正电荷，其它血清蛋白都带负电荷，因此可用阴离子交换剂DEAE-纤维素一次将IgG提纯到很高的纯度。 分离纯化IgM常用18%硫铵沉淀，再DEAE-纤维素柱层析，收集洗脱液，再用分子筛分离，获纯化的IgM。 获得的纯化Ig，在4保存，长期保存需在-20以下。,10,问题：血清中的抗体是由多个抗原决定簇刺激B细胞克隆而产生的抗体，是多克隆抗体(PAb)，通过分离的方法不可能获得真正的单一抗体。 如何获得大量的一种抗体？ 由单一B细胞克隆而产生的抗体，称单克隆抗体(MAb)。,二单克隆抗体的制备,11,1 、制备MAb(monoclonal Ab,mAb)的原理 利用B细胞能分泌抗体而肿瘤细胞能在体外长期培养并可低温保存的优点，通过细胞杂交，融合二类细胞，从而筛选得到既有抗体分泌性又有不断分裂性的杂交瘤细胞，将其细胞单克隆化。 用单克隆化的杂交瘤细胞进行单克隆抗体的生产，称为杂交瘤技术。 该技术是1975年由G.Khler & Milstein创立的。,12,2、制备MAb的基本过程,免疫小鼠品种、加强,脾脏,单细胞悬浮 洗掉血清,骨髓瘤细胞营养缺陷型,PEG,HAT培养基,选抗体 分泌株,增殖阳性克隆,冻存细胞,腹水制备,扩大培养,中空纤维反应器,继续,13,返,Procedures for Producing Hybridomas and Monoclonal Antibodies,14,用于制备B细胞的小鼠常用Balb/c品系，为H-2d单元(倍)型。 B细胞从小鼠的脾脏制取。 为保证B细胞有旺盛的分泌抗体活性，分离前3天一次静脉加强免疫。B细胞要悬浮于没有血清的培养液。 骨髓瘤细胞有多种细胞株，营养缺陷型是一种。 缺陷是细胞缺少次黄嘌呤、鸟嘌呤核苷酸转移酶(HGPRT)和胸腺嘧啶激酶(TK)，另一条核酸合成必须酶。当合成核酸的正常途径被阻断后（培养基中加入氨基喋呤），虽然培养基中有这二种底物(次黄嘌呤、胸腺嘧啶) ，但缺陷细胞仍不能合成核酸而死亡。 如果骨髓瘤细胞与B细胞发生了融合，因B细胞有正常的2套核酸合成酶系，正常途径受阻后，能利用培养基中的次黄嘌呤(H)、胸腺嘧啶(T)来合成核酸，因此融合后的杂交瘤细胞能在选择培养基中正常分裂生长。 骨髓瘤细胞还应该具有不能合成抗体或合成了也不能分泌的特性 融合时，骨髓瘤细胞应处于对数生长期，B细胞有旺盛的分泌抗体活性。 融合细胞按B细胞：骨髓瘤细胞510：1，总细胞数在107-108水平。 加入融合剂：50%的聚乙二醇(PEG)，37下融合12min。 然后用培养液RMPI1640进行洗涤稀释，去除PEG后，于HAT培养基上培养.,15,筛选抗体分泌株：是将对HAT上形成的杂交瘤细胞集落进行抗体活性检测。 单克隆化：将多种细胞混合生长的细胞团分离为单克隆， HAT:即含有次黄嘌呤(H)、氨基喋呤(A)和胸腺嘧啶(T)的选择培养基，简称HAT。 这种培养基能使杂交瘤细胞生长，而营养缺陷型的骨髓瘤细胞不能生长，B细胞因本身在培养基中不能生存。这样就能容易地将已经发生了融合的杂交瘤细胞筛选出来，其它细胞自然被淘汰。,返,1,2,16,三 抗体工程 四 催化性抗体 五 抗体在抗肿瘤治疗中的应用,17,二节抗原抗体反应 一、抗原抗体反应的特点 抗原与抗体的特异性结合,既可以发生在体内,也可发生在体外。 发生在体外是许多免疫检测方法的基础。 抗原与抗体相互作用是非共价的、可逆的,其特性符合许多化学反应的基本原理.,18,特异性 抗原与抗体相互结合没有共价键形成，只能通过次级键相互作用，在极短的距离内才有效，因此抗原决定簇和抗体结合位点在空间上必须处于紧密接触的状态，才能产生足够的结合力(亲和力)。 这种分子间的互补结构决定了抗原抗体结合的专一性。,19,氢 键,次级键有: 氢键 范德华力 疏水相互作用 盐键等,20,抗原抗体结合的可逆性,抗原或半抗原与抗体之间的结合强弱称为亲和力. 抗原抗体结合松散，易于解离，亲和力低，反之亲和力高。,21,Ag或Ab,Ag-Ab,22,二 抗体与单价抗原的作用 三 抗体与大分子多价抗原反应 大分子多价抗原 具有多个抗原决定簇，能与多个抗体结合的大分子物质。 抗原抗体的亲和力和亲合力 单价抗原与抗体的结合力，称亲和力。 多价抗原与抗体的总结合强度，称亲合力。 亲合力大大强于每一位点的亲和力，其强度的增加不仅仅是亲和力的简单相加，是呈几何级数上升的。,23,抗原抗体反应的表现形成沉淀 与抗原抗体比例密切相关，一定浓度的抗体与一定浓度的抗原才能形成沉淀. 抗原或抗体过剩都不能形成沉淀或很少。,抗体过量,抗原抗体适量,抗原过量,网络学说:认为抗原抗体的结合包括许多抗原抗体相互连接形成网络。多价的抗体与多价的抗原反应时，一个抗体可以结合二个或以上相同抗原的决定簇，一个抗原也能与多个抗体结合，从而形成相互交联的网络，当这些聚合达到一定大小时就会从溶液中沉淀出来。,24,交叉反应 有几个决定簇的两个抗原，如果其中有一个决定簇相同，那么免疫获得的抗体中就有能与两种抗原上相同决定簇都能结合的一种抗体，即有交叉反应现象。如M抗原和N抗原,M,A,C,D,B,N,F,H,J,B,25,三抗原抗体反应的应用,1免疫沉淀 2免疫标记 3免疫定位分析,26,1免疫沉淀 由于抗体与相应的抗原两者之间有特异性结合，在体外当两者浓度比例适当时，会发生免疫沉淀反应。 原理：抗原抗体结合形成网络而沉淀。 应用：抗原或抗体的定性及定量分析。 方法：溶液中的沉淀反应 凝胶扩散沉淀 免疫电泳,返,27,溶液中的沉淀反应：液相中的沉淀线不易观察，利用抗原抗体溶液之间的界面形成的沉淀线即环状沉淀试验。在几支试管中加入等量的抗原，再加入递减量的抗体，中性、37保温12hr，可见环状沉淀。,返,28,凝胶扩散沉淀 原理：抗原抗体在半透明的半固相介质中自由扩散形成浓度梯度，两者在比例合适的一定扩散部位相遇形成沉淀线。 用途：测定抗原和抗体的相对浓度，比较不同抗原的特异性纯度和相互关系。 方法：单向扩散法和双向扩散法,返,琼脂凝胶中混有Ab,小孔中加有Ag,沉淀环,单向,29,左右二孔抗原浓度相同，沉淀线融合,右孔抗原浓度较低，沉淀线细并靠近抗原孔,右孔抗原甚微，近抗原孔处只有一弯眉,双向：不同抗原浓度对沉淀线特征的影响,继续,30,在抗原抗体多种体系中沉淀线的特征(一),在抗原孔内有三种抗原成分，分别与相应抗体形成3条沉淀线。由于反应的特异性，线互不干扰，线的顺序位置决定于抗原的性质,二孔内抗原成分性质完全不同，出现沉淀线交叉现象,左孔内含二种抗原成分，其中一种与右孔内相同，出现一条融合线,继续,31,左右二孔抗原性质相同，但右孔浓度过大，产生抗原抗体复合物逐渐溶解的“假刺”现象,在抗原抗体多种体系中沉淀线的特征(二),左右二孔抗原性质大部分相同，沉淀线融合较多,左右二孔抗原性质部分相同，出现部分融合现象,返,32,抗血清,电泳后在胶中间沿电泳方向开一条槽,免疫电泳：是利用蛋白质在凝胶中电泳迁移率不同能被分离开来的特性与免疫扩散结合一起进行分析的方法。,继续,33,火箭电泳：单相免疫扩散与电泳结合的一种方法。,继续,34,双向免疫电泳,返,35,2免疫标记 放射免疫分析 酶联免疫吸附试验（ELISA） 发光与荧光免疫分析 亲和标记免疫分析,返,36,放射免疫分析 是用放射核素标记抗原/抗体，通过放射自显影(固相体系)或液相闪烁仪(液相反应体系)来定量抗原/抗体。有： 直接法：是用标记的抗原或抗体与抗体或抗原直接反应形成复合物而进行测定。 竞争法：是利用放射标记的抗原与未标记的抗原竞争与抗体反应，再以放射强度定量,返,37,酶联免疫吸附试验（ELISA） 162页 是一种免疫酶技术，特点是利用聚苯乙烯微量反应板(或球)吸附抗原/抗体，使之固相化，免疫反应和酶促反应在此进行。 方法有： 直接法、间接法、夹心法,继续,38,酶联免疫吸附试验原理,返,39,发光与荧光免疫分析 是利用化学发光物质如鲁米诺、呷啶酯等的氧化反应引起瞬间发光来测定。增强发光酶免疫分析是在酶促氧化反应中加入增强剂，如荧光素、对-碘酚、黄嘌呤氧化酶等，这不仅可增强发光信号，且保持长时间的稳定发光。,返,40,亲和标记免疫分析 IgG类抗体有一重要特性就是能和葡萄球菌A蛋白特异结合，而且亲和力很高，利用这一特点来对IgG抗体标记，或用前述的酶、同位素、荧光素等标记A蛋白，再使其与IgG结合，这类IgG就带有标记，可进行前述的各种分析。 这里A蛋白就