《基因组奥秘》PPT课件.ppt

基因组(genomics),第三章 基因组,20世纪科学史上三个里程碑: “曼哈顿原子弹计划” “人类登月计划” “人类基因组计划 (Human Genome Project, HGP)”,第三章 基因组,The Human Genome consists of two distinct parts： nuclear genome 3 200 000 000 nucleotides mitochondrial genome 16 569 nucleotides,第三章 基因组基因图谱,一、遗传图谱 （genetic map） 1. 概念： 又称连锁图（linkage map），是指基因或DNA标志在染色体上的相对位置与遗传距离。遗传距离通常由基因或DNA片断在染色体交换过程中分离的频率厘摩（cM ）来表示。1厘摩表示每次减数分裂的重组频率为。厘摩值越高表明两点之间距离越远，厘摩值越低表示两点间距离越近。,第三章 基因组基因图谱,2. 遗传标记 限制性片段长度多态性（ restriction fragment length poly-morphism，RFLP） 短串联重复（short tandem repeat, STR） 单核苷酸多态性（single nucleotide polymor phism, SNP）,第三章 基因组基因图谱,3. 遗传标记制图,限制性内切酶切割DNA 电泳分离特异片段 纯化电泳获取的DNA片段,第三章 基因组基因图谱,用不同内切酶切割分 离的片段 电泳,第三章 基因组基因图谱,将不同的DNA片段用相同 方法切割，并进行拼接。,Overlap重叠,第三章 基因组基因图谱,第三章 基因组基因图谱,第三章 基因组基因图谱,RFLP与SNP的关系 polymorphism 一个等位基因如果它在成分？中出现的频率，即被定义为多态性。 Haplotype（单体型） is the particular combination of alleles等位基因 in a defined region of some chromosome, in effect the genotype in miniature微型，缩影，雏形，模型. Originally used to described combinations of MHC alleles, it now may be used to describe particular combinations of RFLPs.,第三章 基因组基因图谱,heterozygous异质体的,杂合的,杂合子Homozygous纯合子,第三章 基因组基因图谱,STR,第三章 基因组基因图谱,4. 遗传标记的应用 连锁分析 flash1RFLP AND LINKAGE.swf 个体识别 flash2DNA_DetectivePC.exe 亲子鉴定 flash3DNA_DetectivePC.exe,第三章 基因组基因图谱,二、物理图谱（physical map） 1. 概念： 指DNA序列上两点的实际距离，通常由DNA的限制酶片段或克隆的DNA片段有序排列而成。物理图谱反应的是DNA序列上两点之间的实际距离，而遗传图谱则反应这两点之间的连锁关系。在DNA交换频繁的区域，两个物理位置相距很远的基因或DNA片段可能具有较大的遗传距离， 而两个物理位置相距很近的基因或DNA片段则可能因该部位在遗传过程中很少发生交换而具有很近的遗传距离。以bp、kb或Mb表示。,第三章 基因组基因图谱,2. 遗传标记 序列标签部位（sequence tagged site, STS）： 为染色体定位明确、可用PCR扩增的单拷贝序列。STS多数来自于表达序列标签（expressed sequence Tags，EST)，每隔100kb距离就有一个标志。,第三章 基因组基因图谱,3. 物理图谱构建载体 酵母人工染色体（yeast artificial chromosome,YAC）：具有着丝粒、端粒、自主复制顺序（ARS）、外源基因（插入DNA片段为数百个kb2Mb）。 细菌人工染色体（BAC）： 插入DNA序列为80 300kb。 噬菌体人工染色体（PAC）：插入片段为300kb以下。,第三章 基因组基因图谱,pBR322质粒DNA分子的长度为4363bp，此载体中有两个标记基因，一个是氨苄青霉素抗性基因（Apr），另一个是四环素抗性基因（Tetr）。现在已知pBR322DNA分子共有24种核酸内切限制酶的单一识别位点。其中7种限制酶（从12：00位置按顺时针方向）即EcoRV、NheI、BamHI、SphI、SalI、XmaIII和NruI的识别位点位于四环素抗性基因内部，另 外有2 种限制酶即ClaI和HindIII的识别位点是存在于这个基因的启动区内，在这9个限制位点上插入外源DNA都会导致tetr的失活。3种限制酶即ScaI、PvuI和PstI的识别位点位于氨苄青霉素抗性基因内，在这些位点插入外源DNA则会导致ampr基因的失活。由pBR322质粒载体的结构可知其具有如下优点：（1）具有较小的分子量。经验表明，为了避免在DNA的纯化过程中发生链的断裂，克隆载体的分子大小最好不要超过10Kb。pBR322质粒这种小分子量的特点，不仅易于自身DNA的纯化，而且可容纳较大的外源DNA片段；（2）具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择记号，能指示载体或重组DNA分子是否进入宿主细胞以及外源DNA分子是否插入载体分子形成了重组子。标记基因往往可以赋予宿主细胞一种新的表型，这种转化细胞可明显地区别于非转化细胞。当我们把一个DNA片段插入到某一个标记基因内时，该基因就失去了相应的功能。当把这种重组DNA分子转到宿主细胞后，该基因原来赋予的表型也就消失了。要是仍保留了原来表型的转化细胞，细胞内含有的DNA分子一定不是重组子。很显然，既要指示外源DNA是否进入了宿主细胞，又要指示载体DNA分子中是否插入了外源DNA片段，那么这种载体必须至少具有两个标记基因。另外，pBR322质粒载体还具较高的拷贝数，而且经过氯霉素扩增之后，每个细胞中可积累10003000个拷贝，这就为重组体DNA的制备提供了极大的方便。,人工构建酵母微小染色体的具体步骤见上页图。从图中可以看到，先用质粒pBR322为材料，连接酵母的标记基因Leu2（亮氨酸）后去转化大肠杆菌，然后再接上酵母染色体上分离得到的着丝粒CEN3，再去转化大肠杆菌以增殖重组质粒，取得下一步实验用的DNA。接下去是连接从酵母（真核生物）中分离得到的ARS1。ARS是指自主复制顺序（autonomously replicating sequence），这个顺序中可能包含着复制起点。目前已从非洲爪蟾的线DNA，衣藻和烟草叶绿体和核DNA中分离ARS。最后一个步骤是接上染色体端粒。用的是四膜虫（Tetrahymena）的rDNA末端（Tr末端）。这样构建成的质粒去转化酵母细胞后，在细胞内断开成为线状重组DNA分子，可以象天然染色体一样地复制和分离，这就是酵母线状质粒YLp4。,第三章 基因组基因图谱,叠连群contig ，是指彼此间可通过重叠序列而连接成较长片段的一组短片段,第三章 基因组基因图谱,三、序列图（sequence map),DNA测序载体,双脱氧核糖核苷酸,第三章 基因组基因图谱,第三章 基因组基因图谱,地高辛 生物素,第三章 基因组基因图谱,第三章 基因组基因图谱,四、转录图（transcription map) 转录图即是把所有基因定位在基因组的不同位置上。 在整个人类基因组中，只有1%5%的DNA序列为编码序列。在人体某一特定组织的细胞中，一般只有10%的基因是表达的。如果能把某段DNA序列相应的mRNA确定下来，就抓住了基因的主要部分，即可转录部分。所以，一张人类基因组的转录图(也称cDNA图或表达序列图)才是人类基因图的雏形。,第三章 基因组基因的结构,一、基因类别 结构基因 包括编码结构蛋白和酶蛋白的基因，也包括 编码阻遏蛋白和激活蛋白的基因。 调控基因 包括调节基因、启动基因和操纵基因。 二、原核生物基因 特点： 结构紧密，缺少非编码序列，具有公用的启 动子，高突变。,第三章 基因组基因的结构,Lac操纵子，即乳糖操纵子lactose乳糖,Galactosidase半乳糖苷酶permease透明质酸酶transacetylase乙酰基转移酶,第三章 基因组基因的结构,三、真核生物基因断裂基因 断裂基因的发现 二十世纪70年代由R. J. Roberts和P. A. Sharp首先报道。,10S 珠蛋白前体RNA以及其15S 珠蛋白mRNA与小鼠 珠蛋白基因杂交形成R环的电镜图,第三章 基因组基因的结构,1978年，Chambon提出内含子、外显子概念。,第三章 基因组基因的结构,2. 基因结构 编码链：基因5，3 ，的单链。 非编码链：基因3，5，的单链。 外显子（exon）：编码链上的编码序列。 内含子（intron）：编码链上的非编码序列。 GTAG法则：在内含子的5，和3 ，端分别存在一个 保守序列GT和AG。,第三章 基因组基因的结构,侧翼序列（Flanking sequence） 启动子（promotor）：与转录因子和RNA聚合酶结合，调制基因转 录的DNA序列。 TATA 框（TATA box）：-1927bp，TATAA（T） AA（T） CAAT框（CAAT box）：-70 80bp，GGC（T）CAATCA GC框（GC box）： GGCGGG，位于CAAT box两侧。 增强子（enhancer）：具有核心重复序列，可增强基因转录效率的 DNA序列。 终止子（terminator）：控制基因转录终止的DNA序列。 poly A信号： AATAAA 倒位重复序列：DNA回文序列。,第三章 基因组基因的结构,第三章 基因组基因的结构,断裂基因的特点 外显子保守而内含子可变，不同基因可能存在相同的区域。因此，基因的单一性主要是由内含子决定。 内含子多为非编码区，因此多不受选 择的影响，变异较快，由碱基插入、缺失 或替换造成。但内含子的非编码性并非绝 对。 相近物种的外显子相近基因克隆 的一种思路,第三章 基因组基因的结构,Zoo blot describes the use of Southern blotting to test the ability of a DNA probe from one species to hybridize with the DNA from the genomes of a variety of other species.,第三章 基因组基因的结构,zoo blot with a probe from the human Y chromosomal gene zfy identifies cross-hybridizing fragments on the sex chromosomes of other mammals and birds. There is one reacting fragment on the Y chromosome and another on the X chromosome. Data kindly provided by Dabid Page.,第三章 基因组基因的结构,如何应用Zoo blot 确定基因序列? 染色体步行技术,第三章 基因组基因的结构,第三章 基因组基因的结构,The gene involved in Duchenne muscular dystrophy has been tracked down by chromosome mapping and walking to a region in which deletions can be identified with the occurrence of the disease.,第三章 基因组基因的结构,如何确定一个基因的内含子和外显子的数目？ 1. 应用测序的方法确定基因的全长。 2. 应用启动子、终止子和内含子保守序列确定基因可能结构。 3. 获得全长cDNA，用BLAST软件，比较基因全长序列和cDNA全长序列。,第三章 基因组基因的结构,如何确定一段DNA中存在外显子？ 外显子截留法（exon trapping） 包含强起启动子的载体（vector），只含一个内含子及被它分隔的2个外显子。转染细胞后，其转录产生了大量包含2个外显子的RNA。在其内含子中存在一个限制性酶切位点，可以在此插入外源基因片段。如果外源基因片段不含外显子，则它的存在不会影响RNA的拼接方式。但若外源基因包含一个外显子，外源外显子序列就被插入到了载体两个外显子中间。,第三章 基因组基因的结构,A special splicing vector is used for exon trapping. If an exon is present in the genomic fragment, its sequence will be recovered in the cytoplasmic RNA, but if the genomic fragment consists solely of an intron,第三章 基因组基因的结构,外显子一般比较短小,第三章 基因组基因的结构,外显子数目变化较大,第三章 基因组基因的结构,一个基因可控制多个产物的产生。 1. 基因存在选择起始密码,第三章 基因组基因的结构,2. 基因存在不同的剪切方式,第三章 基因组基因的结构,每一个外显子均有其特殊的功能,The LDL receptor gene consists of 18 exons, some of which are related to EGF precursor and some to the C9 blood complement gene. Triangles mark the positions of introns. Only some of the introns in the region related to EGF precursor are identical in position to those in the EGF gene.,第三章 基因组基因的结构,相近物种的外显子相近 外显子保守而内含子可变 外显子一般比较短小 外显子数目变化较大 一个基因可控制多个产物的产生 每一个外显子均有其特殊的功能,第三章 基因组基因研究的相关技术,PCR技术 一、原理 动画 模板DNA的变性 模板DNA与引物的退火(复性) 引物的延伸,第三章 基因组基因研究的相关技术,二、注意事项 引物设计： 长度一般为1824bp；3末端一般为T、G、C；GC含量一般在4075%之间；特异性。 DNA聚合酶选择： Taq DNA聚合酶：具有热稳定性，在95C中，半衰期为40min。具有53 外切酶活性，但无35外切酶活性，因此纠错能力差。 Vent DNA聚合酶：可在97.5 C中，半衰期为130min，产物长度可达1013kb。 Pfu DNA聚合酶：具有53 外切酶活性和35外切酶活性，纠错能力强。可在97.5 C中，半衰期为3h。,第三章 基因组基因研究的相关技术,引物设计程序： 1.网站Genome Center Soft Ware目录下WWWPrimer Picking（Primer3） 2./medcenter/primer/primer.cgi the primer generator 3./primers/javascript/ Primers,第三章 基因组基因研究的相关技术,三、 PCR技术的类型 1. 逆转录PCR 将RNA反转录和PCR结合而建立起来的一种PCR技术。其包括两个过程：通过逆转录合成cDNA和对之进行PCR扩增。其中，用于逆转录的RNA模板要求完整，并不含DNA和蛋白质等杂质。逆转录PCR可以检测低于10个拷贝的特异RNA。 2. 套式PCR 又称巢式PCR，是对靶DNA片段设计两套引物系统，第1套引物扩增1530个循环,再用扩增的DNA片段内设定的第2套引物扩增1530个循环,可使目的DNA序列得到高效扩增。 套式引物PCR可减少引物的非特异性扩增,增加特异性扩增,减少PCR的误诊率。,第三章 基因组基因研究的相关技术,3.甲基化PCR 甲基化PCR与常规PCR在原理上一致，但在引物的设计以及DNA样本的处理上有所不同。双链DNA 变性解链后,在亚硫酸氢钠作用下发生C U 转化, C 若已有甲基化则无此改变; 甲基化修饰只发生于53方向C-G相联结构的C 上,因此在亚硫酸氢钠作用后, DNA CpG岛若无甲基化,则序列中的改变为C U, CGUG,若有甲基化则为C C ,CGCG。然后设计针对甲基化和非甲基化序列的引物并进行PCR扩增，最后通过凝胶电泳分析，确定与引物互补的DNA序列的甲基化状态。,第三章 基因组基因研究的相关技术,4.多重引物PCR 多重引物PCR是在同一扩增体系加入多对引物，同时扩增多个基因片段的PCR技术。其技术的优点是通过一次扩增可诊断几种疾病或同一疾病的几个不同的基因突变。多重PCR必须遵循以下3个条件: (1)设定保证所有片段都能扩增的反应条件； (2)设计尽量减少非特异性扩增的引物； (3)扩增产物片段大小须有利于分析。,第三章 基因组基因研究的相关技术,5. 随机引物PCR 多态DNA的随机扩增(random amplication of polymorphic DNA，RAPD)或随机引物PCR (arbi-trarily primed PCR，AP PCR)是应用基因组DNA中单一、随机序列的短引物，通过PCR扩增产生一组代表种或株特性的DNA片段。因此，RAPD是获得种或株的DNA分子指纹图谱的通用方法。RAPD优点在于无须知道目的DNA片段的任何信息，仅应用一条随机序列的引物和不严格的PCR条件，对它方便、敏感,应用范围非常广。用不同引物和种株做系列类似实验获得遗传资料,可用于作分类学研究的树状图。特殊条带可作为某一生物体的种属标记，并符合孟德尔遗传特征。,第三章 基因组基因研究的相关技术,6. 原位PCR 原位PCR技术(in situ PCR)是将检测细胞内特定基因的原位杂交技术和聚合酶链式反应(PCR)法相结合的方法。它是扩增组织切片或细胞内微量的基因，并将其检测出来的技术。检测mRNA时，首先将其逆转录为cDNA，并将PCR相关的引物、底物以及反应体系滴于组织切片上，置于原位PCR仪中进行扩增。扩增产物可以利用特异探针进行杂交检测。in situ PCR的步骤包括: 组织前处理；逆转录；PCR；利用原位杂交技术检测。,第三章 基因组基因研究的相关技术,7. 荧光定量PCR 荧光定量PCR（real time PCR, RT-PCR）是一种新的核酸定量测定技术，该技术将荧光能量传递（fluorescence resonance energy tranfer, FRET）技术应用于常规PCR中，对样品进行定量测定。FRET技术的原理是通过供体与受体发色团之间相互作用，能量由供体向受体转移，因此，RT-PCR需要荧光探针参与。用于RT-PCR的探针可分为四类：Taqman、分子信标（molecular beacon）、SYBRGreen I和FRET探针。 荧光定量PCR不仅可以测定靶DNA的含量，用于临床诊断，而且应用不同的探针检测基因突变和SNP分析。,第三章 基因组基因研究的相关技术,光学原理图,第三章 基因组基因研究的相关技术,定量原理,Rn (荧光信号),循环数Cycle Number,线性增长期,指数增长期,平台期,Rn (荧光信号),循环数Cycle Number,线性增长期,指数增长期,平台期,第三章 基因组基因研究的相关技术,Rn (荧光信号),循环数Cycle Number,域值Threshold,Ct,扩增曲线：域值和Ct值,第三章 基因组基因研究的相关技术,Ct,起始拷贝数或起始浓度,标准曲线,第三章 基因组基因研究的相关技术,Taqman探针是在与靶基因特异结合的寡聚核苷酸序列探针3和5端分别存在淬灭分子和荧光分子。在分子完整时，3端受体淬灭分子能够吸收5端供体荧光分子的荧光。当PCR进行时，DNA复性过程中探针特异结合到DNA靶位点，并在Taq酶5外切酶的作用下，将探针降解，两个淬灭分子与荧光分子分离，导致5端荧光分子荧光释放。荧光强度可以反映样品中模板的多少。,第三章 基因组基因研究的相关技术,第三章 基因组基因研究的相关技术,分子信标探针(Molecular Beacons）也是由一段与靶基因特异结合的寡聚核苷酸序列组成，在探针的5和3端分别标记荧光分子和淬灭分子。与Taqman探针不同之处在于其具有类似发卡的颈环结构。在环部设计成与DNA序列结合的序列，而颈部设计成相互互补的序列，使5端荧光分子与3端淬灭分子接近，导致荧光淬灭。当探针与靶序列结合时，发卡结构打开，荧光释放。且荧光强度随扩增产物的增加而增强。,第三章 基因组基因研究的相关技术,第三章 基因组基因研究的相关技术,SYBRGreen 是一种dsDNA的内插化学染料，在未插入双链DNA时发出很弱的荧光，一旦嵌入到双链DNA中，并发出强烈荧光，其荧光强度与DNA含量成正比。,第三章 基因组基因研究的相关技术,FRET探针是为双探针系统，一个为5端标记能发出微弱荧光的荧光探针，另一个为3端标记接收荧光的分子，将两个探针的结合位点设计非常靠近，当探针未与模板杂交时，带有标记的5端和3端相距较远，共振能量传递交低；当探针与模板杂交后，两个标记分子靠近，3端分子接收到5端传递的共振能量，荧光信号增强。,第三章 基因组基因研究的相关技术,SNP检测,AACCTGCATAATGCCAG AACCTGCAGAATGCCAG,单点核苷酸多态性Single Nucleotide Polymorphisms,第三章 基因组基因研究的相关技术,淬灭基团:TAMRA或MGB/NFQ,5核酸酶SNP试验,第三章 基因组基因研究的相关技术,FAM=等位基因II纯合子 VIC=等位基因I纯合子 FAM+VIC=等位基因I、II杂合子,PCR后鉴定,第三章 基因组基因研究的相关技术,等位基因鉴定(SNP检测)结果,第三章 基因组基因研究的相关技术,第三章 基因组基因研究的相关技术,第三章 基因组基因研究的相关技术,8. 重组PCR（recombinant PCR） 突变体的构建,第三章 基因组基因研究的相关技术,第三章 基因组基因研究的相关技术,重组体构建,第三章 基因组基因诊断,一、基因诊断的基本方法 1.直接检测法：PCR、斑点杂交 2.连锁分析法：PCR-RFLP、PCR-ASO 3.突变分析法：PCR-SSCP 4.基因测序,第三章 基因组基因诊断,二、应用 1. 直接分析法：用于已知突变点和存在缺失的基因突变。,Mst酶切位点(GCTNAGG),5,3,正常基因,突变基因,1.15kb,1.35kb,第三章 基因组基因诊断,0.2kb,1.15kb,1.35kb,正常人,突变携带着,患者,第三章 基因组基因诊断,第三章 基因组基因诊断,2.限制性片段长度多态性（RFLP）连锁分析法 原理,第三章 基因组基因诊断,例2.血友病家系,第三章 基因组基因诊断,例1. 苯病酮尿症PAH基因的诊断,第三章 基因组基因诊断,例3. 苯丙酮尿症,例 4.苯丙酮尿症,第三章 基因组基因诊断,遗传标记用于基因诊断连锁分析的注意事项： 遗传家系 遗传标记不能为纯合子 遗传方式,第三章 基因组基因诊断,3. 斑点杂交法,第三章 基因组基因诊断,4. PCR,第三章 基因组基因诊断,5.突变检测：PCR-SSCP,PCR/单链构象多态性分析 (single strand conformation polymorphism, SSCP) PCR产物变性后，经聚丙烯酰胺凝胶电泳，正常基因和变异基因的迁移位置不同，借此可分析确定致病基因的存在。,第三章 基因组基因诊断,第三章 基因组基因诊断,6. 测序,CCGTACTCTGAGTAGCGAT,第三章 基因组基因诊断遗传病研究范例,一、系谱获得及其分析,第三章 基因组基因诊断遗传病研究范例,二、临床资料获得,病史调查 20岁后，诱因为电话或闹钟声响惊醒后或情绪激动; 服用倍它乐克50mg/日和避免声音刺激觉醒晕厥发作减少 ; 家系中2人猝死。 临床分析,第三章 基因组基因诊断遗传病研究范例,三、研究资料查询,第三章 基因组基因诊断遗传病研究范例,第三章 基因组基因诊断遗传病研究范例,四、连锁分析,分离外周血淋巴细胞,酚氯仿-异戊醇法提取基因组DNA,选择位于KCNQ1、HERG和SCN5A基因内 或临近的9个STR位点,PCR扩增5个家系的9个STR位点,变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,硝酸银染色,将凝胶图像扫描储存于计算机中,第三章 基因组基因诊断遗传病研究范例,6个STR位点等位片段检出数目,第三章 基因组基因诊断遗传病研究范例,第三章 基因组基因诊断遗传病研究范例,扩增KCNH2基因的exon及与intron的交接部分,聚丙烯酰胺凝胶电泳,PCR产物的回收和纯化,直接测序,特异性片段的克隆 （特异性片段与载体的连接 ；感受态细胞制备 ；琼脂平板的制备；克隆载体pMD18-T的扩增和提取纯化 ）,克隆基因序列分析,GeneBank提供的KCNH2mRNA4081bP序列（NM-U04270）进行对比分析,与GeneBank（LocusLink entry for KCNH2