《基因芯片技术》PPT课件.ppt

第五节,基因芯片技术及其应用,五十年代DNA分子结构和半保留复制模型的建立， 六十年代基因编码的确定， 七十年代限定性内切酶的发现和DNA重组技术的建立， 八十年代PCR的发明， 九十年代人类基因组计划的实施。,分子生物学的发展推动了基因的研究,1 基因芯片的诞生,生物科学正迅速地演变为一门信息科学。 我们正由结构基因组时代迈入功能基因组时代。随着这个功能基因组学问题的提出（后基因组时代，蛋白组学），涌现出许多功能强大的研究方法和研究工具，最突出的就是细胞蛋白质二维凝胶电泳（2-D-gel）（及相应的质谱法测蛋白分子量）和基因芯片（Genechip）技术,美国继开展人类基因组计划以后，于1998年正式启动基因芯片计划，美国国立卫生部、能源部、商业部、司法部、国防部、中央情报局等均参与了此项目。 同时斯坦福大学、麻省理工学院及部分国立实验室如Argonne Oakridge也参与了该项目的研究和开发。 英国剑桥大学、欧亚公司正在从事该领域的研究。 世界大型制药公司尤其对基因芯片技术用于基因多态性、疾病相关性、基因药物开发和合成或天然药物筛选等领域感兴趣，都已建立了或正在建立自己的芯片设备和技术。 目前全世界有几百家基因芯片公司，有多种生物芯片问世，而且这些芯片的特点较以前密度更高，检测方法更精确，特异性更强的特点。而主要仍以少数几家公司为主，如Affymetrix、Brax、Hysep等。 国内目前主要如清华大学（程京）、中科院生命科学院、上海复旦大学、北京军事医学科学院、南京东南大学、西安等四十余家公司，而且可能还有一大批公司相继成立。,基因芯片是信息时代的产物,横跨： 生命科学、 物理学、 计算机科学、微电子技术 光电技术、 材料科学 等现代高科技,2. 什么是基因芯片,生物芯片，将大量生物识别分子按预先设置的排列固定于一种载体（如硅片、玻片及高聚物载体等）表面，利用生物分子的特意性亲和反应，如核酸杂交反应，抗原抗体反应等来分子各种生物分子存在的量的一种技术。 基因芯片（gene chip），又称DNA微阵列（microarray），是由大量DNA或寡核苷酸探针密集排列所形成的探针阵列，其工作的基本原理是通过杂交检测信息。,生物芯片包括基因芯片、蛋白质芯片、组织芯片。 而基因芯片中，最成功的是DNA芯片，即将无数预先设计好的寡核苷酸或cDNA在芯片上做成点阵，与样品中同源核酸分子杂交的芯片。,生物芯片的分类,生物芯片的分类,根据用途还可以把生物芯片分为两类：信息生物芯片（information-biochip）和功能生物芯片（function-biochip）。,根据探针的类型和长度，基因芯片可分为两类。 其中一类是较长的DNA探针（100mer）芯片 这类芯片的探针往往是PCR的产物，通过点样方法将探针固定在芯片上，主要用于RNA的表达分析。 另一类是短的寡核苷酸探针芯片 其探针长度为25 mer左右，一般通过在片（原位）合成方法得到，这类芯片既可用于RNA的表达监控，也可以用于核酸序列分析。,基因芯片,元件型微阵列芯片 生物电子芯片 凝胶元件微阵列芯片 药物控释芯片 通道型微阵列芯片 毛细管电泳芯片 PCR扩增芯片 集成DNA分析芯片 毛细管电层析芯片 生物传感芯片 光学纤维阵列芯片 白光干涉谱传感芯片,基因芯片的类型,一般基因芯片按其材质和功能，基本可分为以下几类,小鼠基因表达谱芯片(MGEC) 目前国内基因芯片常见品种.(上海博星公司),癌症相关基因表达谱芯片(CRGEC) 目前国内基因芯片常见品种.(上海博星公司),人类基因表达谱芯片(HGEC) 目前国内基因芯片常见品种.(上海博星公司),6400点的基因芯片 （面积 12X14 mm),核酸杂交技术 是基因芯片应用的基础。,3. 基因芯片的原理,基因芯片的基本原理,任何线状的单链DNA或RNA序列均可被分解为一个序列固定、错落而重叠的寡核苷酸，又称亚序列（subsequence）。例如可把寡核苷酸序列TTAGCTCATATG分解成5个8 nt亚序列：,这5个亚序列依次错开一个碱基而重叠7个碱基。 亚序列中A、T、C、G 4个碱基自由组合而形成的所有可能的序列共有65536种。 假如只考虑完全互补的杂交，那么48个8 nt亚序列探针中，仅有上述5个能同靶DNA杂交。 可以用人工合成的已知序列的所有可能的n体寡核苷酸探针与一个未知的荧光标记DNA/RNA序列杂交，通过对杂交荧光信号检测，检出所有能与靶DNA杂交的寡核苷酸，从而推出靶DNA中的所有8 nt亚序列，最后由计算机对大量荧光信号的谱型（pattern）数据进行分析，重构靶DNA 的互补寡核苷酸序列。,原理 - 通过杂交检测信息,一组寡核苷酸探针,TATGCAATCTAG,CGTTAGAT,ACGTTAGA,ATACGTTAGATC,TACGTTAG,由杂交位置确定的一组,核酸探针序列,GTTAGATC,杂交探针组,TATGCAATCTAG,重组的互补序列,靶序列,TACGTTAG,ACGTTAGA,ATACGTTA,CGTTAGAT,GTTAGATC,ATACGTTA,基因芯片,荧光标记的样品,共聚焦显微镜,获取荧光图象,杂交结果分析,探 针 设 计,杂交,4. 基因芯片设计,一、基因芯片设计的一般性原则 基因芯片设计主要包括两个方面: 探针的设计 指如何选择芯片上的探针 探针在芯片上的布局 指如何将探针排布在芯片上。,确定芯片所要检测的目标对象 查询生物分子数据库 取得相应的DNA序列数据 序列对比分析 找出特征序列，作为芯片设计的参照序列。 数据库搜索 得到关于序列突变的信息及其它信息。,在进行探针设计和布局时必须考虑以下几个方面： (1)互补性 (2)敏感性和特异性 (3)容错性 (4)可靠性 (5)可控性 (6)可读性,、DNA变异检测型芯片与基因表达型芯片的设计,对于DNA序列变异分析，最基本的要求是能够检测出发生变异的位置，进一步的要求是能够发现发生了什么样的变化。 从杂交的单碱基错配辨别能力来看，当错配出现在探针中心时，辨别能力强，而当错配出现在探针两端时，辨别能力非常弱。所以，在设计检测DNA序列变异的探针时，检测变化点应该对应于探针的中心，以得到最大的分辨率。,、cDNA芯片与寡核苷酸芯片的设计,cDNA芯片设计的关键在于数据库的建立和数据库信息的利用以及各种文库的建立。 cDNA芯片制备方法一般采用点样法，多用于基因表达的监控和分析。 寡核苷酸芯片制备一般采用在片合成方法。优化是寡核苷酸芯片设计的一个重要环节，包括探针的优化和整个芯片设计结果的优化。,、寡核苷酸探针的优化设计,基因芯片布局,杂 交 模 式,探 针 布 局 图,Target T C C G T T A G C T G A C T G C,AGCT,TG变异,基因芯片使用步骤,芯片制作,把探针固定于载体表面,样品处理,目标分子富集,分子间的杂交,结果检测与数据分析,基因芯片的制作方式,原位合成,直接点样,原位光蚀刻合成,原位喷印合成,分子印章法,针式点样,喷墨点样,光导原位合成法,1、原位光蚀刻合成,寡聚核苷酸原位光蚀刻合成技术是由Affymetrix公司开发的，采用的技术原理是在合成碱基单体的5羟基末端连上一个光敏保护基。合成的第一步是利用光照射使羟基端脱保护，然后一个5端保护的核苷酸单体连接上去，这个过程反复进行直至合成完毕。使用多种掩盖物能以更少的合成步骤生产出高密度的阵列，在合成循环中探针数目呈指数增长。某一含n个核苷酸的寡聚核苷酸，通过4n个化学步骤能合成出4n个可能结构。例如：一个完整的十核苷酸通过32个化学步骤，8个小时可能合成65,536个探针。,目前美国Affymetrix公司已有同时检测6,500个已知人类基因的DNA芯片，并且正在制备含500,000-1,000,000个寡核苷酸探针的人类基因检测芯片。该公司每月投入基因芯片研究的经费约100万美元。该产品不仅可用于基因表达分析和基因诊断等，而且在大规模药物开发方面也具有诱人的前景。 目前，用于分子诊断的DNA芯片不仅已可用于检测爱滋病病毒基因还可用于囊性纤维化（CF）、乳腺癌、卵巢癌等疾病相关基因的基因诊断。 鉴于光刻设备技术复杂，只能有专业化公司生产，加之成本高及合成效率不高的问题，因此有待进行以下研究：对光刻技术进行改进，提高合成效率；开发新的原位合成技术，如喷印合成技术，该技术既能进行原位合成又能进行非原位合成。,2、光导原位合成法,是在经过处理的载玻片表面铺上一层连接分子（linker），其羟基上加有光敏保护基团，可用光照除去，用特制的光刻掩膜（photolithographic mask）保护不需要合成的部位，而暴露合成部位，在光作用下去除羟基上的保护基团，游离羟基，利用化学反应加上第一个核苷酸，所加核苷酸种类及在芯片上的部位预先设定，所引入的核苷酸带有光敏保护基团，以便下一步合成。然后按上述方法在其它位点加上另外三种核苷酸完成第一位核苷酸的合成，因而N个核苷酸长的芯片需要4N个步骤。每一个独特序列的探针称为一个“feature”，这样的芯片便具有4N个“feature”，包含了全部长度为N的核苷酸序列。 这种原位直接合成的方法无须制备处理克隆和PCR产物，但是每轮反应所需设计的光栅则是主要的经费消耗。运用这种方法制作的芯片密度可高达106探针/平方厘米，即探针间隔为 510m，但只能制作II型 DNA芯片。,3、原位喷印合成,芯片原位喷印合成原理与喷墨打印类似，不过芯片喷印头和墨盒有多个，墨盒中装的是四种碱基等液体而不是碳粉。喷印头可在整个芯片上移动并根据芯片上不同位点探针的序列需要将特定的碱基喷印在芯片上特定位置。该技术采用的化学原理与传统的DNA固相合成一致，因此不特殊制备的化学试剂。,4、点样法,点样法是将合成好的探针、cDNA或基因组DNA通过特定的高速点样机器人直接点在芯片上。点样分子可以是核酸也可以是寡核酸。 采用人工点样的方法将寡核苷酸分子点样于化学处理后的载玻片上，经一定的化学方法处理非干燥后，寡核苷酸分子即固定于载玻片上，制备好的DNA芯片可置于缓冲液中保存。 用多聚赖氨酸包被固相支待物玻片，经过分区后用计算机控制的微阵列点样机按照预先设计顺序点上核酸分子，点样量很小，约为5nl。大规模CDNA芯片多采用这种方法，与其寡核苷酸微芯片相比。DNA芯片的潜在优越性是具有更强的亲和势和特异性杂交，但是需要大量制备，纯化，量化，分类PCR产物。,玻璃片基的处理：使玻璃表面获得羟基、醛基、氨基等活性基团。 点样针沾取探针溶液。 点样针把探针点到玻片表面，让探针末端的化学集团与玻片表面的集团形成共价键。 针式点样的优缺点 优点：成本低，操作简单，密度高（几千-几十万点/cm2)， 转移过程中探针溶液损失小。 缺点：定量准确性、重现性不好,针式点样,生产商 Bio-Rad 性能介绍 分辨率：1.25um(x，y轴)和0.25um(Z轴) ， 重复性：3um 球面精确性：l0um。 一次制成芯片数：126块芯片 每块玻片点样量82,000个点,2202芯片点样仪,喷墨点样的方式类似于喷墨打印机。将合成用探针溶液放入打印墨盒内，由电脑依据预定的程序在xyz方向自动控制打印喷头在芯片支持物上移动，并根据芯片不同位点探针序列需要将特定的探针试剂（不足纳升）喷印到特定位点。喷印上去的试剂即以固相合成原理与该处支持物发生偶联反应。,喷墨点样,分子印章法,根据阵列合成的要求设计并制作表面凹凸不平的分子印章，再按照合成的顺序，将寡核苷酸合成试剂涂布在不同的印章上，逐个依次压印到芯片特定位点进行合成反应。合成的后续反应与压电打印类似。 分子印章法不仅可用于制备原位合成芯片，还可用于DNA微集阵列的制作。,DNA芯片进行实验包括5个过程,生物学问题的提出和芯片设计； 样品制备； 生物杂交反应； 结果探测； 数据处理和建模。,1样品制备。,一般所需mRNA的量是以一张表达谱芯片需要3g mRNA计算的,2 样本采集过程关键点,氰代磷酸二乙酯(DEPC),离体新鲜组织，切成多个1cm3小块，剔除结缔组织和脂肪组织。胃、肠组织应剪除外膜；肝、肾、脾应剪除门部血管神经，肿瘤组织应将周围的正常组织切除干净（正常组织也应将周围的肿瘤组织切除干净）。 在RNase-Free 0.9生理盐水中漂洗样品，以去除血渍和污物。 用铝箔包裹组织，或用5ml冻存管装载组织(但最好统一采用铝箔)。用记号笔在铝箔或冻存管外表写明样品编号，并贴上标签，迅速投入液氮冷却。 填写样品登记表，写明样品名称、种类、编号、取样日期、样品处理情况等将液氮冷却的组织放入样品袋（每个样品袋只保存同样的组织），袋口留一根编号绳，绳上粘一张标签纸（标签上注明：样品名称、编号、日期），迅速转入便携式液氮罐 保留1-2张取材部位的病理切片。,以上步骤应在冰上进行且不超过15分钟，超过时间会导致样品的RNA降解。 对肿瘤组织的取材，要求尽可能准确地判定肿瘤和正常组织，例如对于手术切除的整个或部分前列腺，可能要根据冰冻切片报告的结果来判定要进行研究的取材部位。,待分析基因在与芯片结合探针杂交之前必需进行分离、扩增及标记。根据样品来源、基因含量及检测方法和分析目的不同，采用的基因分离、扩增及标记方法各异。当然，常规的基因分离、扩增及标记技术完全可以采用，但操作繁琐且费时。 高度集成的微型样品处理系统如细胞分离芯片及基因扩增芯片等是实现上述目的的有效手段和发展方向。 为了获得基因的杂交信号必须对目的基因进行标记，目前采用的最普遍的荧光标记方法与传统方法如体外转录、PCR、逆转录等原理上并无多大差异，只是采用的荧光素种类更多，这可以满足不同来源样品的平行分析。 用计算机控制的高分辨荧光扫描仪可获得结合于芯片上目的基因的荧光信号，通过计算机处理即可给出目的基因的结构或表达信息。,杂交条件的选择与研究目的有关，多态性分析或者基因测序时，每个核苷酸或突变位点都必须检测出来。 通常设计出一套四种寡聚核苷酸，在靶序列上跨越每个位点，只在中央位点碱基有所不同，根据每套探针在某一特点位点的杂交严谨程度，即可测定出该碱基的种类。 如果芯片仅用于检测基因表达，只需设计出针对基因中的特定区域的几套寡聚核苷酸即可。 表达检测需要长的杂交时间，更高的严谨性，更高的样品浓度和低温度，这有利于增加检测的特异性和低拷贝基因检测的灵敏度。突变检测，要鉴别出单碱基错配，需要更高的杂交严谨性和更短的时间。,杂交信号的检测是DNA芯片技术中的重要组成部分。 由于DNA芯片本身的结构及性质，需要确定杂交信号在芯片上的位置，尤其是大规模DNA芯片由于其面积小，密度大，点样量很少，所以杂交信号较弱，需要使用光电倍增管或冷却的电荷偶连照相机(charged-coupled device camera，CCD)摄像机等弱光信号探测装置。 此外，大多数DNA芯片杂交信号谱型除了分布位点以外还需要确定每一点上的信号强度，以确定是完全杂交还是不完全杂交，因而探测方法的灵敏度及线性响应也是非常重要的。 杂交信号探测系统主要包括杂交信号产生、信号收集及传输和信号处理及成像三个部分组成。,1荧光标记杂交信号的检测方法 2生物素标记方法中的杂交信号探测,1荧光标记杂交信号的检测方法,（1）激光扫描荧光显微镜 探测装置比较典型。方法是将杂交后的芯片经处理后固定在计算机控制的二维传动平台上，并将一物镜置于其上方，由氩离子激光器产生激发光经滤波后通过物镜聚焦到芯片表面，激发荧光标记物产生荧光，光斑半径约为510m。同时通过同一物镜收集荧光信号经另一滤波片滤波后，由冷却的光电倍增管探测，经模数转换板转换为数字信号。通过计算机控制传动平台XY方向上步进平移，DNA芯片被逐点照射，所采集荧光信号构成杂交信号谱型，送计算机分析处理，最后形成20m象素的图像。这种方法分辨率高、图像质量较好，适用于各种主要类型的DNA芯片及大规模DNA芯片杂交信号检测，广泛应用于基因表达、基因诊断等方面研究。,(2)激光扫描共焦显微镜,激光扫描共焦显微镜与激光扫描荧光显微镜结构非常相似，但是由于采用了共焦技术因而更具优越性。这种方法可以在荧光标记分子与DNA芯片杂交的同时进行杂交信号的探测，而无须清洗掉未杂交分子，从而简化了操作步骤大大提高了工作效率。通过计算机控制激光束或样品池的移动，便可实现对芯片的二维扫描，移动步长与芯片上寡核苷酸的间距匹配，在几分钟至几十分钟内即可获得荧光标记杂交信号图谱。其特点是灵敏度和分辨率较高，扫描时间长，比较适合研究用。现在 Affymetrix公司已推出商业化样机，整套系统约 12万美元。,（3）采用了CCD相机的荧光显微镜,这种探测装置与以上的扫描方法都是基于荧光显微镜，但是以CCD相机作为信号接收器而不是光电倍增管，因而无须扫描传动平台。由于采用了CCD相机，因而大大提高了获取荧光图像的速度，曝光时间可缩短至零点几秒至十几秒。其特点是扫描时间短，灵敏度和分辨率较低，比较适合临床诊断用,（4）光纤传感器,将 DNA芯片直接做在光纤维束的切面上（远端），光纤维束的另一端（近端）经特制的耦合装置耦合到荧光显微镜中。光纤维束由7根单模光纤组成。每根光纤的直径为200m，两端均经化学方法抛光清洁。化学方法合成的寡核苷酸探针共价结合于每根光纤的远端组成寡核苷酸阵列。将光纤远端浸入到荧光标记的靶分子溶液中与靶分子杂交，通过光纤维束传导来自荧光显微镜的激光（490urn），激发荧光标记物产生荧光，仍用光纤维束传导荧光信号返回到荧光显微镜，由CCD相机接收。 这种方法快速、便捷，可实时检测DNA微阵列杂交情况而且具有较高的灵敏度，但由于光纤维束所含光纤数目有限，因而不便于制备大规模DNA芯片，有一定的应用局限性。,2生物素标记方法中的杂交信号探测,以生物素（biotin）标记样品的方法由来已久，通常都要联合使用其它大分子与抗生物素的结合物（如结合化学发光底物酶、荧光素等），再利用所结合大分子的特殊性质得到最初的杂交信号，由于所选用的与抗生物素结合的分子种类繁多，因而检测方法也更趋多样化。特别是如果采用尼龙膜作为固相支持物，直接以荧光标记的探针用于DNA芯片杂交将受到很大的限制，因为在尼龙膜上荧光标记信号信噪比较低。因而使用尼龙膜作为固相支持物的这些研究者大多是采用生物素标记的。 目前应用较多的是美国General Scanning公司开发的基因芯片专用检测系统(ScanArray 3000)，采用激光共聚焦扫描原理进行荧光信号采集，由计算机处理荧光信号，并对每个点的荧光强度数字化后进行分析。近期又开发出了ScanArray 5000，其扫描精度和功能有较大的提高。,9.结果的分析,样品在被测定前，首先要经过消化，使待测组织细胞中的DNA或RNA释放出来，在经过适当的扩增后，以荧光标记物标记，放入基因芯片自动孵育装置中，由其自动控制反应的时间、温度以及缓冲液的配比等反应条件，进行杂交。 杂交完成后，要对基因芯片进行“读片”，即应用激光共聚焦荧光扫描显微镜，对基因芯片表面的每个位点进行检测。 检测结合到芯片表面位点的样品片断的荧光标记，而待测样品中未与芯片上探针结合的荧光标记物，则悬浮于溶液中，由于不在聚焦平面上，因而不被检测。 样品与探针的错配是影响杂交反应结果的重要因素，但由于样品与芯片上的探针正确配对时产生的荧光信号要比错配时强的多，因此，通过对信号强度的分析，就可以区分正确与错误的配对。,为了使结果的检验更加简便和快速，Affymetrix的基因芯片的分析系统中采用了基因阵列扫描仪和专用的基因芯片工作站，对一幅包含数万个探针位点的基因芯片图样的分析，仅需要数分钟的时间。这样在短短的几十分钟至数小时内，就可以完成用传统方法需要数月才能完成的几万乃至几十万次杂交分析试验。,10.基因芯片的应用,基因芯片具有 巨大的应用前景 1. 基因功能分析研究 2. 检测与疾病相关的基因, 进而用于疾病诊断 3. 药物筛选, 4. 检测基因突变 5. 其他(环境化学毒物的筛选 体质医学的研究 ),基因功能分析研究,将成千上万个我们克隆到的特异性靶基因固定在一块芯片上，对来源于不同个体不同组织不同细胞周期不同发育阶段不同分化阶段不同病变不同刺激（包括不同诱导不同治疗手段）下细胞内的mRNA或逆转录所得的cDNA进行检测，从而对这些基因表达的个体特异性组织特异性发育阶段特异性分化阶段特异性。进行综合评定与判断，极大加快这些基因功能的确立。,检测与疾病相关的基因, 进而用于疾病诊断,目前主要涉及： 癌症、 心血管疾病、 血液病、 遗传性疾病、 神经系统疾病、 部分感染性疾病、 免疫反应相关性疾病 毒物引起的损伤等。,Golub et al, Science , 286 (5439): 531, Oct 15, 1999,用基因芯片研究PMA激活的内皮细胞的早期应答基因,药物筛选,在基因功能研究基础上，特别是确立了与某些疾病相关基因的表达变化情况后，就可针对疾病发生机理进行药物筛选工作。将这些基因特异性片段固定在芯片上，研究病变组织和正常组只在某些药物刺激下这些基因表达的变化，可快速判断药物作用的效果，并进行高通量筛选（high throughout screening），可使新药开发获得技术上的突破。,Evanse and Relling Science , 286 (5439): 487, Oct 15,1999,基因芯片可以帮助 中医药走向世界,研究天然药物对人体的作用机制 筛选对人体有生物效应的单味天然药物 筛选对人体有生物效应的有效成分 筛选对人体有生物效应的天然药物配方,1中药的研究。尤其中药中众多成分中有效成分的筛选、有效药物的筛选、中药毒理学过程均被大大简化，将推动中药的迅猛发展。中药学引入基因芯片技术，将大大推动中药研究的国际化进程，为阐明中药作用机理，具有无可估量的重要意义。,11. 基因芯片的发展方向,进一步提高探针阵列的集成度，如有多家公司的芯片阵列的集成度已达1.0105左右，这样基因数量在1.0105以下的生物体（大多数生物体）的基因表达情况只用一块芯片即可包括。 提高检测的灵敏度和特异性。如检测系统的优化组合和采用高灵敏度的