导向性人干扰素α2a工程菌的高密度发酵.doc

导向性人干扰素2a工程菌的高密度发酵 作者：孟洁如，颜真，赵宁，张英起 【关键词】 大肠杆菌 【Abstract】 AIM: To optimize the pilotscale fermentation procedure of E.coli producing tumor targeted human IFN2a and to obtain high cell density and high level expression of the aim protein. METHODS: The effects of the rang of pH, dissolved oxygen, culture time, induction time and the manner of feeding were analyzed with 10 L of fermentation tank. RESULTS: Under the established conditions, we performed a threetime repeated fermentation. The final cell density was A600 nm 25-30 and more than 50 g of wet bacteria per liter could be obtained. The expression level of recombinant protein was higher than 3.2109 U/L. CONCLUSION: The results show that the established fermentation procedure is stable, of short cycle and with high expression, which lays the basis for further purification and largescale production of IFN2aNGR. 【Keywords】 fermentation; IFN; Escherichia.coli 【摘要】 目的：优化大肠杆菌表达导向性人干扰素2a的中试发酵工艺，以获得工程菌的高密度发酵和目的蛋白的高表达. 方法：采用发酵罐发酵，对影响工程菌生长和目的蛋白表达的条件，如pH值、活化时间、诱导时间、溶氧范围及补料流加方式等进行优化. 结果：根据优化条件，连续三批重复发酵10 L工程菌，最终菌体密度均达A600 nm 2530，菌体获得量均可达湿重50 g/L以上，目的蛋白表达量均为3.2109 U/L以上. 结论：此发酵工艺具有周期短、产量高以及重复性稳定性好的特点，为下游纯化和进一步大规模生产奠定基础. 【关键词】 发酵；干扰素；大肠杆菌 干扰素(IFN)是一种生物学活性相当复杂的细胞因子,具有抗病毒活性、免疫调节、抑制细胞增殖、抗肿瘤血管生成以及与多种淋巴因子协同作用等多种生物功能1-3. NGR是通过噬菌体展示技术筛选出的, 可以特异性地与肿瘤新生血管内皮细胞上的CD13分子结合的多肽4. 为了进一步提高IFN2a的抗肿瘤活性，同时降低毒副作用，减少用药量，我中心研制和开发了一种新型导向性人IFN2a,即将IFN2a与NGR基因重组，并表达IFN2aNGR融合蛋白，通过NGR与CD13的结合作用，使IFN2a在肿瘤组织的新生血管处富集，针对性地发挥抗肿瘤和抑制肿瘤血管形成的作用. 动物实验表明, 它比天然基因工程人IFN2a的抗肿瘤作用增强,毒副反应下降5,并具有更广泛的适应证.具有广阔的应用前景.为保证进一步大规模生产,本实验中，我们对工程菌DH5/pBV220IFNN的表达和生长规律进行研究, 建立了一个适用于工业化的高密度、高表达的发酵工艺. 1材料和方法 11材料 111菌种和质粒宿主菌DH5由本中心保存. 重组质粒pBVIFN2aNGR(以下简称IFNN)由本中心构建和保存，在天然IFN2a基因的3端融合一段含有13个氨基酸的NGR编码序列，受PLPR双重启动子控制，在42时能诱导融合蛋白表达. 112培养基LB培养基用于试管种子培养，2YT培养基用于三角摇瓶培养，半合成培养基用于10 L发酵罐中分批补料培养. LB培养基中含有（g/L）：蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10；半合成培养基中含有（g/L）：磷酸盐适量（KH2PO4K2HPO4Na2HPO4・12H2O=247），（NH4）2SO4 1.8, NH4Cl 0.3，蛋白胨4.5, 酵母粉2.25, 甘油适量, 和微量元素（MgSO4・7H2O 0.3）；补料基质中含有（g/L）：甘油适量，酵母粉5，蛋白胨10，MgSO4・7H2O 0.6. 用5 mol/L NaOH溶液，将溶液的pH值全部调为7.0. 培养基和补料在121高压灭菌20 min，各种培养基中都加入氨苄青霉素溶液至100 mg/L. 113仪器NBSML8000发酵罐，美国NBS公司；JL21型冷冻高速离心机为美国Beckman公司产品. 12方法 121发酵用菌种的筛选取一管冷冻保存的甘油菌，用接种环接种于LB平板上，37培养过夜，挑单克隆菌种于含有5 mL LB培养液的试管中，30培养至A600 nm为0.40.6时，升温至42再培养4 h，离心收集菌体，采用WISHVSV系统以细胞病变抑制法检测生物学活性，以活性指标推测表达情况. 将表达量最高的克隆作为发酵用种子，分装冷冻保存，每批发酵取出一管，以保证菌种的稳定性. 122工程菌的培养取一管经筛选出的并冷冻保存的甘油菌，经活化后取1 mL接种于含100 mL LB培养基中30培养8 h，再取1 mL接种于100 mL 2YT培养基中，30生长8 h. 取400 mL接种于10 L发酵罐中，30培养6 h，42诱导培养4 h. pH控制在7.0左右，当pH值低于该值时，用补加氨水来控制；活化温度控制在30；诱导温度控制在42；溶解氧控制饱和度在30%以上，当溶解氧降至该值以下，可通过提高通气量和搅拌速度以提高溶解氧. 整个发酵过程中，通过改变pH值、活化和诱导时间、溶解氧浓度和补料的流加，观察工程菌的生长和目的蛋白的表达. 123结果分析工程菌密度的测定6：752型分光光度计测定600 nm波长A值，测定范围在0.30.7之间. 由于干扰素在原核表达载体中的表达量普遍较低，约为1%2%，对表达产物行SDSPAGE无法辨认新生条带，但是表达产物具有较高的体外杀伤活性，所以，对表达产物的鉴定我们采用国际通用的WISHVSV系统细胞病变法检测其抗病毒活性. 步骤如下：WISH细胞在含抗生素和谷氨酰胺的100 mL/L FSC，pH 7.4的Eagles培养液中37培养. 待细胞呈单层生长后，消化传代继续培养. 将消化的WISH细胞，按1000个细胞/孔接种于96孔板. 37孵箱培养过夜. 换入用含50 mL/L FCS的Eagles液稀释的不同浓度的IFN裂菌上清，继续培养，次日用含20 mL/L FCS的Eagles培养液按11030稀释的VSV病毒培养液，换入细胞培养板，37培养24 h，观察结果，以50%细胞保护的IFN稀释度为IFN效价. 2结果 21pH对工程菌的生长和目的蛋白表达的影响三个罐批控制pH值分别为6.5，7.0和7.5，其他的参数保持一致，结果表明(Tab 1)，pH值控制在7.5时，IFNN的表达量和收菌量都最低；pH值为6.5时表达量与pH值为7.0时相当，但是收菌量低，pH值为7.0时表达量和收菌量均较高.表1不同pH值或溶解氧浓度对工程菌的生长和IFNN表达的影响（略） 22溶解氧浓度对工程菌生长和目的蛋白表达的影响溶解氧浓度是通过改变搅拌速度和通气中的纯氧含量对其进行调整和补偿. 将溶解氧分别固定在40%60%，30%60%，20%60%，结果显示(Tab 1)，20%60%时，收菌量最低，而表达量在3个不同范围内相当，因此，应当将溶解氧维持在30%以上，从而保证工程菌的产量. 23活化时间对工程菌生长和目的蛋白表达的影响工程菌活化不同时间以后，进行相同时间的温度诱导. 结果显示(Tab 2), 活化4 h后，进行温度诱导，收菌量和表达量都最低；活化8 h以后，虽然收菌量最高，但是目的蛋白表达量较低，因此，活化6 h最经济有效. 24诱导时间对工程菌生长和目的蛋白表达的影响经活化6 h以后，对工程菌进行温度诱导，每隔1 h取样，测菌密度A600 nm，同时留样进行活性检测(Tab 2), 结果表明，诱导4 h的收菌量和目的蛋白表达量均较高.表2不同培养时间或活化时间对工程菌的生长和IFNN表达的影响（略） 25补料流加方式对工程菌生长及表达的影响发酵的全过程中不加补料，则由于碳源和氮源的供给不足，而收菌量和表达量均很低；不分批补料为从培养4 h开始，以100 mL/h的速度对补料进行流加，由于活化6 h后，细菌呈指数生长，而不分批的补料供给无法满足加速生长的细菌的需要，所以收菌量和表达量都不高；分批补料流加为：培养4 h开始补料，47 h补料速度为100 mL/h，710 h补料速度为200 mL/h. 这样的补料供给模式既维持了适量的碳源和氮源浓度，又降低了有毒代谢物的积累,最终可获得58.4 g/L的湿菌,其目的蛋白的表达也可达4109 U/L. 26由高密度培养工程菌DH5/pBV220IFNN生产IFNN在以上实验基础上，我们确定了如下的发酵方案：采用半合成培养基，溶氧在30%左右，pH在6.57，接种后30培养6 h，迅速升温至42，再继续诱导培养4 h. 发酵前3 h不加补料，47 h流加速率为100 mL/h，710 h为200 mL/h. 10 h后收获菌体. 发酵的前一阶段细菌的生长速率很高，但随后细菌生长较为缓慢. 细菌最终的密度为A600 nm在2530 (Fig 1)，IFNN的表达量也维持在3.2106以上(Fig 2),每升发酵液最终可含有50 g以上的湿菌，菌体经盐酸胍裂解、离子交换层析和亲和层析纯化后纯度达到95%以上，每升发酵液可得到近12.5 mg纯品，达到临床样品的质量要求. 3讨论 重组大肠杆菌的高密度培养是增加重组蛋白产率的最有效的方法，高密度发酵在增加菌密度的同时提高蛋白的表达量，从而有利于简化下游的纯化操作. 重组大肠杆菌高密度培养受表达系统、培养基、培养方式、发酵条件控制等多种因素的影响7，8，在实际操作中，需要对各种因素进行优化，建立最佳的发酵工艺. 发酵工艺优化的研究可通过每次改变一个因素或同时改变几个参数来进行，然后运用统计学分析寻找它们之间的相互作用，本研究中，我们对单因素逐个优化，最终达到对整个工艺的优化. 我们采用建立的中试发酵工艺，连续发酵三批10L罐发酵工程菌，其结果的稳定性和重复性较好，最终菌体密度均达A600 nm 2530，菌体获得量均达湿质量浓度50 g/L以上，目的蛋白表达量均为3.2109 U/L以上,发酵总时间在10 h左右. 培养基为重组大肠杆菌的生长和合成产物提供了碳源、氮源、无机盐等物质基础9. 其中，碳源的选择至关重要，对于大肠杆菌，高浓度的葡萄糖将造成乙酸盐的堆积，降低工程菌产量和表达量. 因此，选用甘油作为碳源较好. 发酵中另一个重要因素就是外源蛋白最佳的诱导时机10. 诱导后，携带质粒的细胞生长速率显著降低，而不带质粒的细胞则不受影响. 因此，提前诱导使菌体和目的蛋白的产量降低，同时也增加了染菌的机会. 而诱导较晚虽可以获产量高的菌体量，但细胞表达外源蛋白的时间则减少. 补料的流加方式直接影响着发酵的效果. 分批补料培养的特点是，在培养过程中不断补充培养基，使菌体在较长时间里保持稳定的生长速率，从而达到高密度生长. 但是在补料流加过程中，既不能加入得过快，也不能加入得过慢. 过慢则无法满足逐渐增加的菌体生长需要，同时也使培养过程中产生的抑制性副产物大量积累；而过快则使携带目的蛋白的质粒没有充裕的时间复制，降低目的蛋白的表达量；而且快速的细菌生长还易引发质粒的不稳定性. 有报道表明，大肠杆菌通过分批补料发酵，每升培养液最高可得到50 g干菌种，A600 nm可达125左右11. 在我们实验中，严格控制补料流加的速度，在有效提高菌体产量的同时提高目的蛋白表达量. 【参考文献】 1 Eric J, Frank GH. Interferon in oncological practice: Review of interferon biology, clinical applications, and toxicities J. Oncology, 2001; 6: 34-55. 2 孙卫民， 王惠琴. 细胞因子研究方法学M. 北京：人民卫生出版社， 1999：588-592. 3 Pfeffer LM, Dinarello CA, Herberman RB, et al. Biological properties of recombinant alphainterferons: 40th anniversary of the discovery of interferons J. Cancer Res, 1998; 58: 2489-2499. 4 Wadih A, Renata P, Erkki R. Cancer treatment by targeted drug delivery to tumor vasculature in mouse modelJ. Science, 1998; 279(16): 377-380. 5 孟洁如，颜真，赵宁，等. 导向性干扰素2a工程菌生物学特性的稳定性J. 中国生物制品学杂志，2003;16(4):222-224. Meng JR, Yan Z, Zhao N, et al. Stability of biological characteristics of recombinant bacterial strain expressing tumor targeted IFN2aJ. Chin J Biol, 2003; 16(4): 222-224. 6 Makides SC. Strategies for the achieving highlevel expression of genes in Escherichia coliJ. Microbiol Rev, 1996; 60(3): 512-538. 7 Khalilzadeh R, Shojaosadati SA, Bahrami A, et al. Overexpression of recombinant human interferongamma in high cell density fermentation of Escherichia coliJ. Biotechnol Lett, 2003;25(23):1989-1992. 8 Taband