《基因工程载体》PPT课件.ppt

1,4 基因工程载体 载体：这种能与目的基因结合，且有完整的复制和转录功能的DNA大分子称之为载体（vector）。 作为一个理想的载体，应具备以下条件：,（1）能够在宿主细胞中存在并繁殖，有功能良好的复制子和启动子，使插入基因复制和表达； （2）具有多个限制性内切酶的切点，且切点是单一的，这样可将多个外源DNA片段插入其中； （3）具有容易检测的筛选标记； （4）载体DNA的分子量适当，可容纳较大的外源DNA片段，又可在受体细胞内扩增较多的拷贝； （5）在细胞内稳定性高，这样可以使重组体可以稳定传代而不易丢失。,2,载体的种类：,克隆载体（cloning vector）：主要是对目的基因克隆，建立DNA文库和cDNA文库，其上有复制子即可； 表达载体（expression vector）：能使目的基因在宿主细胞中表达的一类载体。这类载体既有复制子，更要有强启动子； 穿梭载体（shuttle vector）：这类载体可以在原核细胞中复制，也可在真核细胞中扩增和表达。,3,一、质粒的一般特性,(一) 质粒的分布、大小、数目 质粒广泛地分布于原核生物细胞中，也存在于某些真核细胞（酵母的2环状质粒）。 质粒DNA分子量范围为1200106Da。 一个细胞内的质粒数量变化也很大，有1至几个的，也有几十个的，甚至有数百个。 （这取决于质粒的复制类型。如果质粒的复制是严紧型的，每个细胞只有1个至几个质拉；如果质粒的复制是松弛型的，每个细胞中质粒有10-200拷贝数。）,4,(二)质粒DNA的构型,三种不同的构型： 当其两条核苷酸链均保持着完整的环形结构时，称之为共价闭合环形DNA(cccDNA)，这样的DNA通常呈现超螺旋的SC构型； 如果两条多核苷酸链中只有一条保持着完整的环形结构，另一条链出现有一至数个缺口时，称之为开环DNA(ocDNA)。 若质粒DNA的双链均发生断裂而形成线形分子，则通称为L构型。,5,共价闭合环形DNA （SC型）,开环DNA （oc型）,线性DNA （L型）,环形双链的质粒DNA分子具有三种不同构型,6,(三)质粒DNA的理化性质,质数DNA具有一般核酸分子的理化特性。 能溶于水，不溶于乙醇等有机溶剂， 在一定pH下可解离而带电荷 能吸收紫外线，可嵌入某些染料，如溴化乙锭。 比较能抗切割和抗变性。,7,(四)质粒DNA的生物学特性,(1)寄生性：质粒只能在宿主的细胞内复制。 (2)稳定性：每种质粒在宿主细胞中保持着一定的拷贝数。 (3)同源性：不同质粒之间可能存在一定的同源区。 (4)重组性：两种不同的质粒处于同一宿主细胞中或者一种质粒处于一种宿主细胞中，有可能发生质粒与质粒之间或质粒与染色体之间的重组。 (5)不相容性：有相同复制始区的不同质粒不能共存于同一宿主细胞中。该不相容性的分子基础主要是由于它们在复制功能之间的相互干扰造成的。,8,(6)传递性：有些质粒在细菌间能够传递，具有传递性的质粒带有一套与传递有关的基因。 (7)消除性：存在于宿主细胞中的质粒，可用某些办法将其去除。 (8)复制类型：严紧型质粒的复制受到宿主细胞蛋白质合成的严格控制，松弛型质粒的复制不受宿主细胞蛋白质合成的严格控制。 (9)表现型：不同的质粒有不同的表型。如对抗生素的抗性等。,9,(五)质粒的命名原则,1976年提出一种质粒命名的原则，用小写字母p代表质粒，在p字母后面用两个大写字母代表发现这一质粒的作者或实验室名称。如pUC118, 字母p代表质粒，UC是构建该质粒的研究人员的姓名，118代表构建的一系列质粒的编号。,10,二、组建理想质粒载体必须具备的条件,(一)质粒拷贝数较高 质粒拷贝数是指生长在标准的培养基条件下，每个细菌细胞中所含有的质粒DNA分子的数目。,11,根据宿主细胞所含的拷贝数多少，可将质粒分成：,严紧型 松弛型,高拷贝数的质粒，每个宿主细胞中可高达10-60份拷贝，这类质粒被称为“松弛型”复制控制的质粒(relaxed plasmid)。,低拷贝数的质粒，每个宿主细胞中仅含有1-3份的拷贝，称这类质粒为“严紧型”复制控制的质粒(stringent plasmid)；,12,(二)分子量较小,低分子量的质粒如下优点,通常拷贝数较高 克隆时所预期的基因表达产物的数量较大 限制酶的切点相应减少，有可能找到合适的单一限制酶切点，便于制作酶切图谱。 外源DNA容量较大， 容易转化，当质粒大于15kb时，将成为转化效率的制约因素。 遗传工程操作时容易拿捏，容易分离，不易断裂。,13,(三)带有可供选择的标记,常采用的标记是对某种抗生素的抗性，如氨卞青霉素抗性(Ampr)、卡那霉素抗性(Kanr)、四环素抗性(Tetr)等，而且希望各抗性基因内有若干单一的限制酶切点。 在克隆时通过单一酶切点插入外源基因，使该抗性基因失活、宿主菌变为对该抗生素敏感的菌株，这样较易检查到克隆是否成功。,14,-半乳糖苷酶筛选系统：,载体上带有一个来自大肠杆菌的lac操纵子的DNA区段，这一区段编码-半乳糖苷酶氨基端的一个蛋白片段。IPTG(异丙基-D-硫代半乳糖苷)可以诱导该片段的合成，而该片段能与宿主细胞所编码的-半乳糖苷酶羧基端的一个蛋白片段互补(-互补)。故暴露于诱导物IPTG的细菌含有编码lacZ的质粒可同时合成该酶的两种片段，该菌在其生色底物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-半乳糖苷)的培养基上生长，将形成蓝色茵落。将一连串克隆位点克隆入-半乳糖苷酶氨基端的基因中，外源DNA插入质粒的多克隆位点后可使-半乳糖苷酶的氨基端片段灭活，从而破坏了-互补作用。因此，带有重组质粒的细菌将产生白色菌落。利用这种筛选方法可方便地将含目的基因的重组子从空载体中筛选出来。,15,lacZ,-半乳糖苷酶,分解半乳糖,i,P,O,调控蛋白P,大肠杆菌的-半乳糖苷酶基因lacZ系统,16,a-互补显色反应（蓝白斑筛选）,lacZ -,-半乳糖苷酶-,分解半乳糖,i,P,O,调控蛋白P,-半乳糖苷酶基因lacZ突变体M15,17,(四)带有尽可能多的单一限制性酶切位点,单一的限制性酶切位点可供外源DNA定点插入； 较多不同的单一限制酿酶切位点，可有选择地供带有不同末端的外源基因插入。目前常用载体上的多克隆位点(MCS)即具有该功能。,18,(五)具有复制起始点(origin, ori),这是质粒自我增殖所必不可少的基本条件，也是决定质粒拷贝数的重要元件可使繁殖后的细胞维持一定数量的质粒拷贝数。 例如含ColE1或pMB1复制起始点的质粒即为松弛型质粒。 在一般情况下，一个质粒只含有一个复制起始点，构成一个独立的复制子。穿梭质粒含有两个复制子，一个是原核生物复制子、另一为真核生物复制子，以确保其在两类细胞中均能得到扩增。,19,三、常用的质粒载体,pSC101质粒载体是第一个成功用于克隆真核DNA的大肠杆菌质粒载体。 pBR322是用人工方法构建的符合理想质粒载体条件的好载体，一度曾得到广泛的应用。,(一)克隆载体,20,1.质粒,重要的大肠杆菌质粒载体,松弛型复制,pBR322：,氯霉素可扩增,拷贝数 50 - 100 / cell,用于基因克隆,21,22,2.pUC质粒载体,(1)来自pBR322质粒的复制起点(ori)； (2)氨卞青霉素抗性基因(Ampr)，但它的DNA核苷酸序列已经发生了变化，不再含有原来的限制酶的单识别位点； (3)大肠杆菌-半乳糖苷酶(lacZ)的启动子及其编码该基因氨基端-肽链的DNA序列,此结构特称为lacZ1基因； (4)多克隆位点(MCS)区段：位于lacZ 基因中的靠近5端，内含十几个单一的限制性内切酶识别切割位点，使含有不同粘端的目的DNA片段可方便地定向插入载体中。但它并不破坏lacZ 基因的功能。,23,pUC18 / 19：,拷贝数 2000 - 3000 / cell,用于基因克隆和测序,装有多克隆位点（MCS）,正选择颜色标记 lacZ,24,pUC18质粒载体,优点: (1)具有更小的分子量 在基础上构建pUC质粒载体时，仅保留下pBR322的氨卞青霉素抗性基因及复制起点，使其分子大小相应地缩小了许多如pUC8为2750bp，pUC18为2686bp。 更高的拷贝数：pBR322质粒的复制起点内部发生了自发的突变，即rop基因的缺失。由于该基因编码的共63个氨基酸组成的Rop蛋白质，是控制质粒复制的特殊因子，因此它的缺失使得pUC8质粒的拷贝数比带有pMBl或ColE1复制起点的质粒载体都要高得多， 平均每个细胞即可达500-700个拷贝。所以由pUC8质粒重组体转化的大肠杆菌细胞，可获得高产量的克隆DNA分子。,25,(2)便于重组子的检测:,pUC18质粒结构中具有来自大肠杆菌lac操纵子的lacZ基因，所编码的-肽链可参与-互补作用。因此，在应用pUC18质粒为载体的重组实验中，可用X-gal显色法一步实现对重组子克隆的鉴定。,26,N端 C端,缺陷型大肠杆菌,完整的-半乳糖苷酶,27,pUC18 / 19：正选择标记 lacZ 的显色原理,pUC18/19,Plac,lacZ,MCS,b-半乳糖苷酶的a-肽段,a,b,5-溴-4-氯-3-吲哚基-b-D-半乳糖苷,X-gal,28,(3)具有多克隆位点(MCS)区段,pUC18质粒载体具有与M13mP8噬菌体载体相同的多克隆位点(MCS)区段，它可以在这两类载体系列之间来回“穿梭”。因此，克隆在MCS当中的外源DNA片段，可以方便地从pUC18质粒载体转移到M13mp8载体上， 也正是由于具有MCS序列，可以使具两种不同粘性末端(如EcoRI和BamHl)的外源DNA片段，无需借助其它操作而直接克隆到pUCl8质粒载体上。,29,3.pGEM系列,总长度为2743bp 含有一个氨卞青霉素抗性编码基因和一个lacZ编码基因 一段含有EcoR I、Sat I、Kpn I、Ava I、Sma I、BamH I、XbaI、Sall、AccI、Hinc I、Pst II、Sph I和Hind II等识别序列的多克隆位点。 此序列结构几乎与pUC18克隆载体的完全一样。,30,pGEM系列与pUC系列之间的主要差别,pGEM具有两个来自噬菌体的启动子，即T7启动子和SP6启动子，它们为RNA聚合酶的附着作用提供了特异性的识别位点。 由于这两个启动子分别位于Lac z基因中多克隆位点区的两侧，故若在反应体系中加入纯化的识别T7或SP6启动子的RNA聚合酶，便可将已克隆的外源基因在体外转录出相应的mRNA。 质粒载体pGEM-3Z和pGEM-4Z在结构上基本相似，两者之间的差别仅仅在于SP6和T7这两个启动子的位置互换、方向相反而已。,pGEM-3Z：,多拷贝,装有两个噬菌体的强启动子,装有多克隆位点（MCS）,正选择颜色标记 lacZ,用于外源基因的高效表达,注意：T7和SP6启动子特异性地由噬菌体DNA编码的RNA聚合,2743 bp,MCS,lacZ,PT7,ori,Apr,pGEM-3Z,PSP6,酶所识别，因此相应的受体菌必须表达噬菌体RNA聚合酶，如：,E.coli BL21（DE3）等,32,(二)表达载体,条件：一个强启动子及其两侧的调控序列; 有SD序列且该序列与起始密码于ATG之间要有合适的距离 在克隆基因与启动子之间有正确的阅读框架；外源基因下游有转录终止子等。,33,1. pKK表达质粒载体,pKK启动子为Ptac，由大肠杆菌强启动子Ptrp和Plac杂合组成。 pKK233-3表达载体含有tac启动子、lacE的RBS、pUC18的多克隆位点，在远端还有一个rrnB的转录终止信号。 pKK2332，它的特点是RBS的下游8个核苷酸处有一个ATG序列，该ATG和它的前后核苷酸(CCATGG)一起又组成了Nco I位点，其后又有可供插入用的Pst I及HindIII位点，最后接上rrn B的转录终止信号。,34,外源DNA可有3种插人法 将Nco I位点切开补齐后与外源DNA平端连接； 如外源DNA亦含翻译起始ATG，Nco I位点则可直接连接，如为其他位点可加入Nco I接头后连接(使用8，10或12个核苷酸的NcoI接头以获得正确的读码框架)； 使用Pst I或Hind皿位点，但此时会在表达蛋白的N-末端增加2-5个氨基酸。较新的表达载体是pKK388-I，它亦含有tac启动子及rrnB抗终止序列、RBS以及下游8个核苷酸处的Nco I位点，紧接着是来自pUCl8的多位接头，最后是rrnB的转录终止信号。,35,2.融合表达载体系统,组成成分： 含有启动子(tac)及lac操纵基因、 SD序列 谷胱苷肽巯基转移酶(GST)基因，而克隆的外源基因则与GST基因相连。当基因表达时，表达产物为谷胱苷肽巯基转移酶与目的基因的融合体。,36,该载体具有以下优点：,可诱导，能高效表达所需基因或基因片段。IPTG可诱导tac启动子进行高效表达。 融合蛋白极易纯化。谷胱苷肽巯基转移酶GST分子量为25kDa，作为一种酶在大肠杆菌表达或与外源基因融合表达时，与自然界存在的酶具有相同的酶活性，用亲和层析法(G1utathione Sepharose 4B)极易从裂解液中分离纯化出融合蛋白，也可用显色法或免疫学方法方便地检测外源蛋白的表达量。,37,可方便地从融合蛋白中获取单一外源蛋白。在pGEX多克隆位点上游有一个位点特异的蛋白酶(如凝血酶、prescission protease，Factor Xa)识别和切割位点，可方便地将所需蛋白从融合蛋白中切出并纯化。所以，近年来该系统已广泛地应用于基因表达、分子免疫学、疫苗生产及DNA蛋白质相互作用的研究等。,38,QIAexpress 6His表达系统,该系统为Ni-NTA基质对带6个组氨酸残基的重组蛋白质具有亲和层析的高效原核表达系统， 优点：6His比其它标记更小，可用于任何表达系统，包括酵母、杆状病毒和哺乳动物细胞表达系统，不影响蛋白质的结构和功能，无需蛋白酶把6His切除。生理pH条件下6His不带电荷，所以不影响蛋白质的分泌。因5His免疫原性差，所以无需去除6His, 重组蛋白可直接用作抗原产生所需抗体。,39,一、噬菌体,噬菌体是感染大肠杆菌的溶源性噬菌体，在感染宿主后可进入溶源状态，也可进入裂解循环。 基因组长度：约为50kb的双链DNA分子，实际大小为48502bp。 DNA是线状双链分子带有单链的互补末端，末端长12个核苷酸，称为粘性末端，简写cos，12个碱基的序列为5-GGGCGGCGACCT-3。当噬菌体感染宿主细胞后，双链DNA分子通过cos而成环状。,40,图3-1 噬菌体基因组结构,61个基因，每个基因平均为1000bp，其中32个较为重要，它们的分布和排列与其功能有一定关系。,41,基因组分为几个不连续的区域，三个片段组成：,（1）左臂，19.6kb，含噬菌体头、尾蛋白质编码基因，AJ的12基因都是构成外壳蛋白的基因，其中AE5个基因与头部形成有关，GJ5个基因与尾部形成有关。 噬菌体左右两臂包含了复制和成熟所必须的全部机能蛋白编码，而中央片段为非必需区，即位于J基因和N基因之间的片段可被其他大肠杆菌DNA片段所替换。,（2）中央片段，12kb24kb，含PL控制red和gam基因。,（3）右臂，9kb11kb，含DNA复制和溶菌有关的蛋白编码基因。与裂解有关的S和 R基因、与DNA复制有关的O基因和P基因等也都分别聚集在一起。,42,噬菌体感染大肠杆菌后呈现两种类型的生长方式，即溶菌性反应与溶源性反应。 在感染早期，当 噬菌体 DNA 进入宿主细胞后，其两端互补单链通过碱基配对形成环状 DNA 分子，而后在宿主细胞的 DNA 连接酶和旋促酶（gyrase）作用下，形成封闭的环状 DNA 分子，充当转录的模板。,43,噬菌体的两条复制途径：,（一）裂解生长： 噬菌体立即进行PL和PR启动子启动的N和ro基因转录。早期转录产生的N蛋白可使RNA聚合酶越过早期终止子而启动O、P和Q基因转录。 O、P产物与复制有关， Q基因蛋白则与噬菌体的头、尾部包装和溶菌有关。 DNA进入复制和滚环式复制，同时进行包装，最后导致细菌溶解，释放出子代噬菌体。经过 4045min 的生长循环，释放出约 100 个感染性噬菌体颗粒（每个细胞），成熟后使细菌裂解，释放出许多新的有感染能力的病毒颗粒。,感染细菌后，噬菌体的c基因产物抑制蛋白结合于OL和OR操纵子，阻断早期转录， 噬菌体则关闭自己的大部分基因并整合到宿主染色体，然后象细菌染色体上的基因一样 进行复制，并传递给下一代细菌。,（二）溶源性生长：,44,噬菌体的缺陷与改造,噬菌体的改造, 基因组太大（49kb）； 酶切点太多，它有5个BamH1位点（GGATCC），6个Bg位点（AGATCT），5个EcoR位点（GAATTC）。 野生型只能接纳一定长度的DNA。若相当于噬菌体的75-105%，那么只能接纳49kb5%=2.45kb的DNA。, 切去非必须区段，在切去的同时，加载目的基因（2.5kb或更大）； 去处太多的酶位点，每种酶只留1-2个切口； 增加标记基因（remarke gene）。 (4) 引入无义突变,噬菌体的缺陷：,45,二、噬菌体载体,野生型噬菌体具有大而复杂的基因组，必须经过改造才能用作载体： 现在用的载体大都减少或增加某些限制性内切酶的酶切位点：野生型有65种限制酶酶切点，除Apa、Nae、Nar、Nhe、Sna B、Xba和Xho等7种限制酶各有一个切点外，其余都多于2个。有些酶切点在增殖所必需的基因区域内。 将噬菌体的非必需区做部分切除 插入了某种报告基因,46,1.噬菌体载体的类型,两种类型： 置换型 插入型,置换型载体：可被外源DNA置换的噬菌体非必需区两侧有一对限制性酶切位点的载体，称为置换型载体。,插入型载体：有一类只含一个限制性位点可供插入外源DNA的载体，这类噬菌体载体称插入型载体。,47,置换型载体,特殊性质：中间区域约长18kb，这一段DNA可以被外源置换而不会影响噬菌体裂解生长的能力。只有DNA的长度大于野生型噬菌体DNA长度的75而不超过其105时，才能被包装成噬菌体颗粒，当DNA的长度短于野生型的75%或超过105%时，噬菌体的活性就急剧下降，因此要求载体DNA和外源DNA长度之和在3953kb之间。,48,这一特殊性质作为选择标记：,重组子被包装：当EcoR切开DNA后，目的基因可以连接于左右两臂之间，形成足够长度的DNA片段而被包装。 非重组子不被包装：如果没有外源DNA插入，由左右两臂直接融合起来的缺损基因，由于长度不足，不能包装。,49,Xgal蓝色噬菌斑试验,区分重组噬菌体形成的噬菌斑和重新恢复的载体噬菌体形成的噬菌斑的方法： 噬菌体载体带有编码-半乳糖苷酶的基因，当这种噬菌体感染lac宿主细胞并在含有X-gal的培养基上生长时，半乳糖苷酶与X-gal反应的产物为不溶性的靛蓝染料。,蓝色噬菌斑-含有中间片段的不带有外源基因的噬菌体形成 无色透明噬菌斑-含外源DNA的重组噬菌体形成的噬菌斑,50,加装选择标记 lacZ,lacZ基因编码b-半乳糖苷酶，能催化无色的X-gal生成蓝色化合物。当外源基因插入到lacZ基因中，基因灭活，不能合成蓝色化合物；而空载体l-DNA则产生蓝色透明斑,51,Eg.凯伦噬菌体载体 这类载体有插入型的，如Charon2；也有替换型的，如Charon30。在基因操作中用途很广。 Charon载体上具有适当数量的限制酶切位点，带有来自大肠杆菌的-半乳糖苷酶基因lacZ（中央区段）。插入基因经包装后，可通过蓝/白斑筛选阳性克隆。 Charon载体的特点是容量大，对研究大范围内的染色体结构很有用处。,52,插入型载体：,有一类只含一个限制性位点可供插入外源DNA的载体，这类噬菌体载体称插入型载体。 失去了非必需区 仅保留了EcoR的单一切点 切点又位于报告基因上，故在切开DNA并插入外源基因后，报告基因失活，即可依此进行重组体的筛选 可插入长度为10kb的外源DNA,53,插入型载体-gt系列,c基因内保留Hind和EcoR单酶切位点，当有外源DNA在这酶切位点插入时，使c基因失活，感染hf-大肠杆菌后可形成空斑。,54,插入型载体-gt系列-gtll,在噬菌体DNA插入的lacZ基因末端设有单一的EcoR酶切位点。在此处插入外源基因，可表达-半乳糖苷酶的融合蛋白，利用特异性抗体或DNA测序方法可筛选重组DNA。这类载体适宜构建cDNA文库,55,注意：噬菌载体作为载体，其重组噬菌体DNA大小只能： 38kb 52kb。 体外包装：噬菌载体 + 尾部蛋白 + 头部蛋白,噬菌体载体是主要用于cDNA文库构建，也经常用于外源目的基因的克隆。,1978年Collins和Hohn构建一种新型的大肠杆菌克隆载体，命名为cosmid(柯斯质粒)，又叫粘粒。 柯斯质粒（cosmid）= cos序列+质粒。 实际是质粒的衍生物，它是用正常的质粒同噬菌体的cos位点构成。,三、柯斯质粒,56,1.粘粒的组成及性质：,它的大小一般 5-7kb 左右，用来克隆大片段 DNA 克隆的最大 DNA 片段可达45kb 质粒复制起点（colE1） 象质粒一样转化和增殖 抗性标记ampr cos位点 有的粘粒载体含有两个cos位点,57,pHC79,6400 bp,Tcr,l fragment,cos,ori,Apr,PstI,BamHI,SalI,l-DNA cos序列和质粒复制子的,cos site - carrying plasmid,1.8 kb的l-DNA片段 + pBR322片段,装载范围为31 - 45 kb,58,2.柯斯质粒pHC79系,由质粒pBR322和噬菌体的cos位点的一段DNA构成，全长43kb。 在包装时，cos位点打开而产生噬菌体的粘性末端。由于pHC79有pBR322DNA，所以也就有氨苄青霉素抗性和四环素抗性两个标记。 凡具有cos位点的任何DNA分子只要在长度相当于噬菌体基因组，就可以同外壳蛋白结合而被包装成类似噬菌体的颗粒。 因此，插入柯斯质粒的外源DNA可大于40kb。重组的柯斯质粒可象噬菌体一样感染大肠杆菌，并在细菌细胞中复制。如把宿主菌在含氯霉素的培养基中生长，柯斯质粒可以扩增到宿主细胞DNA总量的50%左右。,59,3.柯斯质粒有以下优越性：, 能象-DNA一样体外包装，并高效导入受体细胞； 可以装载比质粒或-DNA大得多的外源DNA片段，如cos区及附近顺序长为1.7 kb，质粒长为3.3kb，则该柯斯质粒最大可装载46.5kb的外源DNA； 由于携带质粒的选择标记，便于筛选； 由于质粒上的多种单一酶切位点，便于克隆。,60,常用的粘性粒有PHC79、PJB8、MUA-3和KOSI等，它们大多具有一种或多种限制性内切酶的单一酶切位点。采用这种大容量载体不仅可减少构建基因组DNA文库的重组克隆数目，减少工作量，提高筛选时的阳性检出率，而且极其适合高等真核基因的克隆工作。,61,4.采用柯斯质粒作载体的困难,载体自身只相当于可以插入片段的1/10左右，因此往往会出现载体同载体自身连接，结果在一个重组分子内可有几个柯斯质粒载体连在一起。但用碱性磷酸酶处理，可阻止载体分子自身连接；,62,大小不等的外源片段相互连接后插入同一个载体分子，结果使在基因组内本来不是相邻的片段错乱地连接成一个片段，会影响实验结果的分析，后来专门选出3045kb的外源DNA插入载体DNA，此时，每个载体只可能插入一个外源片段，因为如果二处片段，则将超过包装成噬菌体颗粒的限度；,63,细菌的菌落体积远大于噬菌斑，因此如用柯斯质粒制备基因文库，则筛选所需的含某一DNA片段的菌落很费时间。 现虽建立了高密度菌落筛选法，但由于柯斯质粒制成的基因文库常常不太稳定，插入的大片段外源DNA有可能通过同宿主基因组交换而致丢失等，所以最常使用的还是噬菌体载体。,64,四、M13 噬菌体载体,单链DNA噬菌体是一类丝状的大肠杆菌噬菌体，由单链环状DNA分子外面包裹上一层蛋白质外壳而成。 M13噬菌体是单链DNA噬菌体中的一个典型的代表。,65,1.M13噬菌体的组成和结构,M13噬菌体颗粒是丝状的，只感染雄性大肠杆菌。感染宿主后不裂解宿主细胞，而是从感染的细胞中分泌出噬菌体颗粒，宿主细胞仍能继续生长和分裂。,66,M13噬菌体的外型呈丝状,M13 噬菌体由外壳包装蛋白和正链DNA组成,M13 DNA全长6407个核苷酸,M13 DNA上至少有11个基因,2700个外壳蛋白分子,M13 噬菌体不裂解宿主细胞，但抑制其生长,67,单链DNA，由6407碱基组成。 90%以上的序列可编码蛋白质，共有11个编码基因 基因之间的间隔区多为几个碱基。较大的间隔位于基因和基因以及基因和基因之间，其间有调节基因表达和DNA合成的元件。,2.M13噬菌体的基因组,编码3类蛋白质： 复制蛋白（基因，和） 形态发生蛋白（基因，和） 结构蛋白（基因、和）,68,3. M13噬菌体载体的构建,M13噬菌体作为载体具有几个重要的特点： M13噬菌体的感染与释放不会杀死宿主菌，仅导致宿主菌生长缓慢； M13噬菌体DNA在宿主菌内既可以是单链也可以是双链，通过感染或转化的方法能将M13噬菌体DNA导人宿主菌中； M13噬菌体的包装不受DNA大小的限制，其噬菌体颗粒的大小可随DNA的大小而改变，即使DNA的大小比本身DNA的大小超出6倍，仍能进行包装。,69,M13噬菌体作为载体具有几个重要的特点：,M13噬菌体在用作载体时是利用其双链状态的RF DNA：单链DNA的酶切和连接是比较困难的。 外源片段插入位点在基因和基因之间的508bp间隔区-M13不像噬菌体基因组那样含有较大的可替代区。它的基因组中绝大多数为必需基因，只有两个间隔区可用来插入外源DNA（基因/和基因/之间）。,70,4.mp系列载体,现在所使用的M13噬菌体载体是Messing及其同事建立的mp系列载体，以基因和基因之间的区域作为外源 DNA 插入区。,71,mp系列载体,M13mp载体系列是由M13mp1改造而来的，M13mp1在IR区内插入了一个编码-半乳糖苷酶N端146氨基酸的基因序列 当选用含有F因子的-半乳糖苷酶基因缺陷突变体作为宿主菌时，由于该缺陷型基因编码的多肽缺失N端第1141位氨基酸，因此缺陷型的-半乳糖苷酶没有生物活性 未插入外源基因的M13mp1与该缺陷型基因可以产生互补作用，常称为互补。,72,如果将未置换的载体转人携带有F附加体的宿主菌中，并放在含有异丙基硫代-D-半乳糖苷(IPTG)和X-gal的培养基上，就会产生蓝色噬斑 在M13mp1的LacZ区域插入外源基因片段，便会破坏-互补作用，结果产生的克隆重组体仅形成淡蓝色或无色的噬斑 通过观察噬斑颜色的变化，就能很容易识别和挑选重组体。,73,使用M13噬菌体作为载体的优点,特别适用于克隆单链DNA 例如：M13mp18和M13mp19用于克隆单链DNA和测序,74,M13噬菌体产生单双链DNA的机制：,1、以（+）链DNA为摸板，合成互补（）链，该双链称复制型DNA（RFDNA）。 2、RFDNA在宿主细胞内能快速增殖，可增加到每个细胞约200个拷贝。 3、单链特异的DNA结合蛋白结合在（+）链上，从而阻断了其互补链，即（）链的合成，这样，细胞就会不断的合成（+）链DNA 。 4、游离出来的（+）链DNA先与基因V的编码产物形成特异的DNA-蛋白质复合物，然后转移到寄主细胞膜，同时基因V的蛋白质从（+）DNA链上脱落下来，余下的M13（+）链DNA则是从其感染的寄主细胞的细胞膜溢出的过程中，被外壳蛋白包装成病毒颗粒的。,75,病毒载体概述（1）,要求：1、携带外源基因并能包装成感染性病毒颗粒 2、介导外源基因转移和表达 3、对机体不致病,容量：自身基因组大小的105%110%,组成：1、病毒复制和包装元件 2、病毒基因 3、插入的外源基因或元件 4、病毒外壳/外膜,用途：基因转移和表达 1、基因治疗 2、疫苗 3、器官移植 4、组织工程 5、转基因动物 6、基因功能研究,一、病毒载体,76,病毒载体概述（2）,优点：1、利用病毒天然的感染性进入细胞，转导效率高； 2、复杂的装配过程由细胞完成； 3、不同的病毒载体具有不同的表达特点。,77,常用的病毒载体的特点：,78, Ti质粒是一种细菌质粒，它自然存在于土壤农杆菌细胞中。土壤农杆菌可感染大多数双子叶植物的受伤部位，使之产生冠瘿瘤(grown gall tumors)。,Ti 质粒。 Ti质粒的一部分DNA叫做转移DNA（T-DNA），当T-DNA整合到宿主植物细胞的染色体后，就诱导出根瘤，并使根瘤细胞合成冠瘿碱(opine),作为土壤农杆菌的碳源和氮源 。,二、Ti质粒,79,（1）T-DNA区（transferred-DNA regions） T-DNA是农杆菌侵染植物细胞时，从Ti质粒上导入植物细胞的一段DNA。 T-DNA两端各有一段25bp的重复序列(LB, RB)。 T-DNA携带的致瘤基因是一些与激素合成有