【医学ppt课件大全】 rna干扰 rna interference，rnai

RNA干扰 RNA interference，RNAi,Contents,概述,RNA干扰（RNA interference, RNAi）是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。,概述,近几年来RNAi研究取得了突破性进展，被Science杂志评为2001年的十大科学进展之一，并名列2002年十大科学进展之首。2006年10月2日 瑞典卡罗林斯卡医学院宣布，将2006年诺贝尔生理学，医学奖授予两名美国科学家 安德鲁菲尔和 克雷格梅洛，以表彰他们发现了RNA干扰现象。,发现过程,共抑制现象的发现 研究的早期线索早在20年前,来自于美国和荷兰的两个转基因植物实验组,Rich-orgensen和同事,在对矮牵牛(petunias)进行的研究中有个奇怪的发现: 他们设想将更多的色素基因注入矮脚牵牛植物体中，试图加深花朵的紫颜色，而结果出其预料，转基因的植株不仅没有新基因表达，反而使原有的色素基因也受到了抑制。 图示,发现过程,发现过程,Jorgensen 将这种现象命名为 共抑制(cosuppression) 因为导入的基因和其相似的内源基因同时都被抑制。,发现过程,发现过程,RNAi的发现 线虫中首次发现了RNAi ： 95年康乃尔大学的研究人员Guo和kemphues在秀丽线虫(C.elegans)中用反义RNA 阻止一些基因的表达，给对照组用正义RNA不但不增加该基因的表达，反而产生与反义RNA 同样的结果特异性阻断该基因的表达，这个奇怪的现象直到3年后1998才被解开。Fire等发现将ds RNA注入秀丽线虫可显著抑制特定基因的表达，并证明了Guo和kemphues所发现的正义RNA的基因压制作用其实是转录时污染微量dsRNA所造成的。,发现过程,将制备的RNA高度纯化后发现，正义RNA无基因抑制作用，反义RNA的基因抑制作用也很微弱，而用纯化后的dsRNA注入线虫，却能高效、特异地阻断相应基因的表达。实验证明双链RNA抑制基因的表达的效率比纯化后的反义RNA至少高几个数量 ，他们称此现象为ds RNA介导的RNA干扰（RNAi）。 图示,Effects of mex-3 RNA interference on levels of the endogenous mRNA. Nomarski DIC micrographs show in situ hybridization of 4-cell stage embryos. (A) Negative control showing lack of staining in the absence of the hybridization probe. (B) Embryo from uninjected parent showing normal pattern of endogenous mex-3 RNA (purple staining). (C) Embryo from parent injected with purified mex-3 antisense RNA. These embryos (and the parent animals) retain mex-3 mRNA, although levels may be somewhat less than wild type. (D) Late 4-cell stage embryo from a parent injected with dsRNA corresponding to mex-3 ; no mex-3 RNA is detected. (Templates used for interfering RNA and in situ probes were largely non-overlapping.),发现过程,RNAi现象的普遍性 随后陆续发现RNAi也存在于水稻、烟草、果蝇、小鼠及人等几乎所有的真核生物中。RNAi能高效特异的阻断基因的表达，在线虫，果蝇体内，RNAi能达到基因敲除的效果。,RNAi 的机制,目前普遍认为，共抑制、基因压制和RNAi很可能具有相同的分子机制，都是通过dsRNA的介导而特异地降解靶mRNA, 抑制相应基因的表达。 现已初步阐明dsRNA介导的同源性靶mRNA降解过程主要分为两步。,RNAi 的机制,第一步（起始阶段）是较长ds RNA在ATP参与下被RNase样的特异核酸酶切割加工成2123nt的由正义和反义链组成的小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）。,RNAi 的机制,第二步（效应阶段）是siRNA 在ATP参与下被RNA解旋酶解旋成单链，并由其中反义链指导形成RNA诱导的沉默复合体(RNA-induced silencing complex，RISC)。RISC由siRNA、解旋酶、ATP、核酸内切酶、核酸外切酶等多种成分组成。活化的RISC在单链siRNA引导下识别互补的mRNA，并在RISC中的核酸内切酶作用下从siRNA引导链中心所对应的靶基因位置切割靶mRNA，最后可能再被核酸外切酶进一步降解，从而干扰基因表达。,RNAi的机制,RNAi原理示意图：紫色为正义RNA段，蓝色为反义RNA段，绿色为目标信使RNA，dsRNA触发了高效的基因沉默机制并极大降低了靶mRNA水平，达到干扰目的,RNAi 的特点,RNAi 的特点,RNA i应用,RNAi主要通过在转录后（post-transcriptional）水平阻断基因的表达，导致蛋白无法合成，出现“基因沉默”。比如，我们可以按拟定的方式来关闭（shutting off）非必需或致病基因的功能。从理论上说，若能关闭致病基因的表达则很多疾病将被治愈。动物实验已证明，可以通过RNAi的方法使导致血胆固醇升高的基因“沉默”；病毒性疾病，眼疾，心血管代谢性疾病等方面的临床试验也正在进行中；这一方法为病毒性肝炎、艾滋病和肿瘤等人类顽疾的治疗指了一条新路 。,RNAi的应用,基因治疗： RNAi 作用的高度特异性有可能特异地抑制致病的突变等位基因，但又不影响正常的等位基因。 在利用RNAi技术对HIV、乙型肝炎、丙型肝炎等进行基因治疗研究中发现，选择病毒基因组中与人类基因组无同源性的序列作为抑制序列可在抑制病毒复制的同时避免对正常组织的毒副作用。同时将抑制序列选择在特定的位点，可对部分有明确基因突变的恶性肿瘤细胞如含有BCL/ABL或AML1/MTG8融合基因的白血病细胞产生凋亡诱导作用。,RNAi的应用,RNAi在探索基因功能中的应用： 人类基因组计划的完成标志着后基因组时代的来临。阐明人类基因组中功能基因表达产物的生物学作用对医学发展有着深远意义。 在RNAi技术出现以前，基因敲除（gene knockout）是主要的反向遗传学（reverse genetics）研究手段，但其技术难度较高、操作复杂、周期长。 由于RNAi技术可以利用siRNA或siRNA表达载体快速、经济、简便的以序列特异方式剔除目的基因表达，所以现在已经成为探索基因功能的重要研究手段。同时siRNA表达文库构建方法的建立，使得利用RNAi技术进行高通量筛选成为可能，对阐明信号转导通路、发现新的药物作用靶点有重要意义。,RNAi的应用,防御病毒的感染： Hu WY等证明了siRNA能阻抑逆转录Rous 肉瘤病毒（RSV）感染脊椎动物； Leonid等发现针对脊髓灰质炎病毒中编码衣壳蛋白或编码病毒聚合酶的mRNA的siRNA可以抑制病毒复制，加速清除受染细胞中的脊髓灰质炎病毒； Jia等发现Rta-siRNA( Rta是疱疹病毒基因表达的一种起始转录因子)和ORF45-siRNA能特异阻止疱疹病毒复制。,RNAi的应用,RNAi在整形外科领域的应用前景 已证实N-Ras或BRAF的激活型突变是引发黑素瘤的主要病因，使用RNAi技术剔除黑素瘤细胞的BRAF表达，不仅抑制了肿瘤细胞生长，而且减弱了其侵袭能力，为黑素瘤基因治疗奠定了基础。 最近研究表明趋化因子受体CXCR4是乳腺癌转移的重要调节因素，其配体CXCL12可趋化肿瘤细胞并调节其增生和侵袭特性。使用RNAi干扰技术剔除CXCR4，将在治疗中起关键作用。,总述,RNAi,抗病毒入侵,真核生物中存在,抑制转座子活动,调控基因表达,总述,植物、动