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钙网蛋白在不同疼痛模型大鼠脊髓中的表达 作者：王金韬 罗爱林 金小高 张广雄 罗辉宇 【摘要】 目的： 观察钙网蛋白在三种疼痛模型大鼠的脊髓中表达的变化，探讨其与疼痛的可能关系. 方法： 分别制作甲醛炎性痛模型、保留性坐骨神经分支损伤（SNI）模型和慢性缩窄性坐骨神经损伤（CCI）模型，观察大鼠疼痛行为学改变，并分别用免疫组化和Western Blot技术检测大鼠脊髓cFos和钙网蛋白的表达. 结果： 与对照组相比，各模型组大鼠脊髓后角cFos 阳性神经元增多(P<0.05)； SNI模型组和CCI模型组大鼠脊髓钙网蛋白的表达均上调(P<0.05)，甲醛炎性模型组大鼠脊髓钙网蛋白变化无统计学意义(P>0.05). 结论： 脊髓钙网蛋白的表达上调与SNI和CCI模型的慢性神经病理痛发生过程有关. 【关键词】 疼痛；脊髓；钙网蛋白 【Abstract】 AIM: To detect the change of rat spinal calreticulin expression levels in three pain models and to investigate the possible involvement of calreticulin in pain development. METHODS: Formalin inflammatory pain model, spared never injury(SNI) model, and chronic constriction injury(CI) model were established. Then, the behavioral changes were observed and evaluated and cFos and calreticulin expressions in the spinal cord of rats were detected with immunohistochemistry and Western Blot, respectively. RESULTS: Compared with control groups, quantity of cFos positive neurons significantly increased in spinal dorsal horn of rats with formalin injection, SNI or CCI (P<0.05); calreticulin expression levels were upregulated significantly in spinal cord of rats with SNI and CCI (P<0.05), but not in spinal cord of rats with formalin injection (P>0.05). CONCLUSION: Upregulation of calreticulin expression in spinal cord is involved in the development of chronic neuropathic pain induced by SNI and CCI. 【Keywords】 pain; spinal cord; calreticulin 0引言 钙网蛋白(calreticulin， CRT)是一种在动物和高等植物体内普遍存在，主要分布于内质网腔内，有很强的钙结合能力的钙结合蛋白，具有多种重要生理功能. 钙网蛋白通过调节细胞内钙稳态和相关信号转导途径，影响细胞内基因表达、蛋白质合成和翻译后修饰等等，在神经系统的多种生理、病理过程中发挥重要作用1-2. 然而，国内外研究均缺乏钙网蛋白与疼痛是否有关的直接实验证据，因此本研究拟通过观察钙网蛋白在三种疼痛模型大鼠脊髓中表达的变化探讨其与疼痛的可能关系. 1材料和方法 1.1材料体质量200250 g的雄性SD大鼠30只，由华中科技大学同济医学院动物实验中心提供. 实验前在同一环境(室温2024，避免强光及噪声刺激，自由进食和饮水)饲养48 h以上. 足底触觉测量仪(37400型)为意大利Ugo Basile公司产品. 兔抗钙网蛋白抗体(Stressgen，SPA600D)购自晶美公司，鼠抗actin抗体(BM0627)，兔抗cFos抗体(BA0207)为武汉博士德产品，SABC试剂盒(SP9001)，HRP标记二抗(za2301, zb2305)均购自北京中山公司. 1.2方法 1.2.1分组大鼠随机分为5组，每组6只. 分别为盐水对照组（SA），假手术对照组（SH），甲醛模型组(F)，保留性神经损伤(spared never injury， SNI)模型组(SNI)，慢性缩窄性损伤(chronic constriction injury, CCI)模型组(CCI). 其中SA组和SH组接受对照处理，F组, SNI组及CCI组分别制作相应模型. 1.2.2疼痛模型的制作甲醛模型，大鼠左后肢足底皮下注射20 g/L甲醛100 L；SA组注射相同体积生理盐水. SNI模型，暴露大鼠左后肢坐骨神经及其分支，切断胫神经和腓总神经分支，保留腓肠神经分支；CCI模型，暴露大鼠左后肢坐骨神经，用40铬制肠线环绕神经干，做4个轻度结扎环，间距1 mm. SH组仅暴露坐骨神经. 1.2.3行为学检测痛级均数(pain intensity rating, PIR)计算：观察甲醛模型注射后1h内大鼠疼痛行为学变化，将痛反应分4级计分：0分两后爪同时着地，活动无异常；1分左后爪轻触地面，跛行；2分左后爪抬起，不接触地面；3分大鼠舔、咬或摇动左后爪. 疼痛程度以PIR表示，PIR(T1 + 2T2 + 3T3) / 300,式中T1, T2, T3分别为观察的每单位时间 (300 s)内出现1, 2, 3级疼痛的持续时间（单位s）3. 机械缩爪阈值测定：SH, SNI和CCI组大鼠手术后14 d内隔日使用足底触觉测量仪测定机械缩爪阈值，以50缩爪阈值表示. 采用upanddown的方法4： 在后爪足底依次给予力度为0.45, 0.70, 1.2, 2.0, 3.63, 5.5, 8.5, 15.1 g，持续68 s的刺激，出现缩足反应为阳性，反之为阴性，每两次刺激间隔2 min. 从2 g开始，若呈阴性反应则选择上移一个刺激级别(3.63 g)，若呈阳性反应则选择下移一个刺激级别(1.20 g)，依次类推. 当出现相邻两次反应不一致（阳性反应变为阴性反应或阴性反应变为阳性反应）时，继续依序刺激4次. 计算机械刺激的50%缩爪阈值如下：50缩爪阈值=10log(X)+k（X为最后刺激使用的力度，k为不同刺激方式的系数. 是各相邻级别刺激力度对数值之差的平均数，此处0.224）. 若需选择的刺激力度超过15.1 g或低于0.45 g，则50缩爪阈值直接记为15.1 g或0.45 g4. 1.2.4取材和标本制作SA组和F组大鼠注射后2 h处死取材，其余各组大鼠术后第14日测痛后处死取材. 大鼠腹腔注射100 g/L水合氯醛400 mg/kg麻醉. 每组取3只大鼠以40 g/L多聚甲醛心脏灌注固定，分离、截取腰46段脊髓，40 g/L多聚甲醛后固定4 h，蔗糖脱水，30 m冰冻切片；另3只大鼠迅速断头处死，在冰面上取脊髓腰46段，提取总蛋白，考马斯亮兰法定量. 1.2.5免疫组织化学实验切片用PBS洗涤，30 mL/L H2O2处理，入100 mL/L羊血清封闭，37 30 min，入1500稀释的兔抗cFos抗体孵育，4 12 h，经PBS洗后加入1400稀释的生物素化羊抗兔IgG，37孵育1 h，SABC复合物37孵育30 min，DAB显色，常规脱水、透明、封片. 在显微镜下计算脊髓后角层cFos阳性神经元数目，比较疼痛大鼠与相应对照组大鼠脊髓cFos阳性神经元数目的变化. 1.2.6Western Blot制胶，每孔上样60 g，电泳，转膜. NC膜用50 g/L脱脂奶室温封闭1 h，1500兔抗钙网蛋白或鼠抗actin一抗室温孵育30 min，然后4过夜，PBS洗膜后1500相应HRP标记二抗室温孵育1 h，显色照相，进行灰度分析以观察钙网蛋白相对表达水平的改变. 统计学处理：计量资料以xs表示，采用SPSS10.0进行统计分析. 组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用Dunnetts t检验. P<0.05为差异有统计学意义. 2结果 2.1疼痛行为学改变足底注射后，F组大鼠呈现明显的两相疼痛反应，分别出现在注射后10 min内和20 min后，PIR较SA组明显升高，差异有统计学意义（P<0.05，图1A）. SNI组大鼠术后第2日术侧50缩爪阈值即开始下降，CCI组大鼠术侧50缩爪阈值在第5日左右开始下降. 术后第14日，SNI组和CCI组大鼠术侧50缩爪阈值均较假手术组降低，差异有统计学意义（P<0.05，图1B）. 2.2cFos的表达脊髓后角cFos阳性神经元分布较广泛，主要位于层，在层分布较为密集，呈胞核棕褐色深染圆形颗粒. 各疼痛模型组患侧脊髓后角层cFos阳性神经元数目与相应对照组相比均明显增多，差异有统计学意义（P<0.05，图2）. 2.3钙网蛋白的表达SNI组和CCI组大鼠脊髓钙网蛋白的表达均升高，与SH组相比差异有统计学意义(P<0.05)，但F组大鼠与SA组、两不同处理的对照组间差异无统计学意义(P>0.05，图3). 3讨论 甲醛疼痛模型能很好的模拟急性炎性疼痛，因此被广泛地应用于疼痛机制的研究. 其特点是疼痛行为学改变表现出明显的两相特征3. 本研究中甲醛模型组大鼠注射后的行为学改变与报道吻合，证明模型复制成功. CCI模型是另一种得到广泛应用的经典疼痛模型，其部分疼痛行为学表现与慢性神经病理性疼痛的临床特征相符，本研究中，成功复制的CCI模型大鼠均表现出明显的机械痛阈降低. 然而，CCI模型大鼠也有明显热痛阈变化，部分学者认为这一症状属于炎性痛特征，进而指出CCI模型实际上是一种混合性疼痛模型，包括了炎症性和神经病理性两种机制4-5. 最新研究显示，SNI模型大鼠的行为学改变与慢性神经病理性疼痛特点更加吻合，且有手术简单易行、神经损伤确切，疼痛症状出现早、持续时间长等优点，是一种更为理想的慢性神经病理性疼痛模型5-6. 本研究中SNI模型大鼠的疼痛表现与文献报道的上述特点一致. 已经知道，脊髓后角是疼痛的初级中枢7；cFos蛋白在神经损伤后表达增多，是神经元激活的标志物. 本研究在3种大鼠模型中均观察到脊髓后角cFos蛋白表达上调，进一步证明疼痛模型成功、神经元被激活，并且说明脊髓后角神经元激活是上述3种疼痛模型的共同机制之一. 钙网蛋白广泛分布于高等生物体除红细胞之外的所有细胞内质网腔中，具有多方面的重要生物功能1,8. 钙网蛋白与多种疾病或病理过程有密切联系，近来研究显示，钙网蛋白介导果蝇对异氟醚等吸入性麻醉药的易感性，并且在神经系统的退化及衰老、以及Alzheimer氏病等多种神经退行性疾病的发生中发挥作用2,9-110. 研究显示，钙网蛋白在脊髓中的表达主要位于后角第层神经元和前角运动神经元中11. 现已知道，脊髓后角第, 层神经元的功能与疼痛形成机制密切相关. 钙网蛋白在脊髓中的这种分布特点提示，这一蛋白可能通过对脊髓第层神经元细胞功能的影响参与疼痛机制. 本研究中，成功复制的SNI模型和CCI模型大鼠脊髓中钙网蛋白表达明显增加，显示脊髓钙网蛋白与疼痛发生有某种联系. 在本研究中，SNI和CCI两种慢性疼痛模型大鼠的脊髓中钙网蛋白表达明显上调，但在甲醛模型中并未观察到这一变化，说明钙网蛋白可能仅与SNI模型和CCI模型疼痛的慢性病理过程有关，而不参与甲醛模型中的急性疼痛形成机制. 目前多数研究者公认，在慢性疼痛的产生和维持机制当中，神经可塑性变化和中枢敏感化具有关键作用；细胞内Ca2+调节的相关信号转导途径激活、基因转录、蛋白质合成，以及所引起的细胞凋亡或再生、纤维重构等为神经可塑性变化和中枢敏感化提供了物质基础12. 细胞内Ca2+不仅受细胞膜电压门控钙通道和NMDA受体调节，还受内质网等内源性钙库调节，后者正是钙网蛋白的重要生理功能之一. 因此，钙网蛋白对细胞内Ca2+的调节最终影响神经可塑性变化及中枢敏感化可能是其参与疼痛的机制之一，有待进一步实验证明. 【参考文献】 1Gelebart P, Opas M, Michalak M. Calreticulin, a Ca2+binding chaperone of the endoplasmic reticulum J. Int J Biochem Cell Biol, 2005, 37(2):260-266. 2Wu JC, Liang ZQ, Qin ZH. Quality control system of the endoplasmic reticulum and related diseasesJ. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai), 2006, 38(4):219-226. 3Abbott FV, Franklin KB, Westbrook RF. The formalin test: Scoring properties of the first and second phases of the pain response in ratsJ. Pain, 1995, 60(1):91-102. 4Chaplan SR, Bach FW, Pogrel JW, et al Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat pawJ. J Neurosci Methods, 1994, 53(1):55-63. 5金小高，罗爱林，张广雄. 三种大鼠神经病理性疼痛模型的制备和效果比较J. 临床麻醉学杂志, 2005, 21(5):338-340. 6Decosterd I, Woolf CJ. Spared nerve injury: An animal model of persistent peripheral neuropathic painJ. Pain, 2000, 87(2):149-158. 7Bridges D, Thompson SW, Rice AS. Mechanisms of neuropathic painJ. Br J Anaesth, 2001, 87(1):12-26. 8Groenendyk J, Lynch J, Michalak M. Calret