重症肌无力CD45RA、CD45RO胸腺细胞亚群及相关细胞因子表达分析.doc

重症肌无力CD45RA、 CD45RO胸腺细胞亚群及相关细胞因子表达分析 作者：李倩如, 杜英, 赵航, 高峰, 张清勇, 张钦宪【摘要】 目的: 探讨胸腺细胞异常分化与重症肌无力发生的关系。方法: 采用基因芯片对多种白细胞介素、 干扰素及其受体mRNA表达进行分析, 采用流式细胞术测定胸腺细胞CD45RA、 CD45RO的表达率, 采用免疫组化对胸腺组织切片CD45RA、 CD45RO表达及分布进行检测。结果: MG患者IL1R、 IL4R、 IFNR1、 IFNR2、 IL6、 IL8表达水平显著低于对照组; IL10RB表达水平显著高于对照组; IL1、 IL2、 IL4、 IL10、 IL7、 IFN、 IFN、 IFN表达水平在MG和对照组均很低, 无显著差异; MG患者CD56+胸腺细胞百分率（0.560.33）显著低于对照组（1.780.69）, MG患者CD45RO+、 CD1a+细胞显著高于对照组。免疫组化和RTPCR也有相同结果。结论: MG患者胸腺细胞发育过程中CD45RO+细胞向CD45RA+T细胞转变存在异常。 【关键词】 白细胞介素; CD45RA; CD45RO; 重症肌无力; 胸腺 重症肌无力（myasthynia gravis, MG）是有显著胸腺异常和T细胞功能异常的自身免疫性疾病。胸腺是T细胞发育成熟的场所, 胸腺细胞的发育受胸腺微环境中胸腺基质细胞、 胸腺激素和细胞因子的影响, 经历TCR基因重排、 CD4和CD8分子双阴性、 双阳性、 到单阳性细胞阶段, 使T细胞由不成熟到成熟, 并获得MHC限制性和自身耐受性。以往已有研究表明MG患者胸腺组织双阳性细胞（CD4+CD8+）、 单阳性细胞（CD4+CD8-, CD4-CD8+）及细胞凋亡分子（CD95）表达均存在异常, MG胸腺组织可见生发中心, 可检测到自身抗体（AchRab）1-3。但MG患者胸腺结构和功能异常的机制至今尚不清楚。但对CD45RA、 CD45RO、 CD56、 CD1a分子表达的报道较少。为深入探讨不同胸腺细胞亚群在MG发生中的作用, 我们对MG患者胸腺细胞多种表面标志、 细胞因子及其受体进行了分析。 1 材料和方法 1.1 材料 研究对象为临床确诊并行手术切除胸腺的MG患者, 选择胸腺增生型MG患者37例为实验组, 男20例, 女17例; 年龄653 (26. 66 16. 29)岁。对照组为非自身免疫先天性心脏病患者, 共16例, 年龄445 (25. 37 12.32)岁。TRzol试剂为Invitrogen产品, FACScan 流式细胞仪为美国BD公司产品。FITC标记小鼠抗人CD56、 CD45RA、 CD45RO 单克隆抗体（mAb）, PE标记小鼠抗人CD1a、 HLADR mAb 及FITC、 PE标记同型免疫球蛋白IgG1FITC、 IgG2PE, 均购自美国Farmingen 公司。小鼠抗人CD3、 CD56、 HLADR mAb购自北京中杉公司。小鼠抗人CD25、 CD161、 CD45RO、 CD45RA mAb购自美国eBioscience公司。 1.2 方法 1.2.1 胸腺组织RNA提取 100 mg左右新鲜胸腺组织立即置于液氮, 加入1 mL TRIzol试剂, 用匀浆器进行匀浆, 依次加入0.2 mL的氯仿, 4 12 000 g离心15 min, 吸取上层水相, 加入0.5 mL的异丙醇, 混匀, 室温孵育10 min, 4 12 000 g离心10 mn, 获得RNA。电泳鉴定RNA质量。-70保存。 1.2.2 基因芯片分析白细胞介素、 干扰素及其受体mRNA表达 将胸腺组织匀浆分别采用TrueLabelingAMPTM线性RNA扩增试剂盒、 SuperArray ArrayGrade cRNA 纯化试剂盒进行cDNA合成、 cRNA合成和cRNA纯化, 采用Oligo GEArray芯片依次进行预杂交、 杂交、 洗膜, 采用化学发光检测试剂盒(SuperArray Bioscience, Catalog Number D01)进行化学发光检测, 采用GEArray Expression Analysis Suite进行芯片数据分析。 1.2.3 流式细胞术分析胸腺细胞表面标志 无菌取1 g左右胸腺组织, 去筋膜、 血污后, 剪碎, 在100目不锈钢网上轻柔研磨, 过200目无菌不锈钢网, 制成单细胞悬液, 经淋巴细胞分离液2 000 r/min, 15 min离心分离出胸腺细胞。用PBS洗细胞2次, 调整细胞密度至109个细胞/L, 台盼蓝计数活细胞>95%。取100 L细胞悬液分别用CD4FITC、 CD8PE、 CD56FITC、 CD95PE、 CD1aPE、 HLADRPE、 CD45RAFITC、 CD45ROPE进行双标记或单标记, 另以未加抗体作阴性对照、 荧光标记的同型抗体作同型对照, 避光、 4、 孵育30 min, PBS漂洗2次, 悬浮细胞至200 L上机检测。 1.2.4 胸腺组织的免疫组化分析 取1 g左右胸腺组织放入40 g/L多聚甲醛溶液固定, 将胸腺组织经石蜡包埋、 切片。按免疫组化染色试剂盒(SP法北京中杉公司提供)说明书操作。进行CD3、 CD45RO、 CD45RA、 CD56和HLADR抗原检测。DAB显色剂显色。 1.2.5 统计学分析 采用SPSS10.0统计软件对计数资料行2检验, 计量资料行t检验。 2 结果 2.1 MG患者胸腺组织ILs、 IFN及其受体mRNA的表达 分别对MG患者和对照组胸腺组织进行多种ILs、 IFNs及其受体进行检测, 如图1。结果显示, MG患者IL1R、 IL4R、 IFNR1、 IFNR2、 IL6、 IL8表达水平显著低于对照组; MG患者胸腺IL10RB表达水平显著高于对照组; IL1、 IL2、 IL4、 IL7、 IL10、 IL17、 IFN、 IFN及其受体、 IFN表达水平在MG和对照组均很低, 无统计学意义。 2.2 MG患者及对照组胸腺细胞CD45RA、 CD45RO、 CD56、 CD1a分子表达 结果显示, MG患者胸腺细胞CD45RA+、 CD56+细胞明显减少（P<0.01）; CD45RO+、 CD1a+细胞显著高于对照组（P<0.01, 表1）。表1 MG患者及对照组胸腺细胞CD45RA、 CD45RO分子及CD56、 CD1a分子表达 2.3 MG患者与对照组胸腺免疫组化结果比较 在MG患者和对照组胸腺组织CD45RA、 CD56分子均呈弱阳性表达( 图2A); MG患者和对照组的显著区别在CD45RO分子的表达, 前者呈强阳性表达, 且表现为灶状分布（图2B）。 3 讨论 CD45RA和CD45RO是CD45分子的两种异型, 属I型跨膜蛋白, 是区分初始T细胞和记忆T细胞的标志。在外周血中, CD4+CD45RA+ T细胞为初始T细胞, 接触抗原活化后可转变为CD4+CD45RO+ T细胞。CD4+CD45RO+ T细胞为记忆T细胞, 再次接触抗原可迅速增殖, 具有较强辅助B 细胞合成IgG的能力。有研究报道, T细胞在胸腺发育过程中也存在CD45RA/CD45RO转换, 由CD45RO+转换为CD45RA+可能标志着阴性选择的完成4, 胸腺细胞的阴性选择是排除自身反应性T细胞、 防止自身免疫性疾病发生的关键环节, 亦即CD45RO+向CD45RA+的转换可能与自身反应性T细胞的排除有关。本研究显示, MG患者胸腺细胞CD45RA表达明显减少, CD45RO分子表达明显增高, 在免疫组化染色中可见MG患者CD45RO分子表达呈灶状分布, 提示MG患者T细胞在胸腺发育过程中存在CD45RO到CD45RA的转变障碍, 并因此不能完成阴性选择过程, 从而与自身免疫性MG的发生有关。 我们对多种细胞因子及其受体mRNA进行检测, 仅发现MG患者胸腺组织IL6和IL8 mRNA表达明显低于非自身免疫病对照组, 其他Th1、 Th2、 Th17型细胞因子在MG患者和对照组均表达低下。细胞因子的检测结果说明MG患者胸腺组织不存在Th细胞的异常活化, 因此CD45RO+T细胞数量增多可能不是由于T细胞活化后分化为记忆细胞的结果, 而是由于胸腺细胞发育过程中CD45RO+向CD45RA+的转变障碍。 我们在研究中还发现, IL1R1、 IL1R2、 IL1RN、 IL4R、 IFNR2 mRNA表达明显低于对照组, 说明MG患者胸腺细胞对IL1、 IFN反应性低下; 而IL6、 IL8 mRNA明显低于对照组, 说明MG患者胸腺细胞和胸腺基质细胞分泌IL6、 IL8能力降低, 导致MG患者对正常T细胞的促增殖能力和对T细胞的趋化能力降低; 研究中显示MG患者胸腺IL10RB表达水平明显高于对照组, 说明MG患者胸腺细胞对IL10的抑制作用敏感性增强。这些因素可能也与CD45RO+细胞向CD45RA+T细胞转变障碍有关。【参考文献】 1 Utsugisawa K, Nagane Y, Suzuki S, et al. Antigenspecific Tcell activation in hyperplastic thymus in myasthenia gravisJ. Muscle Nerve, 2007, 36(1): 100-103.2 Aruna BV, Sela M, Mozes E. Downregulation of T cell responses to AchR and reversal of EAMG manifestations in mice by a dual altered peptide ligand via induction of CD4+CD25+ regulatory cellsJ. Neuroimmunol, 2006, 177(1-2): 63-75.3 Tackenberg B, Kruth J, Bartholomaeus JE, et al. Clonal expansions of CD4+ B helper T cells in autoimmune myasthenia gravisJ. Eur J Immuno