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肺炎链球菌comX基因可影响细菌毒力基因表达 作者：张雪梅，尹一兵，孟江萍，许颂霄，王虹，黄远帅 【摘要】 目的： 探讨肺炎链球菌的转化相关基因comX与其毒力表达的关系. 方法： 采用插入失活的方法制备肺炎链球菌的相关基因缺陷菌株，通过小鼠毒力实验观察它们毒力的变化，并应用RTPCR测定肺炎链球菌的主要毒力因子透明质酸酶（phd），分泌型IgA结合蛋白（sIgA），肺炎链球菌自溶酶（lytA），肺炎链球菌神经氨酸酶A （nanA）和肺炎链球菌溶血素（ply）在细菌感受态发生过程中的表达，并比较其在野生和缺陷菌株中的表达的异同. 结果： 野生菌株的毒力基因受感受态刺激因子（CSP）诱导表达增加；虽comX基因缺陷菌株与野生菌株感染小鼠的能力无显著差异，但其ply基因的表达与comE基因缺陷菌株一样显著低于野生菌株的表达. 结论： comX可通过细菌转化的通路影响细菌毒力基因的表达. 【关键词】 链球菌，肺炎；自转化，细菌；毒力基因0引言肺炎链球菌是目前发现转化效率最高的一种细菌，一些可被感受态刺激蛋白（CSP）诱导表达的蛋白基因变异时，肺炎链球菌的毒力减弱1-2. 我们已发现调控肺炎链球菌转化的一个关键基因comE基因缺陷后，其毒力会减弱3. 近来发现了一个新基因comX与肺炎链球菌转化相关，其编码的蛋白具有因子的作用，可诱导一系列转化相关的晚期基因如cinArecA, cilABCDE, coiA和cfl等的表达，使细菌发生转化4-5. 我们拟通过构建相关基因的缺陷菌株，比较其与野生菌株的毒力因子表达，以探讨基因comX是否与细菌毒力表达相关及相关的分子机制.1材料和方法1.1材料试验菌株及动物 2型光滑型 (S型)肺炎链球菌： 中国药品生物制品检定所医学微生物菌种保藏中心提供，主要遗传特征经鉴定合格. 健康BALB/c小鼠38只，由第三军医大学动物中心提供. 体质量1822 g，随机分为三组，野生菌株组（wt， n=12），comE基因缺陷菌株组（comE-， n=13）和comX全基因缺陷菌株组(n=13). 主要试剂 C+Y半合成培养基：含5 g/L Yeast抽提物（Lacks and Hotchkiss,1960）. 肺炎链球菌CP1250的染色体DNA（含有链霉素抗性基因str）、肺炎链球菌CPM17的染色体DNA(含有标志基因红霉素抗性基因erm的comE断裂基因)、肺炎链球菌CPM10的染色体DNA(含有标志基因红霉素抗性基因erm的comX1断裂基因和标志基因四环素抗性基因tet的comX2断裂基因),CSP，由美国Morrison教授提供. 引物序列由上海生物工程技术有限公司合成(表1)，毒力因子序列由日本遗传子研究所设计并合成(表2).表1扩增各基因的引物序列（略）表2毒力基因所用的引物（略）注：phd为透明质酸酶,sIgA为分泌型IgA结合蛋白,lytA为肺炎球菌自溶酶,nanA为肺炎球菌神经氨酸酶A, ply为肺炎球菌溶血素.1.2方法1.2.1肺炎链球菌comE, comX1, comX2和comX全基因缺陷菌株的制备以菌株CPM17的染色体DNA为模板，PCR扩增出comE断裂基因（comEupermcomEdw）片段，以菌株CPM10的染色体DNA为模板，PCR扩增出comX1断裂基因（comX1upermcomX1dw）片段和comX2断裂基因（comX2uptetcomX2dw）片段4，胶回收纯化后储于-20备用. 将肺炎链球菌培养于CTM培养基（C+Y培养基、1 mmol/L的CaCl2和2 g/L牛血清白蛋白）中至A550 nm=0.1左右，加入感受态刺激因子（CSP）20 g/L，然后分别加入comE, comX1, comX2断裂基因的PCR产物各1 g/L于不同的试管中，37孵育90 min，然后分别铺于含红霉素（0.25 mg/L）,四环素（0.25 mg/L）和二者都含的血平板（TSA）上，于37孵箱培养2448 h，挑取菌落于C+Y培养基中培养，当细菌密度为A620 nm=0.2左右时，冻于-70冰箱保存，此即为转化菌落.1.2.2comE, comX1, comX2和comX全基因缺陷菌株的鉴定将野生菌与缺陷菌同时做转化实验，选用CP1250的DNA为外源基因;提取野生菌与缺陷菌的染色体DNA，分别以erm和tet的引物5进行PCR扩增.1.2.3小鼠腹腔感染毒力试验6将过夜培养于C+ Y培养基中的肺炎链球菌稀释20倍于C+Y培养基中培养6 h，到其A620 nm0.6, 然后用无菌PBS稀释成适当的浓度. 经过浓度梯度感染预实验，将菌株稀释成5105 cfu/L，分别在Balb/c小鼠腹腔内注入0.1 mL菌液，记录小鼠死亡时间，可得到各菌株的半数致死时间.1.2.4半定量RTPCR测定毒力基因的表达1.2.4.1总RNA的提取： 将野生型肺炎链球菌及其各基因缺陷菌株（comE-, comX-, comX1-和comX2-）分别培养于CTM培养基中，在A550 nm分别为0.1左右时各加入CSP至100 g/L ，诱导感受态发生. 分别在加入CSP的0, 10, 20 min三个时相取1 mL菌液，冻于-70冰箱，用以RNA提取. 将所取的样本按Qiagen试剂盒的总RNA提取法提取总RNA.1.2.4.2半定量RTPCR以cDNA为模板3，以基因16S rRNA（为内参）和五种毒力基因的引物（序列见表2），分别PCR扩增相应片段. 循环参数为：94 1 min, 55 40 s, 72 45 s，30个循环，琼脂糖电泳（Marker: X174DNA/Hinf），照相.统计学处理： 小鼠毒力实验得到的各菌株半数致死时间结果用mannwhitnay U检验分析. 毒力基因的mRNA表达图谱通过软件Quantityone 3.0 version分析数据，结果用t检验进行统计学分析.2结果2.1肺炎链球菌基因缺陷菌株的构建及特性利用comE, comX1和comX2的断裂基因PCR产物转化野生菌株分别得到转化菌株comE-, comX1-, comX2-和comX全基因缺陷菌株comX-，转化率分别为4.310-3%, 7.810-3%, 1.210-3%和9.610-5%. 将野生菌株与基因缺陷菌株同时转化抗链霉素（str）的DNA，野生菌株获得转化菌株，转化率为5.610-1%，而各基因缺陷菌株均无菌落生长. 提取野生菌与基因缺陷菌的染色体DNA，以erm和tet的引物做PCR，野生菌株无对应产物，comE-, comX1-, comX2-和comX-菌株都在726 bp（erm片段）处有产物，comX2-和comX-都在1400 bp（tet片段）处有产物（图1），Marker为Gene RulerTM 1 kb DNA Ladder，购于MBI公司. 鉴定结果表明各基因缺陷菌株构建成功.A： comX-菌株有两种PCR产物: tet(comX-t, 1400 bp) 和erm(comX-e, 726 bp)， comE-菌株有一种PCR产物: erm(comE-e, 726 bp)，而野生菌株(wt)没有相应PCR产物. B： comX1-菌株有一种PCR产物erm (comX1-e, 726 bp). C： comX2-菌株有一种PCR产物tet(comX2-t, 1400 bp). M: marker.图1通过PCR鉴定所得的基因缺陷菌株comE-, comX-, comX1-和comX2-（略）2.2小鼠毒力实验野生菌株和comX基因缺陷菌株comX-的半数致死时间均为1.9 d，而comE基因缺陷菌株comE-的半数致死时间为2.9 d，三者之间差异无统计学意义（P0.05）.2.3半定量RTPCR分别测定各株肺炎链球菌在加入CSP的0，10， 20 min这3个时相时毒力基因Phd, sIgA, lytA, nanA和ply的mRNA表达量(表3). 显示在未加入CSP时，野生菌株和基因缺陷菌株的毒力基因都有一定量的基础表达. 通过统计学分析各基因在不同菌株的不同时相的表达，结果表明：在加入CSP后10 min时，野生菌株的5个毒力基因phd, sIgA, lytA, nanA和ply的表达量都有不同程度的增加（P0.05），而各基因缺陷菌株无此现象. 相对于野生菌株，基因缺陷菌株comE-和comX-菌株的毒力基因ply的表达量都明显下降（P0.05），而其它毒力基因的表达无显著差别. 而comX2-菌株的毒力基因sIgA的表达量显著升高（P0.05）. 相对于comX-菌株，comX1-和comX2-菌株的毒力基因ply表达量显著增加（P0.05）；comX1-菌株的毒力基因nanA表达量显著增加（P0.05），comX2-菌株的毒力基因sIgA表达量显著增加（P0.05），其它毒力基因的表达量无显著差异.表3肺炎链球菌株毒力基因加入CSP后mRNA表达量（略）aP0.05 vs wt菌株; cP0.05 vs comX-菌株; eP0.05 vs相应菌株的0 min.3讨论我们研究表明，野生菌株在诱导形成感受态发生转化的过程中，五个毒力基因的表达水平与细菌感受态的发生一致，而基因comE和comX缺陷后，菌株不能发生转化，各毒力基因在CSP诱导的各时间段的表达无显著性差异，提示这些毒力基因的表达受到基因comE和comX的调控，这表明细菌的转化对于细菌毒力表达是有帮助的.基因comX在肺炎链球菌的基因组中有两个拷贝，comX1和comX2，Lee等4研究显示两个comX基因只需其中一个就能满足细菌的转化发生，因此我们同时进行了该基因单拷贝缺陷菌株（comX1-和comX2-）的毒力基因表达的研究. 实验结果显示，comX全基因缺陷之后，与基因comE缺陷后一样，菌株的ply基因表达显著下降，而菌株comX1-和comX2-的基因ply表达都较菌株comX-显著升高，而与野生菌株的ply基因表达无显著差异，这表明comX基因对细菌毒力基因ply的影响可能是通过comE这条与转化相关的通路实现的，当基因comX其中一个拷贝被缺陷后，菌株仍可通过comE诱导另一个基因comX拷贝的表达，从而诱导ply基因的表达. 毒力基因的表达分析显示，菌株comX1-的ply, phd和sIgA基因及菌株comX2-的lytA, nanA和sIgA基因都在加入CSP诱导10或20 min后表达有所增加，与细菌形成感受态发生转化的规律一致. 从整体水平上讲comX基因缺陷后菌株的毒力与野生菌株的毒力并没有显著差异，与comE基因缺陷后的效果一样. 这可能是由于comX基因只影响了众多毒力基因中的几个基因的表达，不一定能在整体水平上改变细菌的毒力. Luo等7的研究显示肺炎链球菌的comX仅仅只是细菌转化相关的因子，只启动与转化相关的一些基因的表达. 而本研究结果显示comX基因不仅与细菌转化相关，也与细菌毒力的表达相关.【参考文献】 1 MortierBarriere I, de Saizieu A, Claverys JP, et al. Competencespecific induction of recA is required for full recombination proficiency during transformation in Streptococcus pneumoniaeJ. Mol Microbiol, 1998, 27(1):159-170.2 Bartilson M, Marra A, Christine J, et al. Differential fluorescence induction reveals Streptococcus pneumoniae loci regulated by competence stimulatory peptideJ. Mol Microbiol, 2001; 39(1): 126-135.3 Zhang XM, Yin YB, Zhu D, et al. The Effect of Transformation on the Virulence of Streptococcus pneumoniaeJ. J Microbiol, 2005, 43(4): 337-344.4 Lee MS, Morrison DA. Identification of a new regulator in streptococcus pneumoniae linking quorum sensing to competence for genetic transformationJ. J Bacteriol, 1999, 181(16): 5004-5016.5 Sung CK and Morrison DA. Two distinct functions of comW in stabilization and activation of the alternative sigma factor comX in Streptococcus pneumoniaeJ. J Bacteriol, 2005, 187(9):3052-3061.6 Zwijnenburg PJ, Van der Poll T, Florquin S, et