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组氨酸脱羧酶mRNA在小鼠三叉神经节中的表达 作者：李明凯罗晓星张金山吕葆真胡静谢建军 【关键词】 三叉神经节 关键词: 组氨酸脱羧酶;三叉神经节;原位杂交;小鼠 摘 要:目的 观察组氨酸脱羧酶（Histidine decarboxylase，HDC）mRNA在小鼠三叉神经节中的表达. 方法 应用原位杂交组织化学技术和不同浓度地高辛标记的寡核苷酸探针检测小鼠三叉神经节中HDC mRNA的表达. 结果 在小鼠三叉神经节的周边部有密集的HDC阳性神经元，而在中间区域仅见散在的HDC阳性神经元.HDC主要位于大、中型细胞的胞质内，且杂交信号随探针浓度的增加而增强. 结论 由于HDC能催化组氨酸脱羧基形成组胺，提示组胺可在三叉神经节细胞的胞质内合成，与降钙素基因相关肽（CGRP）、P物质（SP）等神经递质共存.合成的组胺在三叉神经支配其效应器过程中和CGRP，SP等神经递质的释放过程中可能发挥重要作用. Keywords:histidine decarboxylase;trigeminal ganglion;in situ hybridization;mice Abstract:AIM To study the expression of histidine decar-boxylase mRNA in mouse trigeminal ganglia.METHODS Using in situ hybridization histochemistry together with spe-cific oligonucleotide probe，we detected the histidine decar-boxylase mRNA hybridization signals in the trigeminal ganglia.RESULTS Histidine decarboxylase mRNA hybridiza-tion signals was strong in the peripheral area of the trigeminal ganglia，while some scattered positive cells were also detect-ed in central area.The positive signals were mainly confined to two subpopulation of neurons:large cells and middle cells.CONCLUSION Histidinedecarboxylase is the only enzyme which catalyzes histidine into histamine，so it is regarded as the marker of the histaminergic cell.Therefore，histamine may be synthesized in the trigeminal ganglia and modulates other important neurotransmissions such as CGRP，SP，NPY，participates the normal physiological processes. 0 引言 组氨酸脱羧酶为一种分子质量110125ku的蛋白质，由两个相同的亚单位组成.利用cDNA技术，已将大鼠胎肝的组氨酸脱羧酶（Histidine decar-boxylase，HDC）克隆化，确定了完整的氨基酸顺序，包括有655个氨基酸残基.该酶以磷酸吡哆醛为辅酶，使组氨酸脱羧基形成组胺.从大鼠胎肝、人嗜碱粒细胞、人类肥大细胞、小鼠肥大细胞瘤等细胞1-3 中提纯的HDC都有相似的催化活性.用外周组织HDC制备的抗体和抗血清能特异识别脑内的HDC，说明不同组织HDC的结构是相似的，可以HDC作为标记物对组胺能神经元进行定位.从20世纪80年代起，用免疫组织化学技术和原位杂交技术，成功的将组胺及HDC在细胞水平进行精确定位，发现脑内有完整的组胺能神经系统存在，主要集中在下丘脑的结节乳头核，并广泛投射到各个脑区，如沿脑的基底部上行支配内侧隔区、嗅结节和嗅球等;向下投射到中央灰质、黑质、蓝斑中缝核群，发挥着重要的生理功能4 .而组胺在外周神经系统中的表达尚未见报道.我们用原位杂交组织化学技术，对HDC mRNA在小鼠三叉神经节中的表达进行了检测. 1 材料和方法 1.1 材料 昆明小鼠10只，雌雄不限，体质量2025g.用戊巴比妥钠40mg・kg-1 腹腔麻醉后经心灌注生理盐水50mL，再灌40g・L-1 多聚甲醛50mL，灌流10min后立即取三叉神经节，用40g・L-1 多聚甲醛固定46h，再入150g・L-1 蔗糖的0.1mol・L-1 PBS中4过夜，将三叉神经节作纵向冰冻切片，片厚1015m，切片贴于经明胶处理的载玻片上，置-20冰箱保存备用. 1.2 方法 1.2.1 寡核苷酸探针的制备与标记 所用寡核苷酸探针由大连宝生物公司合成，含有38个碱基，序列如下:5GCT GGA ATA CTC ATG TTA CCT ATT TAG TCC CTG GCT AG3，合成的探针用地高辛5末端标记，置-20冰箱保存备用. 1.2.2 HE染色和原位杂交组织化学程序 部分切片作常规HE染色，以便对实验结果进行定位;部分切片快速干燥后，在40g・L-1 多聚甲醛中固定30min，然后用0.1mol・L-1 磷酸盐缓冲液冲洗及杂交前处理液（20g・L-1 醋酸，0.1mol・L-1 PBS-G液，0.4g・L-1 PBS-T液，10mg・L -1 蛋白酶K，15g・L-1 三乙醇胺和2.5g・L-1 乙酸酐）处理.用寡核苷酸探针杂交液稀释探针至2.0和4.5mg・L-1 后分别滴加到不同切片表面，湿环境中43孵育16h.杂交后用2SSC，20mg・L-1 RNASeA及1SSC，0.05mol・L-1 PBS漂洗后，用碱性磷酸酶标记抗地高辛抗体Fab片段的11000稀释液（10g・L-1 BSA，4g・L-1 TritonX-100，0.05mol・L-1 PBS，pH7.2）室温孵育4h.用TSM1和TSM2漂洗后用NBT/BCIP室温避光4h显色.0.05mol・L-1 PBS漂洗后用核固红复染，经脱水、透明，用中性树胶封片，在光镜下观察结果;部分切片用于对照实验. 1.2.3 对照实验 对照实验的切片:用RNA酶进行预处理后杂交;用不含探针的杂交液进行杂交，结果未发现阳性标记探针神经元，说明所用探针能特异地与组织内HDC mRNA进行杂交. 2 结果 三叉神经节经HE染色后，发现大、中型细胞于神经节的周边部较为密集（Fig1）.镜下观察原位杂交实验结果，发现在小鼠三叉神经节的周边部（带*区）有密集的HDC阳性神经元，呈淡蓝色，而在中间区域仅见散在的HDC阳性神经元（Fig2），HDC主要位于大、中型细胞的胞质内（细胞表面染色颗粒密度大于5倍以上为阳性细胞，大、中、小型细胞的划分 标准为:小于25m为小型细胞;2535m为中型细胞;大于35m为大型细胞）.杂交信号随探针浓度的增加而增强，探针浓度为2.0mg・L-1 时胞质染色较浅呈淡蓝色，而浓度为4.5mg・L-1 时胞质呈深蓝色（Fig3，4）.胞体染色形态较为不同，有的胞核部位不着色呈现较大的空白区域，胞质周边部呈阳性;有的胞质内染色致密且主要分布在胞核的一侧;有的近胞核处的胞质染色较深呈环状包绕在胞核周围，其余胞质区域染色较淡（Fig5），胞体染色深浅与胞体大小无关.核固红复染后可清晰分辨胞质和胞核区域，无杂交信号的胞核区域呈淡红色（Fig6）. 3 讨论 中枢神经系统中，组胺能神经参与多种脑功能的调节，如觉醒和睡眠、伤害性反应、认知和记忆、惊厥抽搐等过程中均有组胺能神经或组胺受体的参与5-7 .组胺还能调节多种神经递质的释放，例如在豚鼠离体心脏，发现组胺可抑制交感神经末梢释放去甲肾上腺素，减弱经场电压刺激引起的心肌收缩力8 ;组胺对肠系膜嗜铬细胞分泌5-羟色胺（5-HT）以及垂体细胞分泌促肾上腺皮质激素均有调节作用9，10 ;在皮肤、呼吸道等处C感觉纤维释放速激肽和CGRP的过程中，有组胺受体的介导11 ;在人的气管和离体家兔灌流肺的标本上，还观察到组胺H3 受体对乙酰胆碱、辣椒素和SP的调控作用. 很多研究表明，三叉神经节中存在多种神经递质.有关研究证实三叉神经节中有SP及CGRP阳性胞体12 ;1995年Nikolail发现猫的三叉神经节中NPY阳性胞体占神经元总数的1%左右，而NPY与NE等递质共存可调节其释放13 ;三叉神经运动核和感觉核中发现有5-HT能神经元的投射14 ;三叉神经中脑核内还发现磷酸激活的谷氨酰胺酶和小白蛋白共存及强啡肽原样和前脑啡肽原样阳性终末与它们的联系15 .我们发现小鼠三叉神经节中存在HDC阳性标记细胞，提示组胺可在小鼠三叉神经节中合成.故在三叉神经节中组胺可能和SP，CGRP，NPY，5-HT等神经递质或调质共存.组胺分泌到突触间隙后可能有以下生理功能:直接作用于血管等效应器扩张微循环，参与局部免疫和炎症反应;调控SP，CGRP，NPY，5-HT等神经递质的释放，影响其对痛觉传导，扩张血管及对结缔组织、滑膜、涎腺等的作用.此实验结果也提示组胺在外周神经系统能够合成，有关推测还需进一步实验证实. 图1 图6 略 参考文献: 1Kimihito M，Hajime T，Isao O，Hiroshi O，Kohei Y，Eiko S，Yasuo T，Joseph HB，Takehiko W，Kunio S.Induction of L-histidine decarboxylase in a human mast cell line，HMC-1J.Exp Hematol，1998;26（4）:325-331. 2Hiroshi U，Tamotsu K，Haruyuki A，Mitsuyosi U，Atsuo T，Hiroshi O，Kohei Y，Takehiko W.Expression of human histi-dine decarboxylase in Saccharomyces cerevisiae J.Biochem Mol Biol Biophys，1998;2（2）:141-146. 3Min S，hong Y，John H，Gordon O，Helen W，Yvette T.In-tracisternal TRH analog increases gastrin release and corpus his-tidine decarboxylase activity in rats J.Am Physiol，1999;276（4）:G901-G908. 4Tian L，Wen YQ，Li HZ，Xiong HB，Wang JJ.The excitatory effects of histamine on cerebellary cortical purkinje cells in the rat J.Shengli Xuebao（Acta Physiol Sin），1999;51（2）:219-223. 5Tillet Y，Batailler M，Panula P.Histaminergic neurons in the sleep diencephalons J.J Comp Neurol，1998;400（3）:317-333. 6Anichtchik Ov，Rinne Jo，Kalimo H.An altered histaminergic in-nervation of the substan-tianigra in Parkinsons disease J.Exp Neurol，2000;163（1）:20-30. 7Panula P，Rinne J，Kuokkanen K.Neuronal histamine deficit in Alzheimers disease J.Neuroscience，1998;82（5）:993-997. 8Roberto L，Neil CE.Histamine 3 -receptor:A new frontier in myocardial ischemia J.Exp Therap，2000;292（2）:825-830. 9Zhu Q，Si F，Xu JY，Wu YL.Effect of cimetidine against diges-tive tract tumors J.Shijie Huaren Xiaohua Zazhi（World Chin J Digestol），1998;1（2）:13-17. 10Xie JJ，Luo XX，Zhao DH.Histamine H3 receptors regulate ACTH release by AtT-20cells J.Di-si Junyi Daxue Xuebao（J Fourth Mil Med Univ），2001;22（7）:584-586. 11Abderrahim N，Annie D，Jean F，Jose S，Serge B，Pascal G.Modulatory effect of imetit，a histamine H3 receptor agonist，on C-fibers，cholinergic fibers and mast cells in rabbit lungs in vitro J.Eur J Pharmacol，1999;371（1）:23-30. 12Jiang JY，Dou HY，Gao PF，Zhu SJ，Li GZ，Yang PH.Distri-bution of CGRP neurons in the trigeminal and changes of CGRP-like immunoreactivity responding to noxious stimulation J.Jiepou Xuebao（Anatomica