白细胞介素┐2mRNA在大鼠垂体前叶的表达.doc

白细胞介素2mRNA在大鼠垂体前叶的表达 作者：韦耿泽朱运龙王高峰韩雪峰胡玉珍钟延清陈健康 【关键词】 白细胞介素-2 关键词: 白细胞介素-2;垂体前叶;逆转录-聚合酶链反应;鼠 摘 要:目的 研究白细胞介素-2（IL-2）mRNA在正常大鼠垂体前叶的表达. 方法 从正常大鼠垂体前叶组织和离体原代培养的细胞中提取总RNA，采用二步法RT-PCR技术，扩增出相应大小的DNA片段，将此片段通过凝胶电泳回收纯化后与pGEM-T easy载体连接，转染到大肠杆菌细胞内，并接种于LB培养基中培养1014h，挑选出阳性克隆进行DNA序列测定. 结果 测定的DNA与IL-2基因片段相同.因而，在正常大鼠垂体前叶组织和培养细胞中都有IL-2mRNA的表达. 结论 首次证实了IL-2不仅存在于垂体肿瘤组织中，而且在正常垂体组织中也有表达.为进一步研究神经内分泌网络学说提供了一定的理论基础. Keywords:IL-2;anterior pituitary;RT-PCR;rats Abstract:AIM To study the expression of IL-2mRNA in rat normal anterior pituitary.METHODS Total RNA was extracted from ratsnormal anterior pituitary tissues and pri-mary cultured cells in vitro.Using the two-step RT-PCR technique，we amplified a DNA fragment in comparatively the same length as that of IL-2mRNA.Through DNA a-garose gel electrophoresis，the fragment was purified and then connected with pGEM-T easy plasmid by the T4ligase.The connected plasmid was transformed into the E.coli cells. The transformed cells were planted in the Amp+LB culture medium and cultured for1014h.The positive clones were selected and then the DNA sequencing was conducted.RESULTS The DNA sequence was the same as that of the IL-2gene fragment.Therefore，there existed IL-2mRNA in ratsnormal anterior pituitary tissues and cultured cells.CONCLUSION It is proved，for the first time，that IL-2not on-ly exists in the tissues of pituitary adenoma，but is also ex-pressed in the normal pituitary tissues. 0 引言 白细胞介素-2（IL-2）对下丘脑-垂体-靶腺具有明显的调节作用.外源性IL-2既可以直接作用于垂体组织，影响垂体激素的分泌，也可以通过调节下丘脑促垂体激素的释放，间接影响垂体激素的分泌1，2 .近来发现，垂体瘤细胞在基础条件和不同的刺激条件下可以产生和分泌IL-23 ，但是正常垂体组织是否存在IL-2还未见报道.我们拟应用RT-PCR方法，从基因水平确定大鼠正常垂体前叶中是否有IL-2表达. 1 材料和方法 1.1 材料 胰蛋白酶为Difco公司产品，DMEM培养基及Trizol试剂为美国Gibco公司产品，新生小牛血清为杭州四季青生物工程材料研究所产品，反转录试剂盒、PCR反应试剂盒及pGEM-T载体为美国Promega公司产品，T4DNA连接酶为华美生物工程公司产品，感受态细胞为本校基础部生物化学和分子生物学教研室惠赠，PCR扩增仪为英国JENCONS公司产品. 1.2 大鼠垂体前叶细胞原代培养 雄性SD大鼠，体质量200250g，用10g・L-1 戊巴比妥钠（30mg・kg -1 ）腹腔麻醉后，20mL无菌生理盐水灌注，迅速浸入750mL・L-1 乙醇中510min，于无菌条件下开颅取出垂体，剔除后叶及中间叶.前叶经D-Hanks液冲洗4次后，切成小于1mm1mm1mm组织块，1.25g・L-1 胰蛋白酶37振荡（100r・min-1 ）温育30min.用吸管吹打分散细胞，将细胞悬液吸入加有完全培养液的离心管，终止消化（若消化不完全可将其余组织重复消化12次）.于200g离心10min，弃上清液后，向沉淀的细胞团滴加含100mL・L-1 小牛血清的DMEM培养液使其重悬并分散，种植于90mm2 培养皿，50mL・L-1 CO2 和37恒温培养箱中培养57d，待行总RNA的提取. 1.3 总RNA的提取 用10g・L-1 戊巴比妥钠（30mg・kg-1 ）腹腔麻醉后，100mL无菌生理盐水灌注，立即开颅显露垂体，去除后叶及中间叶.将前叶置入预先装有1mL冰预冷的Trizol液的匀浆器中，充分匀浆裂解后（上述培养57d的细胞，可直接将1mL Trizol加到培养皿中，并轻摇培养皿至显微镜观察细胞全部漂浮在液体中为止，其余步骤相同），移入1.5mL离心管中，室温静置5min，加入0.2mL氯仿，摇匀，于室温下静置15min，接着410000g离心15min，将上层水相转移至新的离心管中，加入等体积的异丙醇，摇匀，室温静置10min后，410000g离心10min，弃掉上清液，750mL・L-1 乙醇清洗1次，将RNA沉淀晾干，用20L无RNA酶水55溶解10min，-20保存待用. 1.4 两步法RTPCR反应 1.4.1 cDNA的合成 20L的cDNA合成反应体系（提取的总RNA5L，25mmol・L-1 MgCl2 4L，10反转录缓冲液2L、RNA酶抑制剂0.5L、AMV反转录酶1.5L、引物1L、其余用无RNA酶水补充至20L），在42水浴60min，沸水浴5min灭活反转录酶，4，5min使酶与cDNA分离. 1.4.2 PCR反应 取合成的cDNA模板（对照组用去离子水）1L，10PCR反应缓冲液2.5L，4dNTP混合物2L，IL-2引物（sense:5GCGCAC-CCACTTCAAGCCCT3，antisense:5CCAC-CACAGTTGCTGGCTCA3由赛百盛生物公司合成）各0.5L，Taq DNA聚合酶0.5L，去离子水补至25L，首次循环为944min，中间循环941min，6045s，721min，循环35次，末次循环7210min充分延伸. 1.5 PCR产物的鉴定 PCR产物用15g・L-1 琼脂糖凝胶电泳，得到预期大小的单一条带并回收.回收的产物与pGEM-T载体连接.连接反应体系:5L T4DNA连接酶缓冲液，1L pGEM-T载体，2L回收产物，1L T4DNA连接酶，去离子加至10L，混匀后4过夜.加入200L感受态细胞，冰浴30min后，42热休克90s，迅速冰浴23min，加0.8mL LB培养基，37培养3045min，最后接种于含 氨苄青霉素和LB的培养皿中，37培养1216h，挑选阳性克隆进行DNA序列测定. 2 结果 2.1 凝胶电泳分析 与对照组相比，大鼠垂体组织和培养细胞都有一条约350370bp的特异条带.基本与所设计引物间的片段大小相符合（Fig1）. 图1 略 2.2 DNA序列测定 将测定结果与基因文库比较，350bp片段中除有一个碱基突变外，其余和IL-2完全一致.IL-2DNA序列测定的部分结果（见Fig2）. 图2 略 2.3 IL2mRNA在大鼠垂体前叶的表达 通过电泳分析和序列测定，说明在正常大鼠垂体前叶有IL-2基因表达. 3 讨论 我们的实验结果表明，在正常大鼠垂体前叶有IL-2mRNA的表达.结合我们以前的研究，肯定大鼠垂体前叶有IL-2分布，免疫组织化学显示主要为垂体前叶分泌GH，ACTH和PRL的细胞.已经发现人垂体促皮质腺瘤和一些垂体瘤细胞系都可以表达IL-23，4 .故此基本可以认为IL-2存在于垂体组织中.但是IL-2对不同类型的垂体细胞的增殖作用不同.有人报道，IL-2抑制正常垂体细胞的增殖而促进GH3 细胞的增殖，IL-2对GH3 的增殖作用与雌激素有关5，6 .我们也发现IL-2对垂体细胞的增殖作用与性别有关（IL-2促进雌性大鼠垂体细胞的增殖，抑制雄性大鼠垂体细胞的增殖）7，8 .说明IL-2与垂体肿瘤的形成过程有一定的关系，目前具体机制还不清楚，需要进一步的研究. 加入外源性IL-2可以影响多种垂体激素的分泌.早在20世纪90年代初期，Karanth和McCann采用垂体组织块孵育方法，全面观察了IL-2对AP分泌功能的作用:IL-2刺激PRL，ACTH，TSH的基础分泌，而抑制高K+ （除极）引起的PRL分泌，明显抑制LH，FSH和GH的基础分泌1 .以后人们研究发现，在不同的刺激条件下，IL-2表现出不同的调节作用9，10 .这也许可以部分解释机体在不同的条件下，表现出不同的激素水平及不同的反应状态.IL-2除了直接影响垂体激素的分泌，还可以通过下丘脑，调节促垂体激素的释放，间接影响垂体激素的分泌11，12 .IL-2影响下丘脑激素分泌的研究主要集中在CRH和AVP.尽管现在还没有报道内源性（尤其是垂体细胞自己所分泌的）IL-2是否可以影响垂体激素的分泌4，13 ，但可以肯定的是垂体细胞能够分泌IL-2，这就说明IL-2不仅是重要的免疫因子，而且具有重要的内分泌作用.垂体细胞分泌的IL-2的作用也许主要是通过旁分泌影响周围的垂体细胞，或通过自分泌进行自身的调节4，13 . 总之，无论是垂体肿瘤细胞还是正常垂体细胞都可以表达IL-2，它们所产生的内源性IL-2可以影响垂体细胞的增殖和调节垂体激素的分泌.当外界环境发生改变后，IL-2的调节作用也会变化.IL-2也许与垂体细胞的肿瘤形成有关，这可能需要多种因素的参与. 参考文献: 1Karanth S，McCann SM.Anterior pituitary hormone control by interleukin-2J.Proc Natl Acad Sci USA，1991;88:2961-2965. 2Karanth S，Aguila MC，McCann SM.The influence of inter-leukin-2on the release of somatostatin and growth hormone-re-leasing hormone by mediobasal hypothalamus J.Neuroen-docrinology，1993;58:185-190. 3Arzt E，Stelzer G，Renner U，Lange M，Muller OA，Stalla GK.Interleukin-2and interleukin-2receptor expression in hu-man corticotropic adenoma and murine pituitary cell cultures J.J Clin Invest，1992;90:1944-1951. 4Arzt E，Paez Pereda M，Costas M，Sauer J，Renner U，Hols-boer F，Stalla GK.Cytokine expression and molecular mecha-nisms of their auto/paracrine regulation of anterior pituitary function and growth J.Ann N YAcad Sci，1998;840:525-531. 5Arzt E，Buric R，Stelzer G，Stalla J，Sauer J，Renner U，Stalla GK.Interleukin involvement in anterior pituitary cell growth regulation:Effect of IL-2and IL-6J.Endocrinology，1993;132:459-467. 6Newton CJ，Arzt E，Stalla GK.Involvement of the estrogen re-ceptor in the growth response of pituitary tumor cells to inter-leukin-2J.Biochem Biophy Res Commun，1994;205:1930-1937. 7Wang GF，Zhu YL，Hu YZ，Zhang WH.Effect of interleukin-2on the proliferation of cultured rat anterior pituitary cells J.Shengli Xuebao（Acta Physiol Sinica），1997;13:129-136. 8Wang GF，Zhu YL，Chen JK，Zhang WH，Zhong YQ，HU YZ，Wang FZ.Interleukin-2stimulates the proliferation of cultured RC-4B/C pituitary adenoma cell line J.Shengli Xuebao（Acta Physiol Sinica），2000;52（3）:188-192. 9Braden TD，Fry C，Sartin JL.Effects of interleukins on secre-tion of luteinizing hormone from ovine pituitary cells J.Am J Vet Res，1998;59（11）:148